宋璐璐，田嬌嬌,2，李 娜，張 娜，楊文香

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心/國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001；2.河北省清河縣職教中心，河北 邢臺(tái) 054800；3.河北省植保植檢總站，河北 石家莊 050035）

由鐮刀菌（Fusariumspp.）引起的小麥赤霉病(Fusariumhead blight，F(xiàn)HB)又稱爛穗病。在美國(guó)、中國(guó)、歐盟、英國(guó)、非洲、巴西等地區(qū)廣泛發(fā)生，是一種世界性的流行真菌病害［1-2］。該病害可發(fā)生在小麥生長(zhǎng)的任何時(shí)期，引起苗枯、莖基腐、稈腐和穗腐，其中以穗腐危害最大。通?？梢栽斐尚←湝p產(chǎn)10%～15%，嚴(yán)重發(fā)生可以造成20%～40%的產(chǎn)量損失，大流行則可造成80%～90%以上的損失［3］。

小麥赤霉病是典型的氣候性病害，主要發(fā)生于氣候溫暖濕潤(rùn)的地區(qū)。近年來(lái)，隨著全球氣候變暖及耕作制度的變化，小麥赤霉病的發(fā)生范圍逐漸向過(guò)去干旱低溫的北部和西部種植區(qū)擴(kuò)大，以前該病害在河北為偶發(fā)性病害，但近年來(lái)赤霉病的發(fā)生面積由河北省的南部向北呈繼續(xù)擴(kuò)展趨勢(shì)，已經(jīng)成為河北省的常發(fā)病害。

小麥赤霉病的致病菌主要包括禾谷鐮刀菌（F.graminearum）、亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）、黃色鐮刀菌（F.culmorum）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）、串珠鐮刀菌（F.moniliforme）和雪腐鐮刀菌（F.niva）［4］。在我國(guó)，主要為禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌［5］，長(zhǎng)江中下游小麥赤霉病的主要致病菌是亞洲鐮刀菌［6］，而在北方小麥種植區(qū)河北中部和南部地區(qū)，主要病原菌類型為禾谷鐮刀菌［7-8］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌的毒素類型主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-AcDON)和乙酰雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)［9］。不同地區(qū)鐮刀菌產(chǎn)生毒素化學(xué)型不同，長(zhǎng)江上游的小麥種植區(qū)主要的化學(xué)型為NIV；長(zhǎng)江中下游小麥種植區(qū)主要的化學(xué)型為DON［10］；北京與河北地區(qū)小麥真菌毒素污染的主要類型為DON 與15-AcDON［11］。同時(shí)禾谷鐮刀菌菌株間存在明顯的致病分化，不同地區(qū)的小麥赤霉病菌的致病力不同［12］。

從2017 年至今，隨著氣溫的改變，河北省的小麥赤霉病發(fā)生頻率和嚴(yán)重度不斷提升，其病原菌是否發(fā)生改變，毒素類型、致病性是否存在差異均需要明確。為此本研究將從河北省不同地區(qū)采集小麥赤霉病病穗，分離病原菌，利用分子標(biāo)記和形態(tài)鑒定明確其病原菌類型，利用分子標(biāo)記明確赤霉病菌的毒性類型，以期為抗病品種的鑒定和病害的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 病原菌的分離純化

2020—2021 年5 月份，從河北省小麥主要種植區(qū)采集具有典型赤霉病癥狀的病穗樣本182 份。從采集的病穗的穎殼處取病組織，采用組織分離法分離病原菌，用無(wú)菌剪刀剪下病組織約0.3 cm，依次用0.1%升汞（30 s）、75%乙醇（30～60 s）和無(wú)菌水（重復(fù)3 次）消毒表面，按照分離培養(yǎng)的操作程序，將無(wú)菌病組織表面的水分吸干，置于馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）平板上，每皿放1 塊病組織料，并做標(biāo)記，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。菌落形成后，挑出新的菌絲體，在PDA 平板上培養(yǎng)，獲得菌株的純培養(yǎng)物，進(jìn)行編號(hào)，備用。

1.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

接種菌株于PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，5 d 后按照赤霉病形態(tài)鑒定程序進(jìn)行鑒定［13］，觀察菌株菌落形態(tài)特征，基質(zhì)顏色等；另在綠豆培養(yǎng)基中25 ℃、120 r/min 培養(yǎng)，待5～7 d 后產(chǎn)生足夠的分生孢子時(shí)，在顯微鏡下照相觀察孢子形態(tài)特征。

1.3 病原菌種群的鑒定

采 用CTAB 法提取 小麥赤 霉病菌基因組DNA，使用特 異性引 物Fg16 F（CTCCGGATATGTTGCGTCAA），F(xiàn)g16 R（GGTAGGTATCCGACATGGCAA），進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增總體系為25 μL，模板DNA1 μL，正反引物各0.5 μL，Master mix12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得出2 條PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增片段，目的片段大小分別為410 和497 bp，在410 bp 大小的為F.graminearum種群；497 bp 大小的為F.asiaticum種群。

1.4 F. graminearum 菌株產(chǎn)毒化學(xué)型檢測(cè)

1.4.1 DON 和NIV 毒素化學(xué)型檢測(cè) 用毒素特異性引物ToxP1（GCCGTGGGGRTAAAAGTCAAA）和ToxP2（TGACAAGTCCGGTCGCACTAGCA）以F.graminearum種群的DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增總體系為25 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Master mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，52 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得出2 條PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增片段，目的片段大小分別為300 和360 bp，在300 bp 大小的為產(chǎn)生DON 毒素的菌株；360 bp 大小的為產(chǎn)生NIV毒素的菌株。

1.4.2 3-AcDON 和 15-AcDON 毒素化 學(xué)型檢測(cè) 以產(chǎn)生DON 毒素的鐮刀菌菌株的DNA 為模板，利用引物對(duì)Tri303 F（GATGGCCGCAAGTGGA），Tri303 R（GCCGGACTGCCCTATTG）和Tri315 F（CTCGCTGAAGTTGGACGTAA）Tri315 R（GTCTATGCTCTCAACGGACAAC）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增總體系為25 μL，模板DNA 2 μL，正反引物各1 μL，Master mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得出2 條PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增片段，目的片段大小分別為583 和863 bp，引物Tri303F/Tri303R 擴(kuò)增出583 bp 的片段，表明該菌株產(chǎn)生3-AcDON。引物Tri315F/Tri315R 擴(kuò)增出863 bp 片段，表明該菌株產(chǎn)生15-AcDON。

1.5 病原菌的致病力鑒定

1.5.1 菌絲生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的測(cè)定 為了測(cè)定不同地理來(lái)源的禾谷鐮刀菌的侵染能力，隨機(jī)選取引起不同癥狀的菌株No.32、No.36、No.49 和No.58，利用‘衡觀35’作為接種品種，測(cè)定這些菌株的致病力。

將4 種不同的小麥赤霉病菌接種在PDA 上，在25 ℃培養(yǎng)3 d。用滅菌的打孔器沿菌落邊緣打孔，將直徑為5 mm 的菌塊接種在PDA 上，25 ℃培養(yǎng)3～4 d。每隔24 h 用交叉法測(cè)量菌落直徑。當(dāng)菌落直徑為7～8 cm 時(shí)，比較菌落的大小和形態(tài)，然后拍照。每個(gè)菌株重復(fù)3 次。利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量。

1.5.2 內(nèi)胚芽鞘接種測(cè)定病菌致病力 用1%升汞（HgCl2）消毒處理的小麥種子催芽，20 ℃培養(yǎng)2～3 d。當(dāng)胚芽鞘長(zhǎng)2～3 cm 且其幼葉未生長(zhǎng)時(shí)，選擇生長(zhǎng)勢(shì)相同的胚芽鞘，參考武愛(ài)波［14］方法進(jìn)行胚芽鞘的接種。接種7 d 后調(diào)查小麥發(fā)病情況，并測(cè)定小麥幼苗莖基部褐斑的長(zhǎng)度。根據(jù)小麥幼苗莖基部產(chǎn)生的褐斑長(zhǎng)度，將菌株致病性分為弱、中、強(qiáng)3 種類型，褐斑長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)分別為≤0.7 cm、0.7～1.0 cm 和≥1.0 cm。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.3 花期接種致病力鑒定 參考陳懷谷［15］單小花定位定量孢子懸浮液（1×105CFU/mL）進(jìn)行注射接種。按徐雍皋等［16］的方法，于接種后10 d 以5 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)觀察記載病情，以日擴(kuò)展速率（r*）進(jìn)行菌株致病力的統(tǒng)計(jì)分析。

日擴(kuò)展速率r*公式為：

式中：x=每穗病情級(jí)別：N=接種穗數(shù)；10=接種至病害調(diào)查記載時(shí)間為10 d。

田間花期接種試驗(yàn)中禾谷鐮刀菌致病力類型劃分標(biāo)準(zhǔn)為：弱，r*≤0.25；中，0.25 ＜r*＜0.35；強(qiáng)，r*≥0.35。采集的數(shù)據(jù)在α=0.05 顯著水平下，進(jìn)行各種相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 河北省小麥赤霉病病原及其特性分析

2.1.1 病原菌的分離純化 采用組織分離法，對(duì)2021 年從河北省4 市7 縣12 個(gè)地塊田間自然發(fā)病182 個(gè)小麥赤霉病病穗進(jìn)行病原菌分離，共分離純化得到90 株菌株。

2.1.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 本試驗(yàn)所分離的病原菌均具有鐮刀菌菌株的典型性狀。分離的菌株在PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)3～5 d 后，氣生菌絲生長(zhǎng)繁茂，呈白色棉狀，菌落基質(zhì)由白色漸漸漸變?yōu)檠蠹t色，中心老菌絲呈黃色（圖1a）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng)，黃色蔓延至邊緣，中心的老菌絲塌陷，緊貼培養(yǎng)基（圖1b）。初步判斷為F.spp 菌群。在綠豆培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)3 d 后，顯微鏡下鐮刀菌孢子清晰可見(jiàn)，分生孢子為無(wú)色，有2～7 個(gè)膈膜不等，多數(shù)有3～5個(gè)膈膜（圖1c）。

圖1 分離病原菌在PDA 上的培養(yǎng)性狀及分生孢子Fig. 1 Morphology of the colony and conidia of the pathogen isolated

2.1.3 鐮刀菌種群的分子鑒定 為進(jìn)一步明確分離病原菌的種類，利用特異性引物Fg16F/R 對(duì)菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，結(jié)果顯示，所有的菌株都能擴(kuò)增出1 條帶，呈現(xiàn)出1 種帶型（圖2）。鑒定結(jié)果表明，引起小麥赤霉病病原菌的類型均為F.graminearum（410 bp），且在12 個(gè)采集點(diǎn)中均分離到該類型的菌株，說(shuō)明禾谷鐮刀菌（F.graminearum）在河北省各采樣地點(diǎn)普遍存在，未鑒定出F.asiaticum。

圖2 鐮刀菌菌株的PCR 鑒定Fig. 2 PCR identification of F.spp.isolate

2.1.4 DON 與NIV 毒素化學(xué)型的鑒定 引物ToxP1/ToxP2 在毒素化學(xué)類型試驗(yàn)中區(qū)分DON 和NIV 毒素，對(duì)產(chǎn)生NIV 毒素的菌株擴(kuò)增片段為360 bp，對(duì)產(chǎn)生DON 毒素的菌株擴(kuò)增片段為300 bp。對(duì)90 株鐮刀菌菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明測(cè)試的菌株中均擴(kuò)增出產(chǎn)DON 毒素所對(duì)應(yīng)的300 bp 條帶（圖3）。鑒定結(jié)果表明小麥赤霉病的產(chǎn)毒類型為DON 毒素類型，未鑒定出NIV 毒素類型。

圖3 鐮刀菌菌株產(chǎn)生毒素化學(xué)型的PCR 鑒定Fig. 3 PCR identification of toxin chemotypes produced by F.spp.

2.1.5 3Ac-DON 與15Ac-DON 毒素化學(xué)型的鑒定 在產(chǎn)DON 毒素的菌株中，利用Tri303F/R 引物擴(kuò)增出583 bp 片段的是3Ac-DON，Tri315F/R 引物擴(kuò)增出863 bp 片段的是15Ac-DON。在90 個(gè)產(chǎn)DON 毒素的菌株中，78 個(gè)為15Ac-DON（圖4），僅有1 個(gè)為3Ac-DON（圖5），還有11 個(gè)菌株采用2 對(duì)引物并未擴(kuò)出條帶。鑒定結(jié)果表明從河北省各個(gè)地點(diǎn)采集的小麥赤霉病菌的毒素類型以15Ac-DON 為主，是優(yōu)勢(shì)毒素類型。

圖4 禾谷鐮刀菌15-AcDON 的毒素化學(xué)型分子鑒定Fig. 4 Molecular Identification of 15-AcDON toxin chemical type of F. graminearum

圖5 禾谷鐮刀菌 3-AcDON 的毒素化學(xué)型分子鑒定Fig. 5 Molecular identification of chemical type of 3-AcDON toxin produced by F. graminearum

2.2 不同病原菌致病力測(cè)定分析

2.2.1 菌絲生長(zhǎng)速率和分生孢子量的測(cè)定 選擇不同地理來(lái)源、引起不同癥狀的4 個(gè)菌株No.32、No.36、No.49、No.58 開(kāi)展致病力測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所測(cè)試4 個(gè)菌株在相同培養(yǎng)條件下，其生長(zhǎng)速率存在一定差異，分別為14.66、14.05、14.71、14.91 mm/d。經(jīng)過(guò)SPSS 顯著性分析，No.36 菌株生長(zhǎng)最慢，與其他菌株的生長(zhǎng)速度存在顯著差異。利用綠豆培養(yǎng)基對(duì)4 個(gè)菌株進(jìn)行產(chǎn)孢誘導(dǎo)，測(cè)定其產(chǎn)孢量，結(jié)果不同病原菌產(chǎn)孢量不同，其中No.49 號(hào)菌的產(chǎn)孢量最多，與No.32，No.36 號(hào)菌株存在顯著差異（見(jiàn)表1）。

表1 不同菌株的生長(zhǎng)速率及孢子產(chǎn)量Table 1 Growth rate and spore yield of different F. graminearum isolates

2.2.2 胚芽鞘接種法與田間花期接種測(cè)定病原菌的致病力 為了測(cè)定病原菌的致病力，試驗(yàn)采用胚芽鞘接種法［14］、田間花期接種［15］進(jìn)行鑒定。接種7 d 后測(cè)量不同菌株的病斑長(zhǎng)度來(lái)觀察胚芽鞘的發(fā)病情況，小麥幼苗莖基部的褐斑病長(zhǎng)度存在顯著差異（表2）。No.36 菌的病斑長(zhǎng)度最短為0.55 cm，No.49 菌引起的病斑長(zhǎng)度最長(zhǎng)，No.32、No.36 的危害速度慢，兩者差異不顯著，但與No.49、No.58 差異顯著。根據(jù)小麥幼苗莖基部褐斑的長(zhǎng)度（表2），將接種No.32、No.36、No.49、No.58 菌株的菌液的小麥致病力類型分別為弱、弱、強(qiáng)、中。

表2 胚芽鞘接種及鐮刀菌菌株致病力類型Table 2 Germinal sheath inoculation and pathogenicity type of F. graminearum

采用單小花定位定量法接種小麥麥穗，分別取表2 中列出的4 個(gè)菌株的20 μL 孢子懸浮液（1×105CFU/mL）分別接種到溫室培養(yǎng)的小麥穗，培養(yǎng)10 d后鑒定，結(jié)果表明接種小麥均產(chǎn)生赤霉病危害癥狀，但不同菌株的日擴(kuò)展速率不同。No.32、No.36、No.49 和No.58 的日擴(kuò)展速率分別為0.32、0.35、0.40和0.40，所對(duì)應(yīng)的致病力類型分別為中、中、強(qiáng)、強(qiáng)，其中No.49、No.58 的日擴(kuò)展速率與其他菌株相比，形成顯著性差異（表3）。

表3 小麥不同部位DON 毒素含量及花期接種致病力類型Table 3 Content of DON toxin in different parts of diseased wheat and the evaluation of pathogenicity at flowering stage

將接種不同菌株的麥穗分別研磨，采用ELISA試劑法對(duì)研磨樣品進(jìn)行DON 含量測(cè)定，結(jié)果表明，不同菌株之間DON 含量差異顯著，No.32、No.36、No.49 和No.58 的DON 總量分別為1 189.01、1 251.80、1 439.09 和1 397.59 μg/kg。接 種No.49菌秸稈的DON 含量最高，No.32 菌的含量最少。而莖稈中No.49 菌株的毒素含量同樣較高，但從總體來(lái)看，病原菌產(chǎn)生的毒素多存在于穎殼和穗軸中。盡管不同鐮刀菌菌株均為同一產(chǎn)毒類型，但在DON毒素的積累量上表現(xiàn)出差異。

3 結(jié)論與討論

小麥赤霉病是由鐮刀菌不同種群引起的真菌病害，但種群因地理差異不同，優(yōu)勢(shì)菌株、產(chǎn)毒類型、致病性也不同。在國(guó)內(nèi)的主要致病菌株為亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）和禾谷鐮刀菌（F.graminearum），F(xiàn).asiaticum主要分布于長(zhǎng)江中下游的溫暖地區(qū)，F(xiàn).graminearum主要分布于北方的寒冷地區(qū)。鐮刀菌的種群分布除了與溫度有關(guān)，張昊等［17］人也發(fā)現(xiàn)致病種的類型與作物輪作方式存在一定相關(guān)性，在玉米與小麥輪作的地區(qū)，禾谷鐮刀菌以F.graminearum種群為主，在水稻與小麥輪作的地區(qū)，禾谷鐮刀菌以F.asiaticum種群為主。為了明確河北省鐮刀菌的種群是否發(fā)生變化，本研究從河北省主要小麥種植區(qū)的4 市7 縣12 個(gè)麥田分離純化得到90 個(gè)鐮刀菌菌株，采用禾谷鐮刀菌的特異性引物16F/R 鑒定出1 個(gè)菌種，為F.graminearum。馬斌等［18］人的研究結(jié)果也表明河北省的主要病原優(yōu)勢(shì)菌株為F.graminearum，這些結(jié)果表明至今河北省的小麥赤霉病菌類型沒(méi)有改變。

為了進(jìn)一步明確F.graminearum的毒素類型，對(duì)90 株小麥赤霉病菌株進(jìn)行PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均為DON 型毒素，其中毒素化學(xué)型最多的是15-AcDON，有78 株，且在石家莊元氏分離獲得1 株產(chǎn)毒素類型為3-AcDON，只有極少數(shù)不能有效檢測(cè)出15-AcDON、3-AcDON 的相應(yīng)條帶，與DON毒素類型中還存在其他的毒素組成有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)在玉米中的化學(xué)型為3-AcDON 的禾谷鐮刀菌［19］；也有研究結(jié)果表明DON 毒素中主要的化學(xué)型為15-AcDON［20-21］。

在致病菌株同是F.graminearum，產(chǎn)毒類型一致的情況下，來(lái)自不同地區(qū)的致病菌株的的致病力也存在差異，本試驗(yàn)測(cè)試的4 個(gè)菌株No.32、No.36、No.49、No.58 在相同培養(yǎng)條件下菌絲生長(zhǎng)速率存在一定差異，No.36 菌株生長(zhǎng)最慢，No.49菌株的產(chǎn)孢量最多，然后No.36 的產(chǎn)孢量少。病原菌的致病力測(cè)定結(jié)果表明小麥幼苗莖基部的褐斑病長(zhǎng)度存在顯著差異。No.32、No.36、No.49、No.58菌株的致病力類型分別為弱、弱、強(qiáng)、中。用單小花定位定量法測(cè)定病原菌的致病力，發(fā)現(xiàn)不同菌株的日擴(kuò)展速率不同，No.49、No.58 的日擴(kuò)展速率最大；由于毒素是病原菌致病的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，毒素的多少與致病力強(qiáng)弱有關(guān)［22］。通過(guò)檢測(cè)小麥籽粒、穗軸、穗莖稈3 個(gè)部位的毒素積累情況，發(fā)現(xiàn)在3個(gè)部位中，No.49 的毒素含量最高，其次是No.58、No.36、No.32；3 個(gè)部位毒素積累量不同，籽粒的毒素積累量最多，其次是穗軸、穗莖稈，這一情況與徐飛［23］的結(jié)果一致；雖不同禾谷鐮刀菌菌株均為同一產(chǎn)毒類型，但在DON 毒素的積累量上表現(xiàn)出差異。致病力強(qiáng)的菌株，毒素積累量最多，表明致病力與毒素積累量呈正相關(guān)。通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、日擴(kuò)展速率，產(chǎn)毒量的多少進(jìn)行比較，明確了河北省的小麥赤霉病菌的致病力存在強(qiáng)弱差異。本研究通過(guò)分子標(biāo)記、形態(tài)鑒定等方法明確了赤霉病菌的毒性類型以及致病差異，為抗病品種的鑒定和病害的防治奠定了基礎(chǔ)。