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膠體金試紙條檢測沙門氏菌的綜合實驗與研究

2023-12-12 09:25:25周麗南昌市青云譜區(qū)疾控中心江西南昌330000
首都食品與醫(yī)藥 2023年22期
關(guān)鍵詞:檢測線沙門氏菌紙條

周麗(南昌市青云譜區(qū)疾控中心,江西 南昌 330000)

食源性致病菌是影響食品安全最為主要的因素,因此為了能夠快速檢測出食源性致病菌,需要采用更為簡潔、快速的技術(shù),以為治療食源性致病菌提供便利。目前應用于實際檢測的方法為酶聯(lián)免疫吸附、聚合酶鏈式反應等,雖然這些方法的可靠性具有一定的保證,但是實驗耗時長,無法滿足臨床檢測的需要。為此,為了能夠快速地檢測出沙門氏菌等食源性致病菌,可利用具備生物親和性的納米金對沙門氏菌抗體進行檢測,通過對檢測線的捕捉,判斷顏色條帶,實現(xiàn)對沙門氏菌的定性和定量檢測。

1 膠體金試紙條檢測沙門氏菌綜合實驗準備

膠體金技術(shù)是一種極為常用的分析技術(shù),本實驗主要采用納米金技術(shù),借助膠體金的穩(wěn)定性和靈敏性制備試紙條,對沙門氏菌進行現(xiàn)場檢測和臨床試驗。

1.1 主要應用試劑 本次實驗應用的試劑為二水合檸檬酸三鈉、氯金酸、碳酸鉀、鹽酸。實驗所有試劑均購自長期合作的化學試劑公司。同時,本次實驗還應用了來自菲鵬生物股份有限公司的羊抗小鼠二抗,而沙門氏菌抗體則購自長期合作的Abcam公司[1]。此外,在開展實驗的過程中,還需用到牛血清白蛋白、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌。為了保證實驗的效果,需要借助樣品墊、結(jié)合墊和NC膜。

1.2 主要儀器 實驗應用的儀器包括對抗體以及試劑進行重量稱量的電子天平,用于觀測抗體變化的離心機、投射電鏡,以及用于觀測實驗顏色變化的紫外光光度計。在實驗過程中,還需應用對試劑攪拌、樣品混合的控溫磁力攪拌器、恒溫振蕩器、高速切條機。待實驗結(jié)束后,利用超聲波清洗器對所有實驗器具進行清洗。

1.3 納米金制備 本次實驗主要采用檸檬酸鈉還原法對納米粒子進行合成。利用濃度為0.029mol/L的氯金酸鈉溶液與超純水進行混合,并將混合后的溶液添加至200ml的三口燒瓶中,利用磁力攪拌器對其進行攪拌并加熱,直至將溶液煮沸。并在最短時間內(nèi)向煮沸的溶液中添加新鮮配置的檸檬酸鈉溶液,將混合溶液進行加熱回流,待15min后停止加熱,將其放置于4℃的環(huán)境中進行儲存,以備后續(xù)實驗使用[2]。

1.4 NC膜組裝 對沙門氏菌單抗進行檢測,需要將其與羊抗鼠結(jié)合后,利用PB溶液對其進行稀釋,以便能夠在后續(xù)實驗的過程中利用三維劃膜儀對沙門氏菌單抗進行檢測。在對其進行檢測的過程中,要將沙門氏菌與單抗鼠結(jié)合放置于NC膜的劃線位置,以便能夠保證檢測線和質(zhì)控線對實驗體進行檢測。此外,在進行檢測前,需將劃好線的NC膜放置于溫度為37℃的鼓風干燥箱中,靜置2.5h后,再對其進行烘干,將NC膜密封,保存在干燥處。

1.5 試紙條組裝 試紙條的組裝需要用到樣品墊和吸水紙,利用數(shù)控裁條機將樣品墊和吸水紙裁成的規(guī)格大小為200mm×20mm,并將NC膜貼附于PVC底板上,使得被貼合后的NC膜能夠接近檢測線一端,待兩者重合后,保證其縫隙小于1mm,再將樣品墊緊緊貼合至PVC底板上,并保證其與結(jié)合墊結(jié)合的厚度在2mm左右。同時,將與吸水紙重合后的NC膜貼合至靠近質(zhì)控線的一端。待上述步驟完成后,對其進行切割,切割至大小為3mm×6.5cm的試紙條,并將其放置于存有干燥劑的自封袋中。

2 膠體金試紙條檢測沙門氏菌綜合實驗探究

利用膠體金試紙條對沙門氏菌進行檢測,需要在進行檢測前制定完備的檢測方案,基于沙門氏菌的檢測原理,在特定條件下對其進行檢測。在進行檢測的過程中,應當針對不同濃度的沙門氏菌設計不同的檢測方案,進行特異性和重復性實驗。

2.1 檢測原理 膠體金試紙條對沙門氏菌進行檢測,主要是基于抗體的免疫反應以及層析作用,利用納米金探測針實現(xiàn)對沙門氏菌的識別。在進行檢測的過程中,在毛細作用的幫助下將納米金與沙門氏菌的混合溶液自NC膜向吸水紙方向推動。待沙門氏菌與納米金混合后到達質(zhì)控線時,其會被處于質(zhì)控線的沙門氏菌抗體捕獲,從而形成鮮明的顏色條帶。而一直處于游離狀態(tài)的納米探針則會繼續(xù)向前移動,待其被檢測線上的沙門氏菌抗體捕獲后,會再次形成顏色條帶[3]。但是如果樣品中并未含有沙門氏菌,則只能依靠檢測線的二抗作用進行顯色。如在檢測后試紙條上的檢測線和質(zhì)控線都顯色,則表示樣品中含有沙門氏菌。當只有檢測線顯色時,則表示樣品中并不含有沙門氏菌。而如果質(zhì)控線不顯色,則表示納米金金屬探針不能與檢測線進行二抗結(jié)合,表示實驗失效。整個實驗無需采用大型儀器,只需裸眼就可分辨沙門氏菌的存在。

2.2 檢測方案 首先,提取大約50μL的沙門氏菌樣品,將其放置于微孔板中,并在樣品中添加納米金探針,再向其中添加濃度為2%的重懸液,待其體積達到100μL后,使其進行10min的孵育。其次,將試紙條樣品墊插入混合后的溶液中,待溶液層析出爬條后,再將其放置于微孔板中,并再次加入50μL的重懸液,利用重懸液對爬條進行清洗。最后,將其靜置20min后,觀察爬條的顯色情況,并利用智能手機進行拍照留存,通過Image軟件對檢測線上的灰度值進行測量,將其標志為檢測信號,記錄樣品的灰度值和空白樣品的灰度值,以備后續(xù)使用。

2.3 檢測條件 構(gòu)建沙門氏菌的檢測條件,需要采用單因素變量法,利用其對檢測條件進行優(yōu)化,以便使沙門氏菌在最優(yōu)條件下進行檢測。在進行實驗的過程中,要事先觀察爬條的顯色情況,利用已經(jīng)測定的灰度值計算出檢測沙門氏菌的最優(yōu)條件。將所有陽性沙門氏菌的濃度都設定為107CFU/ml,并在所有實驗體中添加同體積的磷酸緩沖溶液,反復進行3次實驗。此外,利用封閉探針測定BSA濃度,記錄探針所采用的抗體量,以便能夠?qū)ζ溥M行優(yōu)化。在進行檢測過程中,將BSA濃度設置為1%、4%、6%三個濃度,利用修飾探針檢測應用的抗體量。

2.4 不同濃度沙門氏菌檢測 在對0.5×104、1×105、2×106、3×107等不同濃度的沙門氏菌進行檢測時,需要觀測不同樣品的顯色情況,再確定裸眼檢測時限,通過測定樣品的相對灰度值,使得樣品濃度能夠達到擬合標準曲線,從而確定不同濃度沙門氏菌的半定量范圍。

2.5 特異性考察 在最佳條件下進行考察,其能夠檢測樣品中107CFU/ml的沙門氏菌、大腸桿菌和李斯特菌。在進行實驗的過程中,將不同體積的緩沖溶液與空白樣品對照,并重復進行3次實驗,待實驗結(jié)束后,觀察每組實驗體的顯色情況,并對實驗體的灰度值進行測量,比對各組實驗體的灰度值信號。

2.6 重復性考察 在整個實驗中抽取9個沙門氏菌的實驗樣品,利用9個試紙條對不同濃度的沙門氏菌進行測試,并與陰性樣品進行對照。并且在進行檢測的過程中,要設置不同的探針量,可以將探針量設置為5μL、10μL、11μL、132μL,將其置于最佳條件下,對其不同濃度的沙門氏菌進行檢測,將試紙條放置于溫度為4℃的環(huán)境中,檢測陽性樣品和隱性陰品,通過對陽性樣品和陰性樣品之間檢測結(jié)果的對比檢驗試紙條的有效性,并依照比對結(jié)果計算回收率,再利用得出的回收率確定試紙條的實際檢驗結(jié)果。

3 膠體金試紙條檢測沙門氏菌綜合實驗結(jié)果分析

在利用膠體金試紙條對其進行檢測完畢后,通過分析納米金表征、沙門氏菌靶向生物探針表征分析沙門氏菌的存在情況。并且在最優(yōu)條件下,對膠體金試紙條性能和特異性結(jié)果進行分析。

3.1 納米金表征 根據(jù)實驗結(jié)果顯示,納米金在檢測完畢后呈現(xiàn)出酒紅色,通過與紫外可見光譜的對比可以看出處于521nm處的納米金粒子正處于吸收峰[4]?;趯ν干潆婄R圖的分析,可以明顯看出金納米粒子呈現(xiàn)出球形形狀,且通過對其尺寸的觀察可以看出金納米粒子尺寸均勻,且并無明顯的團聚現(xiàn)象。在對200個顆粒粒徑進行統(tǒng)計測量后,可得出金納米粒子的平均粒徑可達到14.0nm。

3.2 沙門氏菌靶向生物探針表征 在對沙門氏菌進行檢測時,將其置于接近蛋白質(zhì)電點或是偏堿的條件下進行測量。在進行檢測過程中,將蛋白質(zhì)與金納米粒子進行混合,使得二者形成牢固的結(jié)合物。首先,將其置于帶電負電荷中,通過與蛋白內(nèi)氨基酸的結(jié)合,使得其中的負電荷能夠與正電荷相互吸引,以便實現(xiàn)對于沙門氏菌的分離。其次,通過與蛋白的結(jié)合,使得蛋白中的氨基酸殘基能與金納米粒子表面發(fā)生疏水吸附,從而實現(xiàn)與金元素配位結(jié)合。通過檢測,可以看出沙門氏菌抗體中所攜帶的鐵元素中含有賴氨酸、色氨酸等,且能夠吸附至金納米粒子表面,進而發(fā)揮生物識別功能。待修飾抗體后,納米金探針在與沙門氏菌接觸后仍舊呈現(xiàn)出酒紅色。與紫外光譜對比后可以發(fā)現(xiàn),修飾納米金呈現(xiàn)出紅移現(xiàn)象,且在經(jīng)過透射電鏡檢測后,納米金仍舊為球形且并未出現(xiàn)團聚現(xiàn)象。因此,通過該結(jié)果可以判斷出,修飾對于納米金的光學性以及形貌并不會產(chǎn)生影響,其反而能夠進一步驗證沙門氏菌的抗體活性。

3.3 最優(yōu)檢測條件 通過對BSA濃度、修飾抗體量以及探針用量的分析可以判斷出其對于探針的影響。根據(jù)圖譜顯示,BSA濃度在用于分析金納米粒子表面時,未發(fā)現(xiàn)與抗體結(jié)合的位點,并未展現(xiàn)出明顯的特異性。但是在高濃度BSA信號釋放后,隨著濃度的增大,其中的沙門氏菌含量逐漸減少,通過裸眼對檢測線顯色情況的分辨可以看出有微弱的顯色反應,即可以判斷出存在非特異性吸附的情況。同樣,通過對表面抗體修飾量的檢測可以發(fā)現(xiàn),隨著修飾量的增多,其中的沙門氏菌會逐漸增大,待至修飾量達到2μg后,如繼續(xù)加大抗體用量,則不會呈現(xiàn)出明顯變化,因此可以判斷出2μg抗體是探針用量與細菌結(jié)合的臨界值,在此范圍內(nèi)會使得顯色加深,但是一旦用量超出2μg的范圍,灰度值反而會出現(xiàn)下降的情況。

3.4 性能分析 在最優(yōu)的檢測條件下,其主要考察了裸眼定性檢測限值以及灰度值的半定量范圍。在進行檢測的過程中采用該種方式能夠檢測不同濃度的沙門氏菌,待觀測到檢測線呈現(xiàn)顏色條帶后,其質(zhì)控線并未出現(xiàn)顯色情況。而隨著沙門氏菌濃度的不斷增加,在增加至1×10CFU/ml時,質(zhì)控線則會微弱地顯示出紫紅色條帶,待檢測限超出1×10CFU/ml后,隨著濃度的提升,條帶顏色會逐漸加深。同時,在Image軟件的檢測下,質(zhì)控線的相對灰度值會隨著細菌濃度的提升逐漸提高,呈現(xiàn)出線性的關(guān)系,能夠被用于半定量分析。

3.5 特異性結(jié)果 在采用幾種常見的細菌對該種方法的特異性進行測定后,發(fā)現(xiàn)將該種方法應用于檢測沙門氏菌,其在檢測線和質(zhì)控線上都呈現(xiàn)出了明顯的顏色條帶,而其他幾種常見菌種則并未呈現(xiàn)出明顯的顏色條帶。一些常見的菌種甚至只是在檢測線上出現(xiàn)明顯的顏色條帶,基本與空白樣品組相持平。通過對沙門氏菌的相對灰度值的檢測可以發(fā)現(xiàn),沙門氏菌的灰色值信號明顯高于其他細菌組,雖然常見細菌組的灰度值信號比空白樣品組略大,但是可以明顯看出其遠遠低于沙門氏菌,因此采用這種方式是進行沙門氏菌檢測的最好方式。

總而言之,在本次實驗中,通過制備納米金的方式,利用抗原抗體的免疫反應和層析作用對沙門氏菌進行檢測,簡化了沙門氏菌的檢測步驟,實現(xiàn)了對于沙門氏菌定性以及定量的判斷。在整個實驗過程中,并未使用復雜的儀器,且實驗成本極為低廉,而且本次實驗還囊括了化學、生物、醫(yī)學等多個學科知識,有助于提升實驗的綜合性,保證實驗效果。本次實驗主要立足于納米科技,通過對病原體的檢測,得出了精準的實驗結(jié)果,為后續(xù)的科學研究奠定了基礎,促進了多學科的良性循環(huán),增添了實驗的綜合性。

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