刁玉巧 王儉 朱秀麗 陳健 鄭鈺 江蓮 劉月平 戴若恒 閆祎煒

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院兒科，河北石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，河北石家莊 050000）

淋巴瘤是兒童第三大常見腫瘤［1］，根據(jù)病理形態(tài)可分為霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma,HL）及非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma,NHL），其中NHL 約占兒童淋巴瘤的80%［2］。NHL在兒童中發(fā)病大多數(shù)為彌漫性、高度惡性，進展快，確診時臨床分期多為晚期。越來越多證據(jù)表明，組蛋白去甲基化酶導(dǎo)致的組蛋白甲基化異常在多種生物過程中起著至關(guān)重要的作用，這些過程常與癌癥的發(fā)生有關(guān)［3-4］。含jumonji結(jié)構(gòu)域的蛋白（jumonji domain-containing protein, JMJD）2B 是組蛋白去甲基化酶JMJD 家族成員之一，其過度表達與腫瘤惡性增殖相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)JMJD2B在乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌和肝細胞癌等多種癌癥中存在過表達［5-8］。

缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-lα）是在低氧條件下穩(wěn)定和改變腫瘤細胞代謝的重要成分之一。研究表明，HIF-1α 通過促進腫瘤遷移、侵襲和血管生成，調(diào)節(jié)pH 和葡萄糖代謝，從而在多種腫瘤中過表達［9］，HIF-lα可能參與淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展過程的調(diào)控［10］。目前有關(guān)JMJD2B在兒童NHL的研究尚未見報道。本研究通過免疫組化檢測JMJD2B 和HIF-1α 在兒童NHL 組織中的表達，分析二者與NHL 患兒臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系以及在NHL 組織中二者表達的相關(guān)性，探討二者在兒童NHL 發(fā)生發(fā)展中的作用，為該病的診斷、預(yù)后判斷及靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院兒科2013—2022 年經(jīng)病理確診的46 例NHL 患兒作為觀察組，以24 例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患兒作為對照組。觀察組和對照組患兒年齡均為0～18歲。

收集患兒性別、年齡、淋巴瘤St.Jude 分期及病理分型、有無B 癥狀、血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH） 水平、 國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index, IPI）評分等資料。淋巴瘤診斷、St.Jude 分期及分型參照2016 版世界衛(wèi)生組織造血與淋巴組織腫瘤分類標準進行［11］。B 癥狀包括：（1）無其他原因6 個月內(nèi)體重減少＞10%；（2）近30 d 內(nèi)無原因反復(fù)發(fā)熱＞38.0℃；（3）夜間盜汗。根據(jù)患兒年齡、體力狀況、臨床分期、淋巴結(jié)外受侵的部位數(shù)目及LDH 水平，將IPI評分分為低度危險（0～2分）和高度危險（3～5分）［10］。本研究已通過河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會審批（2020ky228）。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法檢測JMJD2B 和HIF-1α

取觀察組和對照組石蠟組織標本進行切片、脫蠟、水化，將切片放入3% 過氧化氫溶液中滅活，置于檸檬酸抗原修復(fù)液（10 mM，pH 6.0）中進行抗原修復(fù)，滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育，滴加JMJD2B鼠單克隆抗體、HIF-1α兔多克隆抗體（濃度分別為1∶150、1∶200）一抗，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，加入生物素標記山羊抗兔工作液（濃度1 mg/mL）二抗，37℃孵育1 h，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育1 h。DAB顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，脫水、封片，光學(xué)顯微鏡鏡檢。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。

結(jié)果判讀：所有病理切片由2位資深病理科專家分別判讀。隨機選擇5個（10×20）視野，每個視野計數(shù)100個細胞中陽性染色細胞。根據(jù)染色程度評價染色強度：0 分為染色陰性，1 分為輕度染色，2 分為中度染色，3 分為強染色；根據(jù)切片中陽性細胞百分比進行評分：無陽性細胞計0 分，≤25%計1 分，26%～50%計2 分，＞50%～100%計3分。最后總評分=陽性強度評分×陽性百分比評分。總評分為0分定為陰性，1～2分、3～4分、6～9分分別標為+、++、+++，并將+、++、+++定為陽性［6，8，10］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 27.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。JMJD2B表達與HIF-1α表達的相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

觀察組46例患兒中，男27例，女19例，平均年齡（8.9±3.6）歲。對照組24 例患兒中，男15例，女9 例，平均年齡（9.1±3.8）歲。兩組間性別和年齡的比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.095，P=0.758；t=-0.276，P=0.783）。

2.2 JMJD2B和HIF-1α的表達情況

觀察組JMJD2B陽性表達率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表1 和圖1。觀察組HIF-1α 陽性表達率亦高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表1和圖2。

圖1 對照組和觀察組的JMJD2B表達（×200） 對照組（A）及觀察組（B）淋巴結(jié)石蠟切片的細胞核內(nèi)均可見JMJD2B 表達，觀察組JMJD2B 表達高于對照組。顆粒狀淺黃或棕黃色為JMJD2B 陽性表達（箭頭所示）。［JMJD2B］含jumonji 結(jié)構(gòu)域的蛋白2B。

圖2 對照組和觀察組的HIF-1α 表達（×200） 對照組（A）及觀察組（B）淋巴結(jié)石蠟切片的細胞核內(nèi)均可見HIF-1α表達，觀察組HIF-1α表達高于對照組。顆粒狀淺黃或棕黃色為陽性表達（箭頭所示）。［HIF-1α］缺氧誘導(dǎo)因子1α。

表1 觀察組及對照組JMJD2B和HIF-1α的陽性表達情況［例（%）］

2.3 JMJD2B和HIF-1α在NHL患兒組織中的表達與臨床特征的關(guān)系

JMJD2B 表達與NHL 患兒血清LDH 水平及IPI危險度相關(guān)（均P＜0.05），與患兒性別、年齡、病理分型、St.Jude 分期及有無B 癥狀無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

表2 JMJD2B和HIF-1α表達與NHL患兒臨床特征的關(guān)系［例（%）］

HIF-1α表達同JMJD2B一樣，與NHL患兒血清LDH 水平及IPI 危險度相關(guān)（均P＜0.05），與患兒性別、年齡、病理分型、St.Jude分期、有無B癥狀無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

2.4 JMJD2B與HIF-1α在NHL患兒組織中表達的相關(guān)性

Spearman 秩相關(guān)分析顯示，JMJD2B 與HIF-1α在NHL 患兒組織中的表達呈正相關(guān)（rs=0.333，P=0.024）。

3 討論

淋巴瘤是一組以淋巴結(jié)和/或淋巴結(jié)外受累為特征的淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，兒童NHL 多為高侵襲性、高度惡性腫瘤，往往起病突然，生長迅速，臨床進展快，病情重，部分患兒發(fā)病早期即可出現(xiàn)死亡［12］。因此，臨床需尋找新的生物標志物探討其發(fā)病機制、早期診斷、預(yù)后判斷及干預(yù)。

JMJD2 家族蛋白包含2A、2B、2C、2D 4 個成員，能夠識別二甲基化和三甲基化H3K9、H3K36和三甲基化H1.4K26作為底物，引起以上蛋白的去甲基化。大多數(shù)JMJD 家族成員已被證實是白血病和實體瘤的致癌基因，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［13］，可促進腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。Toyokawa 等［14］通過免疫組化方法檢測到JMJD2B在肺癌中過表達，且陽性表達主要為核染色。苗曉紅［15］研究表明，JMJD2B在宮頸癌組織中表達上調(diào)，且與腫瘤直徑、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤程度有關(guān)，可作為宮頸癌預(yù)后的預(yù)測指標。本研究結(jié)果顯示：觀察組JMJD2B陽性表達主要為核染色，其陽性表達率顯著高于對照組，提示JMJD2B在兒童NHL發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用，可作為兒童NHL輔助診斷指標。這與既往國內(nèi)外研究［13-15］結(jié)果一致。

JMJD2B在腫瘤中發(fā)揮作用可能通過以下機制。（1） 參與腫瘤細胞凋亡：研究證實通過應(yīng)用JMJD2B 抑制劑SD49-7，抑制H3K9 的甲基化水平可促進腫瘤細胞凋亡［5］。有研究發(fā)現(xiàn)在彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中組蛋白H3K9 甲基化表達增高［16］。（2）可調(diào)節(jié)細胞周期：研究表明，在結(jié)直腸癌中，JMJD2B 表達能夠通過誘導(dǎo)細胞發(fā)生G2/M 或者G0/G1 期阻滯從而導(dǎo)致腫瘤細胞增殖，并促進線粒體膜的破壞，導(dǎo)致來自于線粒體和Caspase-9、Caspase-3 的細胞色素C 的分裂［17］。（3）參與多種信號通路促進腫瘤細胞生長：有研究證實JMJD2B 可通過調(diào)節(jié)Wnt/β 鏈、TGF-β、Notch和PI3K通路促進腫瘤細胞生長［7］。上述通路的異常激活在NHL發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮重要作用［18］。（4）參與腫瘤血管生成：實驗表明JMJD2B可以上調(diào)HIF-1α 的表達；可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子A表達，且血管內(nèi)皮生長因子A作為促進血管生成的特異調(diào)節(jié)因子，在NHL中呈高表達［19-20］。

LDH 是一種細胞內(nèi)糖酵解酶，廣泛存在于人體組織中。當正常組織惡變后，由于腫瘤細胞損傷及能量代謝障礙機制，腫瘤細胞釋放LDH增多，導(dǎo)致血清LDH 增高。研究表明血清LDH 水平在NHL 患者中可明顯升高［21］；LDH 水平對NHL 患者生存時間有顯著影響，可作為評估NHL 分期及預(yù)后的可靠指標［22］。

IPI是由國際NHL預(yù)后因素協(xié)作組于1993年提出的一個淋巴瘤預(yù)后判斷模型，可用來指導(dǎo)選擇治療方案，也可用來判斷預(yù)后，危險度越高，代表預(yù)后越差［10］。

本研究結(jié)果顯示兒童NHL組織中JMJD2B表達與患兒血清LDH 水平及IPI 危險度相關(guān)，提示JMJD2B 可判斷兒童NHL 病情程度、評估預(yù)后。Bur等［23］在對經(jīng)典HL患者的研究中發(fā)現(xiàn)，JMJD2B的表達可能與經(jīng)典HL的侵襲性亞型有關(guān)，且預(yù)示較差的無事件生存率。

Lu等［6］在對肝癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，JMJD2B表達與性別和年齡無關(guān)，與組織學(xué)分級和轉(zhuǎn)移分期相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：JMJD2B在兒童NHL中的表達與患兒性別、年齡、淋巴瘤病理分型及St. Jude 分期均無關(guān)；JMJD2B 表達在兒童NHLⅢ、Ⅳ期的陽性率均高于Ⅱ期，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與樣本量較少相關(guān)。

HIF-1α 已被證實在多種腫瘤中表達上調(diào)，如多形性膠質(zhì)母細胞瘤、黑色素瘤、肝癌、非小細胞肺癌、前列腺癌及甲狀腺癌等［24-29］。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α表達在觀察組陽性率高于對照組，提示HIF-1α 在兒童NHL 發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。蔣潔等［30］研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在NHL中呈高表達。本研究與既往國內(nèi)研究［24-30］結(jié)果一致。

HIF-1α在腫瘤中發(fā)揮作用可能通過以下機制。（1）參與多種信號通路；在彌漫性大B細胞淋巴瘤中，HIF-1α可通過所介導(dǎo)的PI3K/AKT等多種信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［31］。（2）參與多種靶基因及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控；BACH2 是一種B細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在套細胞淋巴瘤中，HIF-1α 通過促進BACH2 轉(zhuǎn)錄從而促進腫瘤細胞存活［32］。（3）參與腫瘤血管生成，調(diào)節(jié)糖酵解：研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α-VEGF 模式在兒童NHL 病變中起重要作用［33］。（4） 參與腫瘤細胞侵襲、凋亡。（5）增加腫瘤細胞化療耐藥性：抗凋亡蛋白Bcl-xL已被證實與多種藥物耐藥有關(guān)，該蛋白受轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α 調(diào)控。在NHL 細胞中，Bcl-xL 通過HIF-1α的表達可導(dǎo)致患者化療耐藥性的發(fā)生［34］。

蘇玉璇等［35］發(fā)現(xiàn)，在彌漫性大B 細胞淋巴瘤組織中，HIF-1α 表達與Ann Arbor 分期和IPI 相關(guān)；胡露露等［36］研究證實，在口腔頜面部淋巴瘤患者中，HIF-1α表達與血清LDH水平相關(guān)。蔣潔等［30］研究發(fā)現(xiàn)，在NHL中，HIF-1α表達在B細胞型與T細胞型之間無顯著性差異。本研究結(jié)果顯示HIF-1α 在兒童NHL 中的表達與患兒性別、年齡、淋巴瘤病理分型、淋巴瘤St. Jude 分期及有無B 癥狀均無關(guān)；其表達與NHL患兒血清LDH水平及IPI危險度相關(guān)，與國內(nèi)外研究結(jié)果［30，35-36］一致。這提示HIF-1α可輔助判斷NHL患兒的病情程度和預(yù)后。

JMJD2B是HIF-1α下游靶點分子，HIF-1α誘導(dǎo)的JMJD2B表達有助于增強缺氧基因表達和腫瘤生長［37-38］。JMJD2B 可以通過催化啟動子H3K9 去甲基化，上調(diào)HIF-1α的表達［39］，影響腫瘤細胞增殖或凋亡，在癌癥血管生成和腫瘤分化中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤及喉癌組織中JMJD2B和HIF-1α 表達呈正相關(guān)［40-41］；在結(jié)直腸癌中，JMJD2B 和HIF-1α 表達呈正相關(guān)，且HIF-1α 能通過增強JMJD2B的表達影響結(jié)直腸腫瘤細胞增殖活性［42］。本研究顯示，JMJD2B 與HIF-1α 在兒童NHL組織中的表達呈正相關(guān)，提示JMJD2B及HIF-1α可能在兒童NHL發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同作用。

綜上所述，JMJD2B和HIF-1α在兒童NHL組織中表達增高，二者在兒童NHL 發(fā)生發(fā)展過程中可能起協(xié)同作用；JMJD2B 可作為新的生物標志物輔助診斷兒童NHL、評估其病情程度、指導(dǎo)治療、預(yù)測預(yù)后，同時也為兒童NHL的治療提供新靶點。