楊 琳，于 靜，楊繼章，劉愛霞，張彥景，劉 琰，王玲嬌△

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北 石家莊 050031； 2.清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院·清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院臨床藥物試驗(yàn)中心，北京 100084； 3.河北省邯鄲市第四醫(yī)院，河北 邯鄲 056200）

金卷升板膠囊是依據(jù)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院協(xié)定處方制成的院內(nèi)制劑，擬申報(bào)注冊(cè)，主治原發(fā)性免疫性血小板減少癥。由黃芩、茜草、白術(shù)、紫草、地錦草、卷柏、山藥、大黃、金銀花等10味中藥材組方，具有清熱解毒、涼血止血、通經(jīng)止血、升血小板等功效［1］。中藥復(fù)方的療效通過多種有效成分間的共同作用，通過多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多步驟共同發(fā)揮作用，與血小板減少癥多因素的致病機(jī)制切合，故采用中藥治療血小板減少癥越來越受到重視。以往研究集中于金卷升板膠囊的臨床前研究［2-6］，本研究中基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討其治療血小板減少癥的作用機(jī)制，為臨床研究提供理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分與靶點(diǎn)收集

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP），https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php/）檢索金卷升板膠囊中黃芩、茜草、白術(shù)、紫草、地錦草、卷柏、山藥、大黃、金銀花的化學(xué)成分，篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%且藥物相似性（DL）≥0.18。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得金卷升板膠囊中每個(gè)成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白，導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），獲取每個(gè)靶蛋白所對(duì)應(yīng)的靶基因，合并去重。采用Cytoscape 3.9.1軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，即為金卷升板膠囊的潛在作用靶點(diǎn)。

1.2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以Thrombopenia 為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：// www.genecards.org/）中檢索及篩選靶點(diǎn)基因，得到血小板減少癥的疾病靶點(diǎn)，利用Venny 2.1 平臺(tái)與金卷升板膠囊的潛在作用靶點(diǎn)取交集，獲得金卷升板膠囊治療血小板減少癥的共有靶點(diǎn)，保留對(duì)靶點(diǎn)集具有調(diào)控作用的化學(xué)成分，作為金卷升板膠囊治療血小板減少癥的活性成分。將活性成分和共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，構(gòu)建金卷升板膠囊治療血小板減少癥的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 基因本體論（GO）功能分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/ gp/ index.html#/ main/ step1），對(duì)靶點(diǎn)的GO 功能及KEGG 通路進(jìn)行富集分析。以P< 0.05 為篩選條件，獲得金卷升板膠囊治療血小板減少癥的GO 與KEGG富集分析結(jié)果。

1.4 蛋白-蛋白相互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共有靶點(diǎn)上傳至String 數(shù)據(jù)庫（https：// string -db.org/），選擇物種為人類，設(shè)置confidence > 0.7，獲得靶點(diǎn)間的互作關(guān)系，得到金卷升板膠囊治療血小板減少癥的PPI網(wǎng)絡(luò)，并確定金卷升板膠囊治療血小板減少癥的前30個(gè)核心靶點(diǎn)。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

通過分子對(duì)接技術(shù)分析金卷升板膠囊關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用。選擇網(wǎng)絡(luò)中篩選出的重要化合物和核心靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的分子對(duì)接分析。通過UniProt數(shù)據(jù)庫查找所選基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)。對(duì)應(yīng)蛋白的三維結(jié)構(gòu)通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：// www.rcsb.org/）進(jìn)行下載，配體分子的結(jié)構(gòu)通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行下載，并借助ChemDrew 3D 軟件進(jìn)行能量最小化處理和輸出三維結(jié)構(gòu)［7］。利用Autodock Vina 軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行脫水、加氫、電荷計(jì)算等。設(shè)置小分子配體結(jié)合的活性口袋位點(diǎn)為受體蛋白對(duì)接位點(diǎn)。利用Autodock Vina 軟件將所選受體蛋白與金卷升板膠囊活性成分的小分子配體進(jìn)行分子對(duì)接，并用PyMOL 2.5.0軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及靶點(diǎn)

對(duì)TCMSP 數(shù)據(jù)庫中金卷升板膠囊所有化學(xué)成分及其相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，按OB ≥30%和DL ≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)篩選，共獲得化學(xué)成分94個(gè)；化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的藥物作用靶點(diǎn)經(jīng)去重后獲得236個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。詳見圖1。

圖1 金卷升板膠囊的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Component - target network of Jinjuan Shengban Capsules

2.2 藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫收集到血小板減少癥相關(guān)靶點(diǎn)4 356 個(gè)，利用Venny 2.1 平臺(tái)將金卷升板膠囊成分的潛在作用靶點(diǎn)與血小板減少癥疾病靶點(diǎn)取交集，共獲得159個(gè)共有靶點(diǎn)，詳見圖2。將金卷升板膠囊的化學(xué)成分與共有靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，獲得88個(gè)對(duì)靶點(diǎn)具有潛在作用的活性成分，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖3）。對(duì)活性成分進(jìn)行拓?fù)浞治?，度值排名? 位的分別為槲皮素（度值226）、山柰酚（度值72）和β-谷甾醇（度值64）。

圖2 藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)維恩圖Fig.2 Venn diagram of active ingredients - disease targets

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)

將金卷升板膠囊的抗血小板減少癥靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建基因靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖4）。節(jié)點(diǎn)度值越高，表明靶點(diǎn)間的相關(guān)性越好。選擇度值排名前30的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，詳見圖5。

圖4 金卷升板膠囊治療血小板減少癥基因靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of gene targets of Jinjuan Shengban Capsules in the treatment of thrombopenia

圖5 金卷升板膠囊治療血小板減少癥度值排名前30的核心靶點(diǎn)Fig.5 Top 30 key targets of Jinjuan Shengban Capsules in the treatment of thrombocytopenia in terms of degree values

2.4 GO 功能富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)159個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，以P<0.05為篩選條件，并根據(jù)其P值的順序列出前20條結(jié)果（圖6）。結(jié)果顯示，金卷升板膠囊治療血小板減少癥與對(duì)無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、對(duì)激素的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞遷移的正調(diào)節(jié)等過程有關(guān)。

圖6 金卷升板膠囊治療血小板減少癥的GO功能富集分析結(jié)果Fig.6 GO enrichment analysis results of Jinjuan Shengban Capsules in the treatment of thrombopenia

2.5 KEGG 通路富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)159個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選條件，并根據(jù)其P值的順序列出前20 條（圖7 至圖9）。結(jié)果顯示，金卷升板膠囊治療血小板減少癥主要涉及癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物的多配體受體（AGE-RAGE）信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路等。

圖7 金卷升板膠囊治療血小板減少癥的KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis results of Jinjuan Shengban Capsules in the treatment of thrombocytopenia

注：紅色的節(jié)點(diǎn)代表金卷升板膠囊治療血小板減少相關(guān)的靶點(diǎn)。圖9同。圖8 KEGG通路富集分析中癌癥通路Note：the red nodes refers to the targets related to Jinjuan Shengban Capsules in the treatment of thrombocytopenia（for Fig.8 - 9）.Fig.8 Cancer pathway in KEGG pathway enrichment analysis

圖9 KEGG通路富集分析中脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路Fig.9 Lipids and atherosclerosis signaling pathways in KEGG pathway enrichment analysis

2.6 活性化合物和關(guān)鍵蛋白的分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇3個(gè)重要化合物，以及度值排前3 位的靶點(diǎn)TP53，AKT1，JUN 作為核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接分析。分子對(duì)接結(jié)果表明，槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇與TP53，AKT1，JUN 的最小結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，結(jié)合力良好。詳見圖10至圖11。

圖10 藥物活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果熱圖Fig.10 Heat map of molecular docking results of active ingredients and key targets

A1.TP53 - 槲皮素 A2.TP53 - 山柰酚 A3.TP53 - β - 谷甾醇 B1.AKT1 - 槲皮素 B2.AKT1 - 山柰酚 B3.AKT1 - β - 谷甾醇 C1.JUN - 槲皮素 C2.JUN - 山柰酚 C3.JUN - β - 谷甾醇圖11 藥物活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接構(gòu)象圖A1.TP53 - quercetin A2.TP53 - kaempferol A3.TP53 - β - sitosterol B1.AKT1 - quercetin B2.AKT1 - kaempferol B3.AKT1 - β - sitosterol C1.JUN - quercetin C2.JUN - kaempferol C3.JUN - β - sitosterolFig.11 Conformational map of molecular docking of active ingredients and key targets

3 討論

金卷升板膠囊方中，金銀花為君藥，具有涼血化瘀、解熱止血、調(diào)節(jié)免疫等功效；黃芩為臣藥，具有凝血排毒、調(diào)節(jié)免疫等功效；地錦草為佐藥，具有涼血散血、解毒止痢等功效。金卷升板膠囊能解毒散瘀、清熱涼血、止血通絡(luò)，主治各種血小板減少癥［8-10］。

本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討了金卷升板膠囊治療血小板減少癥的有效活性成分、核心作用靶點(diǎn)與潛在作用機(jī)制。共獲得88 個(gè)金卷升板膠囊治療血小板減少癥的活性成分，其中度值排序前3 位的為槲皮素、山柰酚和β- 谷甾醇。梁明露［11］研究認(rèn)為，槲皮素可能通過抑制磷脂酰肌醇- 3 - 激酶- 絲氨酸- 蘇氨酸蛋白激酶B - 糖原合成酶激酶3β（PI3K - AKT - GSK3β）、絲裂原激活蛋白激酶-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1 / 2（MAPK - ERK1 / 2）、脾酪氨酸激酶- 磷脂酶Cγ2（Syk - PLCγ2）通路，抑制血小板的聚集、釋放、黏附和擴(kuò)展，從而發(fā)揮抗血小板作用。山柰酚具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用。β- 谷甾醇能調(diào)節(jié)免疫失衡，降低炎性因子水平［12］。為明確共有靶點(diǎn)間的相互作用，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯Y選出了前30 個(gè)基因靶點(diǎn)。其中，AKT1在血小板激活通路中發(fā)揮重要作用，可對(duì)血小板活化產(chǎn)生影響［13］。JUN 是異二聚體轉(zhuǎn)錄因子AP - 1 的主要組成部分，也是細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。各種生長因子、細(xì)胞因子和應(yīng)激刺激c - JUN 的激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)生物過程。任曉梅等［14］研究發(fā)現(xiàn)，JUN基因?qū)ρ“鍦p少癥的病情進(jìn)展具有預(yù)測能力，可能通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路而發(fā)揮生物學(xué)作用。黃偉等［15］研究認(rèn)為，TP53 可能是治療血小板減少癥的關(guān)鍵基因。因此，選擇這3 個(gè)基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。

通過GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，金卷升板膠囊對(duì)血小板減少癥的治療作用與對(duì)無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、對(duì)激素的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞遷移的正調(diào)節(jié)等過程有關(guān)。通過KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，金卷升板膠囊治療血小板減少癥的靶點(diǎn)顯著富集于癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路，顯示金卷升板膠囊通過以上多個(gè)通路來發(fā)揮治療血小板減少癥的作用。其中，抗癌通路中的PI3K/ AKT 信號(hào)通路可抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步推測其通過此通路來調(diào)控B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞的增殖、凋亡、分化，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量與功能的平衡，影響相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素10、轉(zhuǎn)化生長因子-β1的分泌，以減少抗血小板自身抗體的產(chǎn)生。研究顯示，PI3KAKT 通路通過調(diào)節(jié)血小板自噬能力而發(fā)揮血小板保護(hù)作用［16］。前列腺素可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT磷酸化來抑制血小板的活化和聚集，從而改善血小板減少癥患者出現(xiàn)的前列腺素水平升高和血小板活化聚集度降低［17］。AGE-RAGE 信號(hào)通路與血管損傷和炎性反應(yīng)有關(guān)，該信號(hào)通路中的炎性因子TNF 和白細(xì)胞介素18與血管損傷有關(guān)。而炎性因子可被認(rèn)為是血小板減少癥中血小板活化和免疫失衡的誘導(dǎo)劑［18-19］。分子對(duì)接結(jié)果表明，金卷升板膠囊中槲皮素、山柰酚和β- 谷甾醇與TP53，AKT1，JUN 這3 個(gè)靶蛋白的親和力較強(qiáng)，可認(rèn)為其構(gòu)象穩(wěn)定，并具有結(jié)合活性，但其結(jié)果的可靠性還需深入研究，并佐以生物實(shí)驗(yàn)回證。

本研究中初步探討了金卷升板膠囊治療血小板減少癥的作用機(jī)制，并為其臨床研究提供了理論依據(jù)。但存在一定局限性，研究使用的數(shù)據(jù)庫內(nèi)容及軟件功能還不全面，有待補(bǔ)充及完善。利用計(jì)算機(jī)模擬分子間的相互結(jié)合來驗(yàn)證藥物活性成分作用的可靠性也需與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)合來作進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，金卷升板膠囊可能是通過槲皮素、山柰酚、β- 谷甾醇等關(guān)鍵活性成分，作用于TP53，AKT1，JUN 等潛在核心靶點(diǎn)，調(diào)控癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路等，從而發(fā)揮治療血小板減少癥的作用。