劉雙春,張細江,王璐倩,陳再歡,林榮海*

(1.臺州市立醫(yī)院輸血科,浙江 臺州 318000;2.臺州市立醫(yī)院重癥醫(yī)學科,浙江 臺州 318000)

輸血反應(yīng)的特征是對輸注全血或其個別成分的不良反應(yīng),其嚴重程度從輕微到嚴重危及生命。他們也可能出現(xiàn)非特異性癥狀,通常與患者的其他潛在共病癥狀重疊。這種臨床表現(xiàn)的重疊使得輸血反應(yīng)的診斷變得極其困難[1]。死亡在急性輸血反應(yīng)中并不常見,但可迅速發(fā)生[2]。輸血相關(guān)急性肺損傷(transfusion-related acute lung injury, TRALI)是輸血過程中導(dǎo)致死亡的主要原因之一,在輸注血液制劑6 h 內(nèi)出現(xiàn)以急性非心源性肺水腫、低氧血癥為主要臨床表現(xiàn)的綜合征[3]。美國食品藥品管理局(food and drug administration,FDA)監(jiān)測了2012~2016 年所有的TRALI 死亡病例,大約占輸血相關(guān)總死亡人數(shù)的34%[4]。然而我國對于TRALI 基礎(chǔ)知識的掌握比較匱乏,臨床醫(yī)生對該病認識不足并且臨床輸血缺乏有效的預(yù)警系統(tǒng),經(jīng)常導(dǎo)致其漏診和誤診。進一步探究臨床輸血過程中TRALI 的主要發(fā)病機制,尋找輸血不良事件和血液輸注預(yù)警系統(tǒng)中的主要作用靶點,在防治TRALI 發(fā)生發(fā)展過程中具有舉足輕重的作用,對保證臨床輸血安全具有重要意義。

TRALI 的病理學機制尚不清楚,相關(guān)文獻報道了不同細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活參與了TRALI 的發(fā)病。目前,國際上公認的機制是“二次打擊”學說。患者本身的一些危險因素,包括感染、炎癥、敗血癥、慢性酒精濫用、吸煙、休克、肝手術(shù)、高壓機械通氣等成為了TRALI 的第一次打擊[5-6]。TRALI 的第二次打擊包括兩組類型:抗體介導(dǎo)型和非抗體介導(dǎo)型。人類白細胞抗原(HLA)-I 類、-II 類抗體或粒細胞特異性抗原(HNA)抗體是誘導(dǎo)TRALI 抗體介導(dǎo)型第二次打擊的主要輸注血液成分[7];另外血液成分中包含著一些溶血磷脂酰膽堿、花生四烯酸、可溶性CD40 配體等非抗體性的生物活性物質(zhì),因血液制劑儲存過久可導(dǎo)致其在血液中過量積累引起“儲存損傷”,成為了非抗體介導(dǎo)的第二次打擊的主要輸注血液成分[8-9]。僅有的少量相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),TRALI 的發(fā)生發(fā)展與機體的一系列炎癥反應(yīng)及免疫損傷過程密切相關(guān),涉及大量炎癥及免疫相關(guān)信號分子及信號通路的激活,但其相關(guān)生物學研究尚不充分。在多種炎癥及免疫相關(guān)信號通路中,PI3K/Akt/mTOR 信號通路在炎癥反應(yīng)中有重要作用,參與多種類型急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展,但在TRALI 中的相關(guān)研究甚少。PI3K/Akt/mTOR 軸傳遞的重要信號調(diào)節(jié)包括了幾乎所有組織類型的各種生理過程,如增殖、凋亡、炎癥細胞遷移和免疫反應(yīng),其調(diào)節(jié)失調(diào)與各種疾病的發(fā)展相關(guān),包括癌癥、糖尿病、自身免疫及炎癥相關(guān)疾病等[10]?；诖?本研究利用創(chuàng)傷-失血-大量輸血的方法構(gòu)建了TRALI 大鼠模型,對其外周血/肺組織中的相關(guān)炎癥因子表達譜進行分析,同時明確PI3K/Akt/mTOR信號通路在TRALI 發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控機制,這一研究以mTOR 作為靶點,無疑將為臨床工作中TRALI 的有效防治提供必要的理論支撐和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠共20 只,6~8 周齡,體重180~200 g,購自南京君科生物工程有限公司[SCXK(滬)2018-0006],無菌處理動物培養(yǎng)過程中所需的物品(包括標準飼料、飲水和墊料等),動物在22~24℃和(50±5)%濕度下保持12 h/12 h 明暗循環(huán),在臺州學院醫(yī)學院SPF 級動物房常規(guī)飼養(yǎng)[SYXK(浙)2021-0013]。所有動物實驗均通過臺州學院實驗動物倫理審查并批準(TZXY-2021-20211001),按照《實驗動物管理條例》要求的實驗動物使用3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa 公司(貨號:AJ60650A);SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑購于日本TOYOBO 公司(貨號:647200);實驗過程中所有的上下游引物及大鼠ACTB 內(nèi)參引物均由上海生工生物工程有限公司提供;RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑和ECL 超敏發(fā)光試劑均購于上海碧云天生物科技有限公司;TNF-α(貨號:PT516)、IL-1β(貨號:PI303)和IL-6(貨號:PI328)ELISA 試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白Marker 購于上海雅酶生物科技有限公司;p-mTOR(Ser2448)(D9C2)(貨號:#2475)、mTOR(7C10)(貨號:#2983)、p-Akt(Ser473)(D9E)(貨號:#4060)、Akt(pan)(C67E7)(貨號:#4691)、Bax(E4U1V) (貨號:#41162)、Bcl-2(124) (貨號:#15071)、 Caspase3 (貨 號: #9662)、 GAPDH 抗 體(D16H11)(貨號:#5174)、HRP-山羊抗兔二抗(批號7074P2)美國CST 公司。Thermo Fisher PCR 擴增儀;Roche 實時熒光定量PCR 儀;瑞士TECAN 酶標儀;Bio-Rad Western 電泳電轉(zhuǎn)儀;奧林巴斯BX53顯微拍照系統(tǒng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及模型構(gòu)建

將大鼠隨機分為正常對照組(normal control,NC)(n=5)、TRALI 模型組(TRALI model,TM)(n=7)和生理鹽水對照組(normal saline,NS)(n=6)。

本實驗動物模型的構(gòu)建參照胡嬡等[11]的建模方法進行,具體方法如下:異氟醚(0.6~0.8 L/min)麻醉動物,大鼠股動靜脈置管后15~30 min 采集大鼠全血的30%,恢復(fù)1 h 后以2 倍失血量的乳酸林格鈉液平衡液進行補液,40 min 內(nèi)補液完成后經(jīng)股靜脈注射伊文思蘭染液(Evans blue dye,EBD)30 mg/kg,隨后將保存了35 d 的紅細胞進行輸注;同時將NS 組大鼠輸注相同體積的生理鹽水。紅細胞輸注量(mL)=大鼠基礎(chǔ)紅細胞比容/該袋PRBC 紅細胞比容×失血量(mL),將濃縮紅細胞用生理鹽水稀釋成總體積=失血量,并于30 min 內(nèi)輸注完畢。生理鹽水輸注量=紅細胞輸注量。NC 組大鼠不做任何處理。

1.3.2 肺組織病理學檢測

模型制備成功后6 h,處死各組大鼠取出右肺組織。福爾馬林固定,行HE 染色,觀察大鼠肺組織形態(tài)學改變。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測外周血TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達

采集大鼠外周靜脈血,分離血清置-80℃?zhèn)溆?采用ELISA 試劑盒檢測外周血血清中TNF-α、IL-6和IL-1β 含量。所有操作均按照說明書進行。

1.3.4 Real-time PCR(RT-qPCR)檢測肺組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 mRNA 表達

采用RT-qPCR 方法分析肺組織中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA 表達。使用TRIzol ?試劑提取RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用SYBR 預(yù)混EX TaqTMcDNA 和特定的基因引物進行qPCR,并使用LightCycler480 system 進行檢測。確定各基因的相對表達量,歸一化為ACTIN 的表達量,用2-ΔΔCq法計算。引物的序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.5 Westem blot 檢測肺組織中相關(guān)蛋白的表達

提取大鼠肺臟組織總蛋白,BCA 法檢測蛋白濃度。將樣本用恒溫金屬浴煮沸(100℃)3 min 后行8%或10% SDS-PAGE 電泳,100 V 電轉(zhuǎn)60 min,將中間膜轉(zhuǎn)移至PVDF。脫脂牛奶恒溫37℃封閉2 h,TBST 洗 膜3 次,每 次10 min,一 抗Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、 Bcl-2、 Bax、 Caspase3 和 GAPDH(1 ∶1000;CST)孵育抗覆蓋膜4℃孵化過夜。轉(zhuǎn)天TBST 漂洗3 次共30 min 后于HRP 標記的二抗室溫孵育2 h,TBST 洗滌3 次后ECL 法顯色拍照,采用Image J 圖像分析軟件進行結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)對的統(tǒng)計和分析采用GraphPad Prism 7.0軟件進行,以平均數(shù)±標準差(±s)表示結(jié)果中的數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用了配對樣本t檢驗和單因素方差分析。P值通過Bonferroni 進行校正。P＜0.05 為差異顯著,P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的肺組織HE 染色

如圖1 所示,HE 染色后發(fā)現(xiàn),NC 組大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡腔內(nèi)無滲出液及細胞;與NC 組相比,TM 組(紅圈內(nèi))肺泡組織結(jié)構(gòu)嚴重受損,肺泡壁增厚,肺泡腔有粉色水腫液,炎細胞浸潤,水腫明顯;NS 組肺泡結(jié)構(gòu)基本完整,無肉眼可見的水腫和炎性細胞浸潤。

圖1 各組大鼠HE 染色Figure 1 HE staining of rats in each group

2.2 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的mRNA 表達水平

RT-qPCR 檢測肺組織中相關(guān)細胞因子的mRNA 表達水平,如圖2 結(jié)果所示,與NC 組相比,TM 組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的mRNA表達水平均顯著增高(P＜0.05);與TM 組相比,NS組大鼠肺組織中TNF-α 和IL-1β mRNA 表達水平均明顯下降(P＜0.05);NC 組與NS 組相比,差異無統(tǒng)計學意義。

注:與正常對照組相比,*P＜0.05,**P＜0.01;與TRALI 模型組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。圖2 RT-qPCR 檢測各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 的表達水平Note.Compared with NC group,*P＜0.05,**P＜0.01.Compared with TM group, #P＜0.05,##P＜0.01.Figure 2 Expression levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA in lung tissues were detected by RT-qPCR

2.3 各組大鼠外周血中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的蛋白表達水平

如圖3 所示,與NC 組相比,TM 組大鼠外周血中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的分泌水平均顯著增高(P＜0.01);與TM 組相比,NS 組大鼠外周血中TNF-α 和IL-1β 表達水平均明顯下降(P＜0.05);NC 組與NS組相比,所有細胞因子水平的變化差異均無統(tǒng)計學意義。

注:與正常對照組相比,**P＜0.01;與TRALI 模型組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。圖3 ELISA 檢測各組大鼠外周血中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌水平變化Note.Compared with NC group,**P＜0.01.Compared with TM group,#P＜0.05,##P＜0.01.Figure 3 Levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 production in peripheral blood were detected by ELISA

2.4 PI3K/Akt/mTOR 信號通路蛋白在各組大鼠肺組織中的表達

與NC 組相比,TM 組和NS 組大鼠肺組織中p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 顯著升高(P＜0.01)。與TM 組比較,NS 組p-Akt/Akt 顯著降低,然而pmTOR/mTOR 則顯著升高(P＜0.01)(圖4)。

注:與正常對照組相比,**P＜0.01;與TRALI 模型組相比,##P＜0.01。圖4 PI3K/Akt/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白在各組大鼠肺組織中的表達水平Note.Compared with NC group,**P＜0.01.Compared with TM group,##P＜0.01.Figure 4 Expression levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway relative protein in lung tissue were detected by Western blot

2.5 Bcl-2、Bax 和Caspase3 凋亡蛋白在各組大鼠肺組織中的表達

如圖5 所示,與NC 組相比,Bax 和Caspase3 蛋白表達水平在TM 組大鼠肺組織中呈明顯下降趨勢,Bcl-2 蛋白表達則呈現(xiàn)顯著增加(P＜0.05),NS組Bax 和Caspase3 蛋白表達水平則明顯增加(P＜0.01);與TM 組相比,NS 組大鼠肺組織中Bax 和Caspase3 蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)。

注:與正常對照組相比,**P＜0.01;與TRALI 模型組相比,##P＜0.01。圖5 Western blot 檢測各組大鼠肺組織中Bcl-2、Bax 和Caspase3 凋亡蛋白的表達水平變化Note.Compared with NC group,**P＜0.01.Compared with TM group,##P＜0.01.Figure 5 Expression levels of Bcl-2, Bax and Caspase3 apoptosis protein in lung tissues were detected by Western blot

3 討論

TRALI 是一種輸血相關(guān)的嚴重并發(fā)癥,是與輸血有關(guān)的第二大死亡原因[1]。TRALI 急性起病,以低氧血癥(P/F≤300 或SpO2＜90%)為特征,影像學明顯雙側(cè)肺水腫,屬于非心源性肺水腫。首先,TRALI 是一種臨床診斷,盡管我們在了解其發(fā)病機制方面已經(jīng)取得了長足進展,包括識別抗人HLA 或人HNA 抗體,但其生物標志物只能支持診斷[12]。因此深入研究TRALI 疾病進展過程中的病理生理學機制,是促進其預(yù)防和治療的重要手段。

TRALI 的發(fā)生發(fā)展與機體一系列炎癥反應(yīng)及免疫損傷過程密切相關(guān),涉及大量炎癥及免疫相關(guān)信號分子及信號通路的激活,但其相關(guān)生物學領(lǐng)域研究尚不充分。本研究參照“二次打擊假說”理論,將雄性SD 大鼠制備成TRALI 動物模型,HE 染色觀察了模型大鼠肺組織損傷情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),TM組大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)嚴重受損,肺泡壁增厚,肺泡腔有粉色水腫液,炎性細胞浸潤,水腫明顯(圖1),由此證明TRALI 大鼠模型制備成功。TRALI 發(fā)病重要的病理生理學基礎(chǔ)是肺部炎癥細胞聚集及其隨后細胞因子及炎癥介質(zhì)的大量釋放,從而引起肺臟組織中微血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞的損傷[13]。肺泡腔內(nèi)的巨噬細胞既具有吞噬功能,又具有分泌功能,在受到外界因素刺激后能夠合成并釋放腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)等多種炎癥細胞因子,便于中性粒細胞遷移、粘附于損傷部位,并激活后產(chǎn)生呼吸爆發(fā),啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng),加重肺損傷[14]。本研究中我們采用RT-qPCR 和ELISA 檢測的肺組織和外周血中TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 和蛋白的表達水平。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),TRALI 大鼠肺組織和外周血中相 關(guān)炎性細 胞因 子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的mRNA 和蛋白的表達水平均明顯升高(圖2、圖3)。

PI3K/Akt/mTOR 是酪氨酸激酶級聯(lián)相關(guān)的一條重要的信號通路,參與了細胞的存活、增殖、代謝、遷移,并且還與自噬和 凋亡密切相關(guān)[15]。此信號通路一旦被激活,會通過多種炎癥過程參與肺臟的炎癥浸潤和組織破壞,造成肺部的損傷。相關(guān)文獻報道,抑制PI3K/Akt/mTOR 通路肺損傷的炎癥水平可明顯降低[16]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),TRALI 發(fā)生發(fā)展過程中PI3K/Akt/mTOR 信號通路被活化,Akt和mTOR 蛋白表達水平均明顯增加,通過增加TNF-α、IL-6 和IL-1β 等炎癥介質(zhì)的表達參與了肺損傷的發(fā)生。

另外,在炎癥性相關(guān)疾病發(fā)展中,mTOR 已被認為是發(fā)展靶向藥物的關(guān)鍵治療靶點[17]。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)不同誘導(dǎo)因素引起的急性肺損傷中,mTOR 信號通路是一把雙刃劍。一方面可以發(fā)揮對急性肺損傷的保護性作用:通過抑制自噬減少促炎細胞浸潤。另一方面也可以誘導(dǎo)急性肺損傷的加重:通過激活自噬促使細胞凋亡和相關(guān)炎癥因子的大量分泌。目前關(guān)于mTOR 信號通路調(diào)控肺損傷過程中具有雙面性的調(diào)控機制還不清楚。

自噬是細胞通過溶酶體降解各種大分子物質(zhì)并破壞細胞器的一種行為。近年來,自噬在調(diào)節(jié)宿主炎癥和細胞凋亡中的作用尚未完全闡明,但可以明確的是,自噬可以影響炎性疾病的進展和預(yù)后[18]。自噬在下列情況下可以抑制凋亡:一方面是低營養(yǎng)情況下促進細胞存活;另一方面是可清除受損線粒體,降低活性氧含量[19]。與上述結(jié)論相一致,本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRALI 發(fā)生的早期(6 h 內(nèi)),機體組織處于低能量和低營養(yǎng)狀態(tài),自噬被激活后明顯抑制了Bax 和Caspase3 蛋白的表達,卻促進了Bcl-2 蛋白的表達。隨后mTOR 的激活明顯抑制了自噬從而加重了肺組織的炎癥反應(yīng)。由此說明,在TRALI 發(fā)生發(fā)展的早期階段(6 h),機體利用自噬和凋亡的級聯(lián)反應(yīng)最終誘導(dǎo)了肺組織炎性細胞浸潤、急性肺損傷的發(fā)生。田雪[20]提到TRALI 的疾病進程涉及mTOR 信號通路的上調(diào)激活,預(yù)防性使用mTOR 特異性抑制劑(Rapamycin,RAPA)可在一定程度上緩解小鼠肺損傷的嚴重程度,可能為TRALI預(yù)防治療的潛在方式。

然而,我們需要強調(diào)的是,對于TRALI 患者來說,如果未進行臨床干預(yù),在晚期階段則表現(xiàn)為肺組織自噬被激活后誘導(dǎo)了顯著的細胞凋亡和細胞因子風暴,肺損傷明顯加重[17]?？傊?自噬作用與疾病的誘導(dǎo)因素類型相關(guān),既有有害作用[21-22]又有細胞保護作用[23-24],而具體機制尚未研究清楚。自噬誘導(dǎo)是利是弊,取決于疾病的類型或階段。mTOR 作為一個有潛力的藥物靶點,由于其作用機制的復(fù)雜性,界定其發(fā)揮保護和損傷作用的確切時間靶點,選擇最佳用藥時間是臨床防控TRALI 發(fā)生發(fā)展的重要手段。