高曉雪,王剛,宮建輝,夏新月,董彥博
北京姿美堂生物技術(shù)股份有限公司(北京 100144)
硫酸軟骨素(chondroitiulfate,CS)作為一種具有天然活性的酸性黏多糖類物質(zhì),其廣泛存在于動物的軟骨和結(jié)締組織中[1]。在臨床應(yīng)用當(dāng)中其具有調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗衰老、治療關(guān)節(jié)炎、防治冠心病等多種療效,并且不良反應(yīng)少[2-5]。此外,硫酸軟骨素被廣泛應(yīng)用于食品及化妝品中,還具有改善口感、潤滑度、吸濕性等作用[2-7]。因此,測定CS含量的分析方法對于保健食品和藥品原料及成品銷售的品質(zhì)控制非常重要。
硫酸軟骨素是由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的重復(fù)二糖單位組成的多糖。測定CS含量的常用方法有分光光度法、高效液相法和電化學(xué)分析法等[1-6]。分光光度法主要是通過利用分光光度儀測定二糖在特定條件下與試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)或沉淀。但由于糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)相似度高,且軟骨中富含多種黏多糖,干擾因素多,那么重現(xiàn)性差,而且該方法需要使用毒性較強(qiáng)的試劑,存在潛在危害[2,4]。電化學(xué)分析法對操作人員試驗素質(zhì)要求高,且試驗條件要求嚴(yán)格,專屬性比較強(qiáng)[6]。高效液相法主要是將多糖分解后進(jìn)入色譜柱利用各組分間極性差異的性質(zhì)進(jìn)行分離后檢測,該方法測定對象單一,無雜質(zhì)干擾,靈敏度高,適用性廣。已有的GB/T 20365—2006《硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定 液相色譜法》是通過用液相色譜測定硫酸軟骨素的方法[2-3,7-9]。
試驗測試品選擇氨糖軟骨素奶粉,含有大量CS,除此之外還含有其他食品成分,對測定會有較大干擾。因此,有必要建立可快速準(zhǔn)確測定氨糖軟骨素奶粉中硫酸軟骨素含量的方法。試驗以氨糖軟骨素奶粉為測試品,利用高效液相色譜儀,通過優(yōu)化提取方法、流動相流速等色譜條件建立同時測定氨糖軟骨素奶粉中CS含量的方法,并完成方法學(xué)驗證,以期更好地用于氨糖軟骨素奶粉的質(zhì)量控制。
高效液相色譜儀[島津儀器(蘇州)有限公司];電子天平(d=0.01 mg,株式會社島津制作所日本京都);電子天平[d=0.1 mg,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。
硫酸軟骨素鈉(批號140792-202003,中國食品藥品檢定研究院);D-鹽酸氨基葡萄糖(批號140649-201606,中國食品藥品檢定研究院);無水乙醇(批號20201109,天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠);戊烷磺酸鈉(批號20180761,MREDA);乙腈(批號021902,MREDA);氯化鈉(批號20190818,北京市紅星化工廠);中性氧化酶(批號515E011,Solarbio);磷酸二氫鉀(批號20180117,北京化工廠);氫氧化鈉(批號20170104,北京化工廠);氨糖軟骨素奶粉(批號20220101,北京姿美堂生物技術(shù)股份有限公司)。
色譜柱為Nncleodur C18(用極性小分子封尾,250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相A為戊烷磺酸鈉溶液,流動相B為乙腈。梯度洗脫,流速0.8 mL/min,柱溫35℃,檢測波長192 nm時,進(jìn)樣量10 μL。
2.1.1 流動相優(yōu)化
中午回媽家,一進(jìn)門我先伸出腳來嚷嚷:“媽,快看看我的高跟鞋,漂亮不?”老媽瞄了一眼撇撇嘴,笑罵道:“熊孩子,又買高跟鞋?!睕]等我坐下,老爸拿出一個紅包:“快過生日了吧?爸給錢,去買雙更好看的高跟鞋,我知道閨女就這一點嗜好。我和你媽的退休金花不完用不了,留著干啥。”
2.2.1 供試品溶液
為改善峰形、提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、保證成品質(zhì)量,對GB/T 20365—2006《硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定 液相色譜法》規(guī)定的方法中的試樣流動相進(jìn)行優(yōu)化,表1中序號1的流動相比例為國標(biāo)規(guī)定的色譜相方法。由表1和圖1可知,根據(jù)不同流動相色譜條件下硫酸軟骨素峰形及分離度,確定流動相為乙腈+戊烷磺酸鈉2+98(V/V),其他色譜條件不變。在此條件下,色譜峰形、分離度會比較好。
圖1 不同色譜條件下的色譜圖
表1 不同流動相條件考察結(jié)果
遲恒去小店買了包三十幾塊一包的“紅塔山”,拆開點燃抽了口,純,真煙,這種價的煙,在市里不熟的店子買,冷不丁就給你來包贗品。到尾砂庫東頭下游壩底后,遲恒結(jié)帳讓司機(jī)回了。河床似的、延伸很遠(yuǎn)的平地,上面只種菜,沒有建房,潰壩的話,砂流會順著河床沖跑,但河床兩旁都是房屋,地勢比河床高不了多少,如果大潰壩,從一百多米高處傾瀉而下的砂槳流勢能極大,一旦成扇型展開,這些民房極有可能會被砂流沖埋。外省一個地方尾砂礦潰壩,一次淹死下游267個人。河灘左側(cè)有條很長的渠,不像新修的,流出的水清澈,砂庫的積水、滲水一部分從這里導(dǎo)出。菜地長出的菜綠綠的挺好看。
2.2.3 陰性對照溶液
在文學(xué)作品中,環(huán)境描寫能夠襯托人物的心理、推動故事的發(fā)展。因此,在高中語文閱讀的教學(xué)中,教師要引導(dǎo)學(xué)生重視環(huán)境描寫,通過環(huán)境的描寫來分析人物。當(dāng)然,不能僅僅以自然環(huán)境為主要依托,環(huán)境描寫分為自然環(huán)境和社會環(huán)境,自然環(huán)境指自然界的景物,社會環(huán)境指體現(xiàn)社會當(dāng)時的特點的建筑物、物品或者風(fēng)俗習(xí)慣等。以我們初中學(xué)過的《故鄉(xiāng)》為例,“時候既然是深冬;漸近故鄉(xiāng)時,天氣又陰晦了,冷風(fēng)吹進(jìn)船艙中,嗚嗚的響,從篷隙向外一望,蒼黃的天底下,遠(yuǎn)近橫著幾個蕭索的荒村,沒有一些活氣。我的心禁不住悲涼起來了”,這段運(yùn)用了環(huán)境描寫,并且是自然環(huán)境。通過描寫,渲染了故鄉(xiāng)凄涼的景象,并且通過環(huán)境描寫也襯托了“我”悲涼的心情。
2.2.2 對照品溶液制備
稱取25.48 mg硫酸軟骨素鈉對照品于25 mL容量瓶中,加適量水超聲溶解,加水定刻度,作為對照品儲備液。量取5 mL對照品儲備液于10 mL容量瓶中,加水定容至刻度,為對照品使用液。
where mais the mass which is equivalent to that of the actuator;Bais the damp coefficient which is equivalent to that of the actuator;Flis the load force acting on the actuator.
拯救還是懲罰?在寫作中,卡夫卡又一次不可自拔地陷入了困境??ǚ蚩◤膩聿辉氲阶约旱奈膶W(xué)可以給世界帶來什么,他甚至無法承認(rèn)自己的文學(xué)。卡夫卡看不清自己,看不清自己的世界,找不到真正可以寄托的東西。他在“弱者”和“兒子”的影響下不可自拔,找不到自己的位置和標(biāo)準(zhǔn)時間。而這種拯救耗盡卡夫卡一生,卻無法給他指示明路。
取樣品,按2.2.1的方法制備供試品溶液,室溫放置0,2,4,6,8,10和12 h,按照2.1色譜條件測定,記錄硫酸軟骨素含量,SRSD為0.8%,表明該法重復(fù)性良好,表明供試品溶液在室溫12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
稱取25.48 mg硫酸軟骨素對照品,按照2.2.2的方法制備對照品儲備液,依次量取1,2,3,4和5 mL對照品儲備液于10 mL容量瓶中,加水定容至刻度,作為對照品標(biāo)準(zhǔn)工作液標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照該試驗優(yōu)化好的流動相色譜條件方法下測定,用峰面積(Y)對濃度(X)繪制硫酸軟骨素的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線。如表2和圖2所示。
康川司法所向社區(qū)服刑人員發(fā)放手機(jī),實行手機(jī)定位。在矯正工作開始時,服刑人員繳納500元押金后便可免費使用該手機(jī)。矯正工作結(jié)束時,服刑人員上交手機(jī)便可退還押金。
圖2 硫酸軟骨素線性范圍考察結(jié)果
表2 硫酸軟骨素的回歸方程及線性范圍
2.4.1 精密度試驗
精確稱取樣品,按2.2.2的方法制備供試品,按2.1.1的優(yōu)化后得色譜條件平行測定6次,計算結(jié)果硫酸軟骨素含量。表3測定結(jié)果表明,硫酸軟骨素的平均值(n=6)分別為2.03 g/100 g,SRSD為0.81%,表明該法精密度良好。
表3 精密度測定結(jié)果(n=6)
2.4.2 穩(wěn)定性試驗
按供試品的處方工藝和配方比例制得缺硫酸軟骨素的陰性樣品。
2.4.3 重復(fù)性試驗
取樣品6份,分別按2.2.1的方法制備供試品溶液,按照2.1的色譜條件測定,硫酸軟骨素含量1.98 g/100 g,SRSD分別為3.7%。
2.4.4 回收率試驗
將5 mg樣品溶解在10 mL水中,通過水超聲提取20 min;提取液使用微孔濾膜按10 000 r/min離心,搖勻,濾過,取續(xù)濾液。
平行分別稱取6份的樣品,各加入硫酸軟骨素鈉標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.4%)約12.8 mg,加入25 mL水,超聲20 min,按10 000 r/min離心10 min,取1 mL上微孔濾膜(3 000道爾頓),按10 000 r/min離心30 min,下清液棄去;在微孔濾膜上加入2.0 mL水,按10 000 r/min離心30 min,精確加入2.0 mL水,超聲5 min,取出過0.45 μm濾膜。按照2.1.1的色譜條件進(jìn)行測定,并計算硫酸軟骨素的加樣回收率,結(jié)果見表4。
當(dāng)前大部分民眾對金融知識不熟悉,而且缺乏法律意識,容易成為涉眾型經(jīng)濟(jì)犯罪的受害者。為了有效的預(yù)防金融問題,我國已經(jīng)制定并頒布了《商業(yè)銀行法》等相關(guān)的金融法律。其中明確的規(guī)定沒有經(jīng)過中國人民銀行批準(zhǔn)的,擅自設(shè)置非法吸收存款或者設(shè)置商業(yè)銀行等行為都要追究相應(yīng)的法律責(zé)任,并對相關(guān)的行為制定罪名。但是部分民眾由于法律意識不足,對非法集資的行為認(rèn)識不清,將非法投資誤認(rèn)為是正常的投資行為,進(jìn)而成為非法集資的犧牲品。
表4 回收率測定結(jié)果(n=6)
2.4.5 檢出限和定量限
取2.3的最低濃度的混合對照品溶液,用水逐步稀釋并進(jìn)行測定,分別按2.1.1的色譜條件進(jìn)行測定,記錄信號強(qiáng)度與噪音強(qiáng)度的比值,將信號強(qiáng)度和噪音強(qiáng)度之比約為3倍信噪比和10倍信噪比作為檢出限和定量限,硫酸軟骨素的檢出限為1.50 μg/mL,定量限為16.23 μg/mL。結(jié)果表明,試驗方法測得的方法檢出限和方法定量限均小于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限和定量限,試驗方法測定硫酸軟骨素的靈敏度較高,能夠滿足含量測定的需要。
2.4.6 樣品含量測定
《雷雨》是曹禺先生在“沒有太陽的日子里的產(chǎn)物”,無論是哪一個女性形象,都是以悲劇結(jié)局收尾。這場命中注定的雷雨,這場無法回避的悲劇,將人世間一切的丑惡揭露開來,無論什么人都無法逃脫命運(yùn)的囹圄。好一場雷雨,于黑暗中訴說了一個家庭的悲劇,展示了人性的扭曲,揭露了殘酷的現(xiàn)實!它是一場暴風(fēng)雨,是一場文字的雷雨,字字血淚,擲地有聲!四鳳死了,繁漪瘋了,侍萍生不如死。一場雷雨,花謝知多少?花非花,似花,非花無花,夢中淚花,一場雷雨,夢碎一場空;夢非夢,似夢非夢,無夢,夢碎一場空!三十年,走完一場悲哀。
取4批次樣品,分別按2.2.1的方法制備供試品溶液,每批平行3份,按2.1.1的色譜條件測定,記錄峰面積,按外標(biāo)法計算硫酸軟骨素含量,結(jié)果見表5。
表5 供試品含量測定結(jié)果
試驗根據(jù)硫酸軟骨素的理化性質(zhì),分別考察不同提取溶劑(水、不同比例乙腈-水)、提取方法(超聲、酶解)。結(jié)果表明:水作為提取溶劑時,硫酸軟骨素的峰形較好;超聲成分含量影響無顯著性差異,并且超聲提取法提取效率高,時間短,操作簡單,被廣泛用于供試品溶液的制備。最終確定:采用水超聲提取20 min;提取液使用微孔濾膜(3 000道爾頓)10 000 r/min離心作為提取條件。
由于硫酸軟骨素的檢測波長為192 nm,而甲醇在低波長處有較高的紫外吸收值,因此采用乙腈作為有機(jī)相。試驗考察不同比例的乙腈-戊烷磺酸鈉溶液作為流動相,發(fā)現(xiàn)流動相為乙腈-戊烷磺酸鈉2+98(V/V)作為流動相系統(tǒng),梯度洗脫時分離效果最佳,且可改善峰形。
試驗采用HPLC梯度洗脫-波長切換法對氨糖軟骨素奶粉中的硫酸軟骨素進(jìn)行含量測定,相比現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn),影響因素少,且能真實反映硫酸軟骨素含量,對氨糖軟骨素奶粉的質(zhì)量控制有一定參考價值。