解夢晴,伍 晴,趙應茍,王春萍,田小麗, 張紹勇,2,王繼棟,2,王瑞俊,2

(1.湖州師范學院 生命科學學院,浙江 湖州 313000; 2.浙江省媒介生物學與病原控制重點實驗室, 浙江 湖州 313000; 3.麗水市蓮都區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,浙江 麗水 323000)

0 引 言

圖1 Morindolestatin的結構

咔唑類生物堿是一類具有等電子結構的二苯胺分子雜環(huán)化合物,作為醫(yī)藥、農(nóng)藥化學產(chǎn)品的中間體被廣泛應用于相關領域[1-2].天然的咔唑類生物堿主要從蕓香科植物中分離得到,具有抗微生物、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性[3-6].除植物外,鏈霉菌代謝產(chǎn)物也是天然咔唑類生物堿的重要來源之一.自1977年具有咔唑并吲哚結構的星形孢菌素(staurosporine)被發(fā)現(xiàn)后[7],從鏈霉菌中又陸續(xù)分離得到許多天然的咔唑類生物堿[8-9].Carquinostatin A是一種從鏈霉菌Streptomycesexfoliatus2419-SVT2中分離出來的獨特的咔唑類生物堿,它不僅具有有效的神經(jīng)元細胞保護物質,還顯示出自由基清除活性[10].Streptocarbazoles A是一種從海洋鏈霉菌中分離得到的新的吲哚咔唑類生物堿,其對人的白血病細胞株HL-60有較好的抑制作用[11].王可等經(jīng)過活性追蹤,從硝孢鏈霉菌發(fā)酵液中分離得到吲哚咔唑生物堿,其對多種害蟲同時具有很強的觸殺和胃毒活性[12-13].Cheng等從海綿來源的鏈霉菌StreptomycesdiacarniLHW51701 中分離得到 4 種新的咔唑生物堿,其化合物CCB-C對包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)在內的多種病原微生物具有抑制活性[14].因此,將鏈霉菌來源的咔唑生物堿作為咔唑的重要衍生物,具有極其重要的研究價值.

本課題組在前期篩選具有抗菌活性的放線菌中,發(fā)現(xiàn)鏈霉菌新種HUZ0001有較好的抗菌活性,其發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的生長有明顯的抑制作用,并從該菌株的發(fā)酵液中分離得到一種新型的咔唑類生物堿morindolestatin(圖1),經(jīng)活性測試,發(fā)現(xiàn)該化合物對自由基誘導的脂質過氧化和自由基清除活性有一定的抑制作用[15].為進一步提高morindolestatin的發(fā)酵效價,本文以產(chǎn)morindolestatin的菌株Streptomycessp.HUZ0001為研究對象,對其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化,從而為提高morindolestatin發(fā)酵效價提供數(shù)據(jù)參考.

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

潔凈工作臺(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)、INC821C微生物培養(yǎng)箱(日本YAMATO公司)、ZWY-2102C型搖床(上海智誠分析儀器制造有限公司)、Aglient 1260II高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)、RE-52A旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、立式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)、電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司).

Morindolestatin(95.8%,由浙江省媒介生物學與病原控制重點實驗室提供)、酵母抽提物(美國BD公司)、麥芽抽提物(美國BD公司)、黃豆粉(上海源葉生物科技有限公司)、棉籽餅粉(北京鴻潤寶順科技有限公司)、色譜甲醇(色譜純,美國天地TEDIA化學試劑公司)、水為去離子水,其余試劑(分析級)均購于國藥集團化學試劑有限公司.

1.2 供試菌株

鏈霉菌菌株HUZ0001(菌種保藏編號為 CGMCC No.15461),保存于浙江省媒介生物學與病原控制重點實驗室菌種庫.

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:麥芽抽提1%、酵母抽提物0.4%、葡萄糖0.4%、CaCO30.4%、調節(jié)pH 7.2～7.4.參考相關文獻報道的鏈霉菌發(fā)酵條件[16-18],采用的發(fā)酵培養(yǎng)基A～H見表1.

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方

1.4 菌株HUZ0001發(fā)酵液的制備與處理

種子液培養(yǎng):將菌株HUZ0001置于ISP2固體培養(yǎng)基平板上劃線接種,28 ℃培養(yǎng)7 d;將培養(yǎng)好的菌株接種于種子培養(yǎng)基中,其裝液量為50 mL/250 mL,28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)3 d.

發(fā)酵培養(yǎng):以5%的接種量,在8種發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液,其裝液量為200 mL/1 000 mL,28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d,得到發(fā)酵液,每種處理重復5次.

發(fā)酵液處理:在菌株的發(fā)酵液中加入2倍體積的乙醇,并用超聲提取2次(30 min/次),重復3次,之后過濾收集乙醇提取液,并將乙醇提取液減壓蒸至20 mL左右,再用乙酸乙酯萃取3次(20 mL/次),合并萃取液,旋蒸蒸干后溶于3 mL的甲醇中,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾,4 ℃ 保存?zhèn)溆?

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化與驗證

在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上,采用單因素試驗和正交設計實驗,優(yōu)化搖瓶發(fā)酵參數(shù)配比[19-21].選擇發(fā)酵時間、接種量、裝液量、溫度、轉速等參數(shù),初步確定在不同發(fā)酵參數(shù)下發(fā)酵液中morindolestatin的含量,以確定發(fā)酵條件范圍.

接種量試驗:設置接種量參數(shù)為2%、4%、6%、8%、10%,在28 ℃、180 r/min發(fā)酵條件下培養(yǎng)8 d.

轉速試驗:在接種量的基礎上,將發(fā)酵轉速分別設置為160、180、200、220、240 r/min,在28 ℃下振蕩培養(yǎng).

裝液量試驗:在接種量和轉速的基礎上,在1 000 mL錐形瓶中分別裝入100、200、300、400、500 mL液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng).

培養(yǎng)時間試驗:在接種量、轉速和裝液量的基礎上,發(fā)酵時間設置為2、4、6、8、10 d,在28 ℃下振蕩培養(yǎng).

發(fā)酵溫度試驗:在接種量、轉速、裝液量和發(fā)酵時間的基礎上,設置溫度25、28、31、34、37 ℃進行發(fā)酵培養(yǎng).

根據(jù)上述單因素結果,采用正交試驗,選擇不同因素和水平進行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化,并以優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進行發(fā)酵驗證.

1.6 morindolestatin含量的檢測

為分析在不同發(fā)酵條件下發(fā)酵培養(yǎng)液中morindolestatin的含量,通過高效液相色譜法,以morindolestatin標準品作為對照,配制0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL濃度的溶液進行液相分析,并建立標準曲線,根據(jù)樣品峰面積/標準液峰面積×標準液濃度×稀釋倍數(shù)計算效價(titer),其發(fā)酵含量取3次平均值.

液相色譜分析條件:固定相為Aglient XDB C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動相為超純水(A)和甲醇(B)的混合液,梯度洗脫(0～10 min時為90% A～70% A;10～20 min時為70% A～40% A;20～30 min時為40% A～0% A;31～40 min時為90% A),流速為1 mL/min,柱溫為25 ℃,檢測波長為220/254 nm,進樣量為20 μL.

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示,組間比較采用t檢驗.

2 結果與討論

2.1 最適發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

通過高效液相色譜分析8種發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵后,其發(fā)酵液中morindolestatin的含量,結果表明:發(fā)酵培養(yǎng)基D在發(fā)酵后,其morindolestatin含量最高(圖2),為1.112 2±0.007 9 mg/L,顯著高于其他7種發(fā)酵培養(yǎng)基;G發(fā)酵培養(yǎng)基不產(chǎn)生morindolestatin.由此可以確定,D發(fā)酵培養(yǎng)基為鏈霉菌新種菌株HUZ0001產(chǎn)morindolestatin的最適發(fā)酵培養(yǎng)基.

圖2 不同發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵液中morindolestatin的含量

2.2 單因素搖瓶發(fā)酵參數(shù)對菌株HUZ0001產(chǎn)morindolestatin的影響

以培養(yǎng)基D為發(fā)酵培養(yǎng)基,分別在不同接種量、轉速、裝液量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度下進行發(fā)酵,以考察其對發(fā)酵液中morindolestatin產(chǎn)量的影響.結果表明,不同接種量、轉速、裝液量、發(fā)酵時間對morindolestatin產(chǎn)量的影響差異較大,而發(fā)酵溫度對其影響差異較小(圖3).其具體表現(xiàn)為:在探究接種量影響的實驗中,5種接種量發(fā)酵液的morindolestatin含量分別為0.204 5±0.010 4、0.795 9±0.016、0.123 2±0.007 9、0139 8±0.021 3、0.103 8±0.005 6 mg/L,其中2%～6%的接種量范圍較好;在轉速為180～220 r/min的發(fā)酵條件下,morindolestatin的含量在0.372 4±0.016 6～0.811 8±0.013 0 mg/L之間,在轉速為220 r/min的發(fā)酵條件下,morindolestatin的含量更高;在不同裝液量的發(fā)酵條件下,morindolestatin的含量隨著裝液量的增加先增加后減小,其中在100 mL/1 000 mL和200 mL/1 000 mL裝液量的條件下,morindolestatin的含量相對較高,分別為0.816 3±0.012 5 mg/L和1.357 4±0.018 mg/L;在發(fā)酵2、4、6、8、10、12、14 d條件下,morindolestatin的含量分別為0.085 8±0.016 3、0.296 0±0.009 6、1.579 5±0.011 5、1.305 7±0.007 4、0.954 7±0.003 8、1.034 9±0.001 3、0.207 3±0.007 0 mg/L,其中培養(yǎng)6～8 d后,含量明顯高于其他處理,而培養(yǎng)時間過長,目標化合物產(chǎn)量會減少;在不同溫度下培養(yǎng)6 d后,morindolestatin的含量呈先增加后減少的趨勢,含量分別為1.367 1±0.014 2、2.179 9±0.033 3、1.433 3±0.005 7、1.158 3±0.012 9、0.775 2±0.007 0 mg/L.在25～30 ℃發(fā)酵條件下,morindolestatin產(chǎn)量相對穩(wěn)定,而在28 ℃發(fā)酵條件下,其產(chǎn)量最高.

圖3 不同發(fā)酵條件對化合物morindolestatin含量的影響

2.3 正交試驗設計不同搖瓶發(fā)酵參數(shù)對菌株HUZ0001產(chǎn)morindolestatin的影響

鑒于各發(fā)酵條件間可能對菌株產(chǎn)morindolestatin的含量存在交互影響,因此在單因素發(fā)酵參數(shù)發(fā)酵效果的基礎上,以培養(yǎng)基D為發(fā)酵培養(yǎng)基,在發(fā)酵溫度28 ℃的條件下,采用4因素3水平正交表進行正交實驗設計,見表2.

表2 正交設計因素水平表

根據(jù)正交設計助手軟件分析和4因素3水平正交試驗結果,按極差R值大小確定4因素對菌株HUZ0001產(chǎn)morindolestatin含量影響的主次順序:接種量、轉速、裝液量、發(fā)酵時間.各因素取morindolestatin含量最高水平,從而篩選出搖瓶優(yōu)化發(fā)酵條件配方為A2B2C2D1,即在培養(yǎng)基D為發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度為28 ℃的條件下,最優(yōu)化的發(fā)酵條件為:接種量為4%、轉速為220 r/min、裝液量為200 mL/1000 mL、發(fā)酵時間為6 d,具體見表3.

表3 4因素3水平正交試驗結果表 L9(34)

2.4 優(yōu)化發(fā)酵條件的驗證

分別在菌株HUZ0001優(yōu)化前后進行10批次搖瓶發(fā)酵.以發(fā)酵液中morindolestatin含量為檢測指標,優(yōu)化組發(fā)酵液的平均發(fā)酵水平為2.179 9±0.033 3 mg/L,對照組發(fā)酵液的平均發(fā)酵水平為1.112 2±0.007 9 mg/L,優(yōu)化組較對照組提高196%.這表明在優(yōu)化發(fā)酵條件后,菌株HUZ0001中產(chǎn)morindolestatin的含量顯著提高,優(yōu)化效果顯著,見表4.

表4 驗證試驗結果(n=10)

3 結論與討論

采用單因素實驗和正交設計實驗,對鏈霉菌HUZ0001產(chǎn)morindolestatin的關鍵影響因素和發(fā)酵培養(yǎng)基,以及關鍵參數(shù)的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化進行研究,確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基,其成分為:2%可溶性淀粉、1%棉籽餅粉、0.5%酵母抽提物、0.5%麥芽提取物、0.2% MgSO4·7H2O、0.2% NaCl、0.2% CaCO3,pH 7.2～7.4.最適發(fā)酵條件為:接種量為4%、裝液量為200 mL/1 000 mL、發(fā)酵時間為6 d、發(fā)酵溫度為28 ℃、轉速為220 r/min、發(fā)酵周期為24 h.通過發(fā)酵條件的優(yōu)化和驗證,最終檢測鏈霉菌HUZ0001產(chǎn)morindolestatin含量為2.179 9±0.033 3 mg/L,較優(yōu)化前發(fā)酵液中morindolestatin含量(1.112 2±0.007 9 mg/L)提高196%.

咔唑類生物堿是一類結構多樣的天然產(chǎn)物,該類化合物結構獨特,在 C-4 具有氮取代基,并顯示出比維生素E更優(yōu)異的抗氧化作用,已引起化學家和生物學家的注意[4,22-23].到目前為止,現(xiàn)存于自然界的antiostatin咔唑類似物,僅8種在藍鏈霉菌 2007-SV112中被發(fā)現(xiàn)[24].本研究從鏈霉菌HUZ0001發(fā)酵液中得到的morindolestatin,是第一個天然產(chǎn)生的吲哚并咔唑antiostatin類生物堿,其對自由基誘導的脂質過氧化和清除自由基活性均有較強的抑制作用.本實驗結果可為morindolestatin發(fā)酵產(chǎn)量的提高提供參考依據(jù).