魏丹丹汪麗婷龍 潔陳艷焦王 宇楊永清徐玉東*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 201203;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030)

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥為主要病理特征的復(fù)雜、異質(zhì)性疾病,臨床表現(xiàn)為發(fā)作性咳嗽、氣促、胸悶,以及伴有哮鳴音的呼氣性呼吸困難。重度哮喘(severe asthma,SA)在確診哮喘和控制合并癥的基礎(chǔ)上,需要使用大劑量吸入性皮質(zhì)類固醇激素(corticosteroids,CS),并聯(lián)合控制藥物(如長(zhǎng)效β2 受體激動(dòng)劑、白三烯調(diào)節(jié)劑或茶堿),且/或過(guò)去1 年中有≥50%的時(shí)間需使用全身性CS 控制,或者采用以上治療癥狀仍不可控。與輕中度哮喘患者相比,SA 患者誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞數(shù)量升高更為明顯,氣道重塑病理變化更加顯著[1]。SA 雖然只占全部哮喘人數(shù)的5%~10%,卻是哮喘致殘、致死的主要原因[2]。SA的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)成為目前哮喘研究的熱點(diǎn)之一。

建立一種穩(wěn)定、可復(fù)制、便捷,并且能夠重現(xiàn)人類SA 臨床表型和主要病理特征的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,對(duì)于研究SA 的發(fā)病機(jī)制、藥物治療和預(yù)防具有重要意義。本文以“重癥哮喘/重度哮喘/難治性哮喘/激素抵抗型哮喘/激素不敏感型哮喘”為關(guān)鍵詞,檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、PubMed 等文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的近十年來(lái)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表動(dòng)物實(shí)驗(yàn)類研究,將從動(dòng)物選擇、模型制備方法、病理表型等方面對(duì)最近十年來(lái)SA 模型的構(gòu)建方法與特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)和分析,為基于SA 動(dòng)物模型開(kāi)展的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。

1 重度哮喘模型常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

目前SA 模型常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物既有小鼠、大鼠[3]、豚鼠[4]、兔等,也有研究使用大型動(dòng)物馬進(jìn)行建模。對(duì)近十年的SA 動(dòng)物模型文獻(xiàn)中動(dòng)物種屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)顯示小鼠使用率高達(dá)90%,說(shuō)明小鼠是SA研究最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。小鼠容易誘發(fā)氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性(airway hyperreactivity,AHR)、氣道黏液高分泌等病理變化,因此更適合用于構(gòu)建哮喘模型。其中,尤以BALB/c 品系小鼠最常使用,更容易誘發(fā)出明顯的氣道炎癥和AHR,其造模成功率較高[5],其次為C57BL/6(包括C57BL/6J 和C57BL/6 N)、A/J 品系,其中A/J 小鼠易感哮喘,而且對(duì)致敏劑的反應(yīng)也很強(qiáng)。

由于小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育較快,在4~6 周時(shí)身體各個(gè)器官已逐漸成熟,6~8 周即可達(dá)到性成熟,所以一般實(shí)驗(yàn)研究選擇正值青壯年的6~8 周小鼠。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌部蛇x擇不同周齡的小鼠,有研究者利用10~14 周齡小鼠構(gòu)建SA 模型,探索SA 的慢性高炎癥負(fù)荷對(duì)恐懼行為和大腦神經(jīng)免疫通路的影響[6]。此外,有研究使用屋塵螨(house dust mite,HDM)誘導(dǎo)BALB/c 小鼠構(gòu)建過(guò)敏性哮喘模型,發(fā)現(xiàn)雌性小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量以及血清HDM 特異性IgE 水平均顯著高于雄性小鼠,但在C57BL/6NJ 小鼠BALF中,雄性小鼠嗜酸性粒細(xì)胞的積累高于雌性小鼠;不僅如此,不同性別、品系的小鼠哮喘模型肺細(xì)胞因子表達(dá)也存在差異,比如雌性BALB/c 小鼠相較于雄鼠更趨向于Th17 細(xì)胞免疫反應(yīng),IL-17A 表達(dá)水平更高,而C57BL/6NJ 雌性小鼠哮喘模型的肺中Th1 細(xì)胞因子變化更為明顯[7]。

2 重度哮喘模型的制備方法

2.1 過(guò)敏原的選擇

用于制備SA 動(dòng)物模型的過(guò)敏原主要可分為以下幾類:(1)環(huán)境過(guò)敏原:包括HDM、蟑螂提取物(cockroach, CRA)、二氧化氮(NO2)等;(2)病原體過(guò)敏原:包括轉(zhuǎn)錄腺病毒[8]、流感病毒H3N2[9]、衣原體、 流 感 嗜 血 桿 菌[10]、 呼 吸 道 合 胞 病 毒(respiratory syncytial virus,RSV)等;(3)化合物過(guò)敏原:包括卵清蛋白(ovalbumin,OVA)、三硝基苯(trinitro phenyl, TNP)[11]、 對(duì) 甲 苯 二 異 氰 酸 酯(toluene diisocyanate,TDI)[12]等。對(duì)近十年來(lái)SA模型文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示,約51%的研究選用OVA 作為造模的過(guò)敏原、約42%的研究選用HDM作為造模的過(guò)敏原。目前,最常用的過(guò)敏原是OVA和HDM,其中,OVA 是動(dòng)物哮喘模型應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典過(guò)敏原。HDM 是哮喘患者中最易接觸到的環(huán)境過(guò)敏原之一,臨床哮喘患者對(duì)其過(guò)敏率高達(dá)85%,使用HDM 誘導(dǎo)SA 模型可以更好地模擬人類哮喘的發(fā)生過(guò)程。

2.1.1 單一過(guò)敏原造模

指只使用一種過(guò)敏原制備SA 動(dòng)物模型的造模方法。有研究者認(rèn)為白介素IL-13(interleukin,IL-13)主要介導(dǎo)哮喘炎癥反應(yīng),使用含有小鼠IL-13 基因的腺病毒顆粒作為單一過(guò)敏原,發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)出具有氣道炎癥、AHR 和粘液分泌、中性粒細(xì)胞增多、類固醇激素抵抗(steroids-resistant)等特征的動(dòng)物模型[8]。此外,化合物TDI 常用于制造泡沫塑料及橡膠、絕緣漆等,是職業(yè)哮喘發(fā)病常見(jiàn)過(guò)敏原。有研究者發(fā)現(xiàn)獲得職業(yè)哮喘的患者通常對(duì)CS 治療反應(yīng)差,因此將TDI 作為單一過(guò)敏原進(jìn)行小鼠致敏發(fā)現(xiàn)能夠顯著誘發(fā)產(chǎn)生Th2 和Th17 反應(yīng)以及激素抵抗[12]。

2.1.2 復(fù)合過(guò)敏原造模

指使用兩種及兩種以上過(guò)敏原制備SA 動(dòng)物模型的造模方法。復(fù)合過(guò)敏原多以O(shè)VA 和/或HDM聯(lián)合其他過(guò)敏原,如OVA+NO2[13]、HDM+流感病毒H3N2[9]、OVA+衣原體、流感嗜血桿菌[10]、OVA+TNP[11]、OVA+HDM+CRA[14]等。有研究者通過(guò)OVA 聯(lián)合衣原體、流感嗜血桿菌誘導(dǎo)小鼠發(fā)現(xiàn),感染病菌能夠抑制嗜酸性粒細(xì)胞,但不能抑制AHR,BALF 中性粒細(xì)胞有明顯升高,使用CS 治療后氣道炎癥和AHR 未改善,提示使用病菌復(fù)合過(guò)敏原可以誘導(dǎo)類固醇激素抵抗性哮喘(steroids-resistant asthma)模型[10]。除病菌以外,常用的OVA 和HDM也可以聯(lián)合使用作為復(fù)合過(guò)敏原。有研究者使用OVA+CRA+HDM 多重過(guò)敏原對(duì)小鼠腹腔致敏及滴鼻激發(fā),與使用單一過(guò)敏原相比,復(fù)合過(guò)敏原更易誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生激素抵抗[14]。

2.1.3 單一過(guò)敏原和復(fù)合過(guò)敏原的比較

使用單一過(guò)敏原造模的優(yōu)點(diǎn)在于方法簡(jiǎn)單、造模時(shí)間短、成本低,但如IL-13 腺病毒、TDI 作為動(dòng)物造模的過(guò)敏原并不常用;使用復(fù)合過(guò)敏原的優(yōu)點(diǎn)在于造模成功率高,更易產(chǎn)生SA,而且復(fù)合過(guò)敏原能夠更好的模擬臨床復(fù)雜的環(huán)境-免疫的交互作用,但復(fù)合過(guò)敏原造模流程相對(duì)復(fù)雜、造模時(shí)間長(zhǎng)、成本高。此外,對(duì)過(guò)敏原類型的選擇也和實(shí)驗(yàn)研究目的密切相關(guān),比如TDI 誘導(dǎo)的SA 模型,除了誘發(fā)Th2 細(xì)胞炎癥反應(yīng)以外,還能夠產(chǎn)生顯著的Th17 炎癥反應(yīng),用于探索Th17 細(xì)胞在SA 發(fā)病中的作用與機(jī)制[12];OVA+HDM 等可以構(gòu)建高Th2 型嗜酸粒細(xì)胞的SA 模型[14];HDM+LPS 被用于構(gòu)建低Th2 型和高中性粒細(xì)胞的SA 模型[15]。

2.2 常見(jiàn)佐劑及其選擇

2.2.1 常見(jiàn)佐劑

佐劑是一類能夠改變免疫應(yīng)答類型、發(fā)揮輔助作用的非特異性物質(zhì)。目前,臨床上使用最多的佐劑為鋁佐劑,包括氫氧化鋁(Al(OH)3)和磷酸鋁等。研究表明,鋁佐劑可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫,還能夠促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的募集和活化、釋放細(xì)胞因子及其他介質(zhì)誘發(fā)炎癥反應(yīng)[16],因此在SA 造模中常配合使用鋁佐劑加強(qiáng)過(guò)敏原的致敏效果。

完全弗式佐劑(complete Freund’ s adjuvant,CFA)屬于油乳類佐劑,可誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng),增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答能力。在SA 模型中CFA 常和HDM 配合使用誘導(dǎo)增強(qiáng)免疫反應(yīng)。有研究應(yīng)用HDM/CFA(1 μg/μL,100 μL)皮下注射致敏小鼠,14 d 后使用HDM(5 μg/μL,20 μL)激發(fā),模型小鼠的肺部中性粒細(xì)胞顯著增多并表現(xiàn)出激素抵抗等特征[17]。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)屬于陰離子脂質(zhì)佐劑,是革蘭氏陰性菌獨(dú)特的病原相關(guān)分子模式,LPS 可持續(xù)釋放到環(huán)境中并且顯著污染室內(nèi)灰塵,是哮喘嚴(yán)重程度的增強(qiáng)因素[18]。有研究者采用LPS 作為佐劑聯(lián)合OVA 建立SA 模型,發(fā)現(xiàn)該模型氣道炎癥以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主[3]。有學(xué)者給予小鼠模型不同劑量LPS(1 μg 或10 μg),發(fā)現(xiàn)OVA聯(lián)合高劑量的LPS 更易建立高中性粒細(xì)胞的SA 哮喘模型,該模型對(duì)CS 的治療無(wú)效[19]。

環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)屬于核酸類佐劑,存在于多種導(dǎo)致SA 的感染細(xì)菌中,cdi-GMP 已被證明是一種有效的粘膜佐劑,可誘導(dǎo)Th1/Th17 反應(yīng)并伴有低 Th2 反應(yīng)[20]。有研究者使用HDM 和c-di-GMP 致敏小鼠,隨后用HDM 和低劑量的c-di-GMP 激發(fā),可以成功誘導(dǎo)出小鼠的AHR,且明顯高于單獨(dú)使用HDM 誘導(dǎo)的小鼠模型,此外該模型也表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞顯著增多[21]。

2.2.2 佐劑的選擇

佐劑的使用可以提高免疫應(yīng)答作用,但同時(shí)佐劑的使用離不開(kāi)過(guò)敏原的屬性,常見(jiàn)SA 造模多使用OVA+Al(OH)3、HDM+CFA 或HDM+LPS 等方式。鋁佐劑和OVA 通常使用腹腔/皮下注射致敏的方式,在體內(nèi)誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞分化,可增強(qiáng)OVA 的免疫原性。LPS 同樣為環(huán)境中的過(guò)敏原,多配合HDM 進(jìn)行滴鼻或氣管滴注的方式致敏,CFA 作為油乳類佐劑,常用腹腔/皮下注射的方式致敏,在滴鼻和腹腔兩種方式的加持下,提高造模成功率。

2.3 致敏與激發(fā)方法

SA 模型在致敏和激發(fā)的持續(xù)時(shí)間、時(shí)間間隔、給藥途徑、給藥劑量等雖存在一定差異,但也有以下5 個(gè)共同點(diǎn):(1)動(dòng)物多次致敏,兩次致敏間隔通常為7~14 d;(2)過(guò)敏原激發(fā)多持續(xù)4~7 d,能夠引起較強(qiáng)烈的AHR、氣道炎癥等特征;(3)給藥方式通常為滴鼻、氣管給藥、霧化吸入、腹腔注射、皮下注射等。其中,腹腔注射多在致敏階段使用,氣管給藥和滴鼻多在激發(fā)階段使用;(4)過(guò)敏原劑量:致敏階段使用低劑量,激發(fā)階段使用高劑量;(5)多使用Al(OH)3、LPS 或CFA 作為佐劑,能夠獲得較為穩(wěn)定、可重復(fù)的SA 動(dòng)物模型。(具體的方法和內(nèi)容詳見(jiàn)表1)

表1 重度哮喘模型的構(gòu)建方法Table 1 Methods of establishing severe asthma models

3 重度哮喘動(dòng)物模型的病理表型分析

3.1 氣道炎癥

SA 炎癥反應(yīng)可根據(jù)氣道Th2 數(shù)量分為高Th2型和低Th2 型。高Th2 型SA 以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主,氣道細(xì)胞炎癥因子升高以Th2 分泌的細(xì)胞因子為主。IL-4 可誘導(dǎo)幼稚T 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞分化、IL-5 促進(jìn)骨髓中嗜酸性粒細(xì)胞的成熟并釋放IL-13,使嗜酸粒細(xì)胞向氣道遷移,通過(guò)作用于氣道平滑肌細(xì)胞引起氣道反應(yīng)性[31]。有研究者使用復(fù)合過(guò)敏原制備SA 模型,與使用OVA 或HDM 等單一過(guò)敏原誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘模型比較,OVA+HDM+CRA 多重過(guò)敏原誘導(dǎo)SA 模型小鼠的白細(xì)胞總數(shù)明顯增多,其中嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著升高,肺部Th2 型細(xì)胞因子IL-4、IL-5 的表達(dá)水平是普通哮喘組的3 倍,IL-13 和Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12 表達(dá)水平也顯著升高[14]。目前,針對(duì)高Th2 型SA 分泌高水平IgE、IL-5、IL-13 等炎癥介質(zhì),已開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的靶向藥物用于臨床治療,而低Th2 型SA仍缺乏有效的生物標(biāo)志物。

低Th2 型(或稱為Th2/Th17 型、中性粒細(xì)胞型)SA 模型以肺中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征,通常表現(xiàn)為較重的氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑病理變化,且對(duì)激素治療反應(yīng)不敏感,氣道細(xì)胞因子表達(dá)以Th1 細(xì)胞分泌的IFN-γ 和IL-12 以及Th17 細(xì)胞分泌的IL-17A 為主,其中IL-17A 被證明可以降低人氣道上皮對(duì)CS 的敏感性[32]。采用HDM 和LPS 聯(lián)合誘導(dǎo)低Th2 型SA 小鼠模型,其肺組織炎癥細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)經(jīng)地塞米松(dexamethasone,Dex)治療后顯著下降,而肺中淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及AHR 不能被有效抑制,在Dex 治療后反而促進(jìn)Th1 細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12 以及Th17 細(xì)胞因子IL-17A 等的表達(dá)增加[15]。用高劑量LPS 聯(lián)合三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)刺激過(guò)敏原裝載后的DCs,并且將這些細(xì)胞通過(guò)鼻腔滴注的方式致敏小鼠,在過(guò)敏原激發(fā)后該模型表現(xiàn)出SA 的特征,氣道中性粒細(xì)胞和Th17 細(xì)胞數(shù)量明顯增多,IL-17A 分泌水平顯著升高,與氣道滴注低劑量LPS刺激的過(guò)敏原轉(zhuǎn)載DCs 相比,該模型組的氣道重塑病理變化顯著增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在中性粒細(xì)胞炎癥基礎(chǔ)上,IL-17A 對(duì)氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞等)的作用加重了該模型的氣道重塑水平[33]。也有研究表明低Th2 型SA 小鼠模型對(duì)于抗IL-17F的治療有效,而對(duì)抗IL-17A 的治療無(wú)效,提示IL-17F 在SA 炎癥病理反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[12]。

3.2 氣道高反應(yīng)性

AHR 是哮喘的基本特征,能夠直接或間接通過(guò)運(yùn)動(dòng)、冷空氣、過(guò)度換氣誘發(fā),引起氣道平滑肌收縮,從而導(dǎo)致氣道變窄和氣流受限。哮喘的AHR 主要有兩種表現(xiàn)形式:其一表現(xiàn)為短暫的、可誘發(fā)的,通常發(fā)生在過(guò)敏原暴露后,在吸入CS 治療或環(huán)境控制后可迅速緩解,這種短暫的AHR 對(duì)間接刺激更為明顯,研究認(rèn)為其與氣道炎癥病理密切相關(guān);其二表現(xiàn)為持久性,多見(jiàn)于SA,在吸入CS 或環(huán)境控制后仍難以緩解,多繼發(fā)于慢性氣道炎癥所導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)性氣道變化[34]。

在哮喘患者中,氣道敏感性、反應(yīng)性和最大反應(yīng)都明顯增強(qiáng)。但是,與輕中度哮喘相比,SA 患者的氣道敏感性更高。在相同的1 s 秒內(nèi)用力呼氣量(FEV1)的變化率下,引起SA 的氣道最大反應(yīng)的刺激物濃度低于輕中度哮喘患者[35]。同樣,在SA 動(dòng)物模型中,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)患有牧場(chǎng)哮喘(pasture asthma, PA)的馬匹具有重度AHR,與對(duì)照馬匹相比,患有PA 的馬匹吸入乙酰甲膽堿(methacholine,Mch)后,肺阻力的平均百分比變化明顯更大,且誘發(fā)PA 馬匹氣道收縮反應(yīng)的過(guò)敏原濃度更低,表明PA 馬匹氣道敏感性更強(qiáng)。同時(shí)低濃度Mch(＜1 mg/mL)引起PA 的馬匹肺阻力增加40%,而對(duì)照組在較高劑量(8 ~ 16 mg/mL)下肺阻力仍無(wú)明顯變化[36]。

除了牧草馬哮喘,有研究者通過(guò)OVA 特異性Th1 細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)輸,誘發(fā)Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的SA 小鼠模型,與普通哮喘模型組相比,發(fā)現(xiàn)SA 組小鼠肺阻力升高更加明顯,AHR 更顯著增強(qiáng)[37]。不僅如此,有研究者使用HDM 和流感病毒H3N2 誘導(dǎo)SA 小鼠模型,分別在第4、8、10、15 天檢測(cè)肺阻力,與僅使用HDM 誘導(dǎo)的普通哮喘組相比,流感病毒H3N2 誘導(dǎo)的SA 小鼠表現(xiàn)出較早、較高的氣道阻力值,AHR 持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng),且對(duì)低濃度的Mch 敏感性更高[9]。

3.3 氣道重塑

由于哮喘氣道炎癥造成氣道組織結(jié)構(gòu)反復(fù)損傷刺激,最終引起的氣道壁結(jié)構(gòu)變化被稱為氣道重塑。其主要病理特征包括氣道平滑肌細(xì)胞增殖肥大、上皮完整性喪失、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、杯狀細(xì)胞化生、粘液分泌過(guò)多、上皮下纖維化、網(wǎng)狀基底膜增厚和血管生成等,均可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的肺功能喪失[38]。SA 患者與輕中度哮喘患者比較,氣道重塑更為明顯,主要表現(xiàn)為支氣管壁增厚,支氣管內(nèi)徑變窄,支氣管壁面積百分比增大,導(dǎo)致有效通氣面積減小氣道阻力顯著增大,構(gòu)成阻塞性通氣障礙[39]。

利用OVA+CRA+HDM 多重過(guò)敏原誘導(dǎo)小鼠SA 模型,發(fā)現(xiàn)小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞內(nèi)黏液分泌降低,而細(xì)胞外的黏液栓塞明顯增強(qiáng),同時(shí)平滑肌層厚度和肺組織纖維化程度高于輕中度哮喘模型[14]。在OVA 誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型過(guò)敏原激發(fā)階段(第5~55 天),使小鼠反復(fù)暴露于低劑量的流感嗜血桿菌(1×107CFU,每周1 次,共8 次),能夠使小鼠氣道Th2 細(xì)胞主導(dǎo)的嗜酸粒細(xì)胞炎癥表型,轉(zhuǎn)變?yōu)門h17 細(xì)胞主導(dǎo)的中性粒細(xì)胞炎癥表型,同時(shí)導(dǎo)致哮喘模型氣道黏液分泌增加和氣道重塑加重,主要表現(xiàn)為上皮下和血管周圍空間的膠原蛋白沉積和肌肉層增厚,α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和幾種主要膠原蛋白增加[40]。此外,Th17 相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A 和IL-22在中性粒細(xì)胞型SA 中發(fā)揮了重要作用,并參與氣道重塑。IL-17A 在SA 哮喘患者痰液中增加,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)“促纖維化”細(xì)胞因子,并在體外研究中激發(fā)人氣道平滑肌細(xì)胞遷移,IL-22 可促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞分化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及體外平滑肌的增殖、遷移,在慢性SA 小鼠模型中,氣道重塑以上皮下纖維化、粘液過(guò)度生成、平滑肌細(xì)胞增生和肥大、高表達(dá)IL-17A 和IL-22 為主要特征[41]。由此看來(lái),SA 哮喘小鼠模型氣道細(xì)胞纖維化高、細(xì)胞過(guò)度增殖遷移、粘液分泌加重,氣道重塑與中性粒細(xì)胞型炎癥密切相關(guān)。

由于小鼠的氣道壁是一種較薄的組織結(jié)構(gòu),因此小鼠哮喘模型中氣道重塑的研究較少涉及氣道平滑肌的變化,主要聚焦于氣道上皮下纖維化。而大鼠哮喘模型在過(guò)敏原致敏和反復(fù)激發(fā)后,通常能夠表現(xiàn)出氣道平滑肌增生肥厚等組織病理學(xué)變化,這些氣道重塑變化與大鼠模型的AHR 程度密切相關(guān)[42]。但是,有研究指出大鼠類固醇抵抗組與皮質(zhì)類固醇激素敏感哮喘組相比,兩者在杯狀細(xì)胞增生、上皮下膠原厚度和氣道平滑肌重塑方面無(wú)顯著差異[3]。因此,SA 動(dòng)物模型中氣道重塑的研究存在一定生理性局限,其在SA 疾病中的病理表型差異性以及診斷價(jià)值,仍有待闡明。

3.4 激素抵抗

臨床上,SA 患者盡管接受了高劑量的激素治療,但仍會(huì)出現(xiàn)難以控制的哮喘癥狀,被稱為激素抵抗性哮喘。有證據(jù)表明糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)異常、核組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 2,HDAC2)活性降低等可導(dǎo)致激素抵抗的發(fā)生和發(fā)展[43]。此外,非編碼RNA、細(xì)胞自噬等因素在激素抵抗中的作用也是近年研究的熱點(diǎn)。

通過(guò)OVA 和衣原體病毒、流感嗜血桿菌、流感病毒H1N1、 RSV 合并感染BALB/c 小鼠誘導(dǎo)SSIAAD ( severe steroid-insensitive allergic airway disease)新型小鼠模型,小鼠肺部miRNA-21 表達(dá)水平增加,而miR-21 靶磷酸酶和張力蛋白同系物(PTEN)的表達(dá)減少,并且與AKT 磷酸化水平增加和HDAC2 水平降低有關(guān),通過(guò)抑制miR-21 或PI3K,小鼠對(duì)CS 治療的敏感性恢復(fù)[44]。反復(fù)接觸過(guò)敏原也可導(dǎo)致小鼠對(duì)CS 不敏感,與單次LPS 激發(fā)相比,A/J 小鼠經(jīng)3 d 的LPS(0.1 mg/mL,每只40 μL,每天兩次)鼻內(nèi)激發(fā),HDAC2 和核因子E2 相關(guān)因子2(Nrf2)水平顯著降低,AKT 磷酸化水平增加,丙酸氟替卡松對(duì)其氣道炎癥的抑制作用明顯減弱[45]?？傊?激素抵抗是SA 的重要病理特征,制備新型SA 模型能夠更深入地研究其發(fā)病機(jī)制,并開(kāi)發(fā)新的治療藥物。

3.5 其他

除氣道炎癥、AHR、氣道重塑和激素抵抗等病理表型外,SA 動(dòng)物模型也表現(xiàn)出不同的分子表型,如NOD 樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、外泌體、miRNA、唾液結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素9(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-9,Siglec-9)等特征性分子,這些分子可能成為SA 的特征性診斷標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)。

NLRP3 炎性小體是一種存在于細(xì)胞漿中的多蛋白復(fù)合物,由凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋片(ACS)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)以及NOD 樣受體蛋白組成,它是一種重要的炎癥介質(zhì),參與多種炎癥反應(yīng)核免疫調(diào)節(jié)過(guò)程[46]。使用衣原體、流感嗜血桿菌以及OVA 誘導(dǎo)SA 小鼠模型,表現(xiàn)為氣道中性粒細(xì)胞、NLRP3、IL-1β 表達(dá)增高,靶向NLRP3 的治療可以減少IL-1β 的產(chǎn)生,降低SA 模型中性粒細(xì)胞炎癥和AHR[10]。臨床證據(jù)也表明,SA 患者肺組織、誘導(dǎo)痰中NLRP3 和IL-1β 的表達(dá)增多,這可能與中性粒細(xì)胞比例增加以及哮喘控制不佳有關(guān)[47]。此外,有研究顯示參與 SA 發(fā)病機(jī)制的所有類型的細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生和分泌外泌體,外泌體含有蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子以及共刺激分子,因此可以調(diào)節(jié) SA 中的免疫炎癥反應(yīng)[48]。miRNA 是一種內(nèi)源性非編碼小RNA,它在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,參與調(diào)節(jié)哮喘等肺疾病,其中miR-9 可調(diào)節(jié) GR信號(hào)和AHR,miR-21 能夠抑制 Th1 相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。哮喘小鼠敲除miR-21 表現(xiàn)為嗜酸粒細(xì)胞炎癥減少,Th1 型細(xì)胞因子增加[49]。因此,miR-9 和miR-21 可以作為SA 模型的輔助檢測(cè)指標(biāo)。此外,Siglec-9 是特異性表達(dá)于中性粒細(xì)胞的抑制性唾液酸聚糖受體,當(dāng)Siglec-9 與特異性配體或抗體結(jié)合,可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡或自噬,有助于促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥消退,是治療SA 中性粒細(xì)胞增多的潛在靶標(biāo)[50]。

4 總結(jié)與展望

目前,SA 動(dòng)物模型的制備在動(dòng)物品系、過(guò)敏原種類、致敏和造模方法等方面存在諸多差異,通過(guò)總結(jié)近十年的SA 模型造模方案,發(fā)現(xiàn)動(dòng)物選擇多以BALB/c 小鼠為主。致敏原可分為環(huán)境過(guò)敏原、病原體過(guò)敏原、化合物過(guò)敏原三大類,根據(jù)過(guò)敏原使用形式的不同,還可分為單一過(guò)敏原和復(fù)合過(guò)敏原,多配合佐劑來(lái)增強(qiáng)模型動(dòng)物的免疫應(yīng)答反應(yīng)。動(dòng)物接受過(guò)敏原致敏次數(shù)通常不少于2 次,并通過(guò)多次反復(fù)的過(guò)敏原激發(fā)進(jìn)行誘導(dǎo),過(guò)敏原的給藥方式多選用皮下或腹腔注射、氣管滴入或霧化吸入等。

在SA 動(dòng)物模型病理表型方面,以高Th2 型或低Th2 型區(qū)分表型,伴有氣道炎癥、氣道重塑、AHR加重,細(xì)胞因子顯著增高、激素抵抗等特征。SA 動(dòng)物模型可表現(xiàn)出較早、較高的氣道阻力值,氣道敏感性更高,且AHR 持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng),氣道重塑病理變化加重。

此外,SA 動(dòng)物模型的研究仍存在許多問(wèn)題。(1)臨床SA 患者對(duì)異體蛋白過(guò)敏引發(fā)哮喘的較少,而動(dòng)物造模時(shí)選用OVA 腹腔或皮下注射致敏具有明顯的局限性,使用病毒感染、環(huán)境中提取過(guò)敏原更符合臨床;(2)在研究激素抵抗時(shí)多選用Dex 腹腔注射,而臨床較少使用Dex 治療,多使用吸入性氫化可的松或甲潑尼龍;(3)目前SA 動(dòng)物模型的表型較為簡(jiǎn)單,還不能充分模擬SA 患者的復(fù)雜臨床表型,選用合適的過(guò)敏原(多重聯(lián)合過(guò)敏原等)、佐劑以及致敏和激發(fā)方案,同時(shí)利用基因編輯等方法可能有助于構(gòu)建具有特定臨床表型的SA 模型;(4)在SA 動(dòng)物模型中通過(guò)傳統(tǒng)的氣道炎癥、AHR、氣道重塑、激素抵抗等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估以外,可以結(jié)合NLRP3 炎性小體、外泌體和特定miRNA 等進(jìn)行SA病理表型分析。

綜上所述,今后還需針對(duì)SA 臨床表型進(jìn)一步優(yōu)化動(dòng)物模型的構(gòu)建方法,建立能夠更好地模擬人類SA 病理變化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,進(jìn)而加深對(duì)SA 發(fā)病機(jī)制的研究,發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)靶點(diǎn),并最終開(kāi)發(fā)出新的SA 預(yù)防和治療藥物。