張立杰 謝麗雪 張小艷 李韜 黃立新

摘要：為明確不同藍(lán)莓品種間的遺傳關(guān)系，利用ISSR標(biāo)記對(duì)64個(gè)藍(lán)莓品種進(jìn)行DNA指紋分析，構(gòu)建藍(lán)莓品種的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。從60條ISSR引物中篩選出9條重復(fù)性穩(wěn)定的多態(tài)性引物，共擴(kuò)增出條帶161條，其中多態(tài)性條帶159條，平均多態(tài)百分率達(dá)98.8%，引物 UBC841 可將 64 個(gè)藍(lán)莓品種區(qū)分開。利用擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)0.568的水平可將試材分為3個(gè)類群，并對(duì)其遺傳關(guān)系進(jìn)行探討。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓；品種；ISSR；指紋圖譜；遺傳關(guān)系

中圖分類號(hào)：S682.31? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2095-5774（2023）01-0011-07

ISSR Analysis of 64 Blueberry Cultivars

Zhang Lijie1，Xie Lixue1，Zhang Xiaoyan1，Li Tao1*，Huang Lixin2

（1Fruit Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China；

2 Shaowu Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs，Nanping，F(xiàn)ujian 354000，China）

Abstract：In order to clarify genetic relationship of different cultivars of blueberry，the inter-simple sequence repeat（ISSR）method was applied to analyze the DNA fingerprinting of 64 blueberry cultivars，and a fingerprints database was constructed. Nine ISSR primers，with high polymorphisms and good repeatability，were selected from 60 ISSR primers. Total 161 DNA bands were amplified，159 of which were polymorphic ，the average polymorphism percentage was 98.8%. These varieties could be satisfactorily distinguished by a single ISSR primer UBC841. UPGMA algorithm showed that 64 cultivars could be clustered into 3 groups using a genetic similarity coefficient threshold of 0.568，and their genetic relationships was evaluated .

Key words：Blueberry；Cultivars；ISSR；DNA fingerprinting；Genetic relationships

藍(lán)莓，又名越橘、藍(lán)漿果，為杜鵑花科 （Ericaceae） 越橘屬 （Vaccinium） 植物。藍(lán)莓被喻為世界第三代水果，可果實(shí)鮮食、加工或作為高級(jí)化妝品原料。藍(lán)莓因其集約化、精細(xì)化栽培、符合現(xiàn)代果業(yè)要求且價(jià)格優(yōu)勢(shì)明顯，成為中國新興果業(yè)的代表，各個(gè)省份都在大力發(fā)展。

福建省屬亞熱帶季風(fēng)氣候，土壤多為酸性的紅壤、黃壤且有機(jī)質(zhì)含量高，適合南高叢和兔眼藍(lán)莓的生長(zhǎng)。福建為藍(lán)莓發(fā)展新區(qū)，早期種植多以民間引種試種為主，規(guī)模小，多點(diǎn)開花。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2016年，福建省藍(lán)莓栽培面積約800 hm2，投產(chǎn)不足300 hm2，主要分布在龍巖、寧德、福州等地。栽培品種多樣，包括‘奧尼爾‘夏普藍(lán)‘密斯提‘萊格西‘威爾‘海岸‘頂峰‘燦爛‘園藍(lán)‘粉藍(lán)‘精華‘杰兔‘烏達(dá)德等。隨著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和種植面積的增加，藍(lán)莓品種和苗木市場(chǎng)混雜的問題日益突出，部分北高叢藍(lán)莓品種如‘杜克‘南豐等也被引入，給相關(guān)藍(lán)莓種植戶造成極大損失。為此，開展藍(lán)莓品種的鑒定評(píng)價(jià)成為福建藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切問題。

由DNA分子標(biāo)記衍生的DNA指紋技術(shù)在鑒定品種真實(shí)性和純度等方面是很有效的，其中ISSR 標(biāo)記是一種簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，目前已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定［1］、遺傳圖譜構(gòu)建［2］及遺傳多樣性研究［3-4］等。該技術(shù)已運(yùn)用于構(gòu)建蘋果［5］、杏［6］、柑橘［7］、枇杷［8］、龍眼［9］、火龍果［10］、獼猴桃［11］等果樹的指紋圖譜。本研究應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)64個(gè)藍(lán)莓品種的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，建立DNA指紋圖譜，為藍(lán)莓品種調(diào)查、鑒別及藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)合理布局服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取64個(gè)藍(lán)莓品種（表1），其中南高叢品種12個(gè)，北高叢品種34個(gè)，半高叢品種3個(gè)，兔眼品種11個(gè)，矮叢3個(gè)品種來自浙江藍(lán)美農(nóng)業(yè)有限公司，取其嫩葉作為研究試材。

1.2 藍(lán)莓葉片DNA提取

采用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行藍(lán)莓葉片DNA提取，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的質(zhì)量和濃度。最終將DNA稀釋至25 ng·μL-1，置于 -20 ℃ 冰箱備用。

1.3? 藍(lán)莓ISSR反應(yīng)體系的建立

ISSR-PCR反應(yīng)體系由 2.0μL DNA模板、2.5 μL 10×Ex Taq Buffer、2.5 μL dNTP、2.0 μL 10μmol·L-1引物、2.0μL? ? ? ? 25 mmol·L-1 MgCl2、0.3μL5 U·μL? ?-1 Taq DNA polymerae和13.7μL ddH2O組成，總體積為25μL。ISSR引物序列參考加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC Primer Set#9（University of British Columbia Biotechnology，UBC），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10 min；4℃保存。PCR反應(yīng)在Techne PCR儀上進(jìn)行。電泳檢測(cè)采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為 1×TBE，150V電壓電泳4h，電泳結(jié)束后銀染拍照。

1.4? ISSR引物的篩選及擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性的統(tǒng)計(jì)分析

用 60條隨機(jī)引物對(duì)任意一份DNA 樣品在上述的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序中進(jìn)行擴(kuò)增，以篩選引物，引物需符合如下條件：條帶清晰、空白中無或少假帶、對(duì)所有樣品均有質(zhì)量好的條帶。根據(jù)電泳圖譜進(jìn)行讀帶，電泳圖譜中的每一條帶記為一個(gè)分子標(biāo)記。以清晰及能重復(fù)的條帶記為“1”其余的為“0”，數(shù)據(jù)處理完后運(yùn)用NTSYS-PC 2.0軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1? 多態(tài)性ISSR引物的篩選

選擇適宜的引物是構(gòu)建DNA指紋圖譜的關(guān)鍵因素之一。本研究從60條隨機(jī)引物中篩選出9條帶型好、多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物。9條ISSR 引物對(duì)64個(gè)品種的擴(kuò)增結(jié)果見表2，共擴(kuò)增出條帶161條，其中多態(tài)性條帶159條，平均多態(tài)百分率達(dá)98.8% 。各引物擴(kuò)增的條帶數(shù)在5～25條之間。

2.2? 64個(gè)藍(lán)莓品種指紋圖譜的構(gòu)建

引物 UBC841 可以將 64份供試材料完全區(qū)分開來（圖1），構(gòu)建了 64 個(gè)藍(lán)莓材料的 DNA 指紋圖譜（表3）。

2.3? 64個(gè)藍(lán)莓品種的聚類分析

基于ISSR的擴(kuò)增結(jié)果，采用UPGMA法進(jìn)行相似系數(shù)計(jì)算和聚類分析，建立了64個(gè)藍(lán)莓品種的聚類樹狀圖（圖2）。在相似系數(shù)0.568的水平，可分為3個(gè)品種群，第Ⅰ類聚集了13個(gè)品種，除‘瑞卡‘美登外，其余11個(gè)品種均為兔眼藍(lán)莓。第Ⅱ類聚集了46個(gè)品種，包含了絕大多數(shù)的高叢、矮叢藍(lán)莓，在相似系數(shù)0.58水平對(duì)該組進(jìn)行亞分類，可分為4個(gè)亞組（表4），第1個(gè)亞組包含15個(gè)品種，其中‘比洛克西‘夏普蘭等6個(gè)品種為南高叢藍(lán)莓，‘錢德勒‘努益等8個(gè)品種為北高叢藍(lán)莓，‘芝尼為矮叢藍(lán)莓；第2個(gè)亞組包含20個(gè)品種，其中‘海岸‘密斯提等5個(gè)品種為南高叢藍(lán)莓，‘玫瑰藍(lán)‘康維爾等15個(gè)品種為北高叢藍(lán)莓；第3個(gè)亞組包含8個(gè)品種，除‘北極星‘北村‘北陸3個(gè)半高叢藍(lán)莓品種外，還包括‘魯貝爾‘埃利奧特等5個(gè)北高叢藍(lán)莓品種；第4個(gè)亞組包含3個(gè)品種，其中‘斯維克為矮叢藍(lán)莓，‘米德‘達(dá)柔為北高叢藍(lán)莓。第Ⅲ類聚集了5個(gè)品種，除‘庫帕為南高叢藍(lán)莓外，其余4個(gè)為北高叢藍(lán)莓。

3 討論

3.1? 64個(gè)藍(lán)莓品種的遺傳關(guān)系分析

多數(shù)藍(lán)莓品種間在外觀形狀上難以區(qū)分，DNA分子標(biāo)記已成為在藍(lán)莓品種鑒定及親緣關(guān)系分析方面最有效的方法。在藍(lán)莓資源上，已采用SSR［12］、RAPD［13］、ISSR［14］和SRAP［15］等標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析以及品種鑒定研究。

本研究聚類結(jié)果表明，兔眼藍(lán)莓、半高叢藍(lán)莓可單獨(dú)聚在一組，說明藍(lán)莓品種間的遺傳關(guān)系與栽培類型之間存在著一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。崔建民［16］等對(duì)93個(gè)藍(lán)莓種質(zhì)資源進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析也顯示在遺傳相似系數(shù)0.70處，北高叢藍(lán)莓、兔眼藍(lán)莓分別聚為一類；但是本研究中存在北高叢、南高叢及矮叢的品種混雜聚類，說明僅根據(jù)藍(lán)莓栽培類型來分類并不能準(zhǔn)確反映其遺傳關(guān)系，這可能是因?yàn)楝F(xiàn)在栽培的大多數(shù)藍(lán)莓品種均是由幾個(gè)最原始的品種相互雜交而得到的［14］。

3.2? 藍(lán)莓DNA指紋圖譜的構(gòu)建

目前，已建立多種果樹的指紋圖譜，包括蘋果、梨、李、桃、杏、柑橘、葡萄、柿、櫻桃、梅、油橄欖、阿月渾子、番荔枝、樹莓、番木瓜、棗等。藍(lán)莓指紋圖譜方面研究較少，僅見除鄭姍等［17］以ISSR標(biāo)記構(gòu)建17個(gè)品種的DNA指紋圖譜外，高雄梅［18］、 王亮［19］、徐國輝［20］等以EST-SSR開展了相關(guān)研究，為此，開展藍(lán)莓品種的DNA指紋圖譜鑒定有助于解決國內(nèi)藍(lán)莓苗木混雜及亂命名現(xiàn)象。

本研究采用的ISSR標(biāo)記不僅結(jié)合了RAPD、AFLP的大部分優(yōu)點(diǎn)［21］，且多態(tài)性比RAPD、 AFLP、SSR豐富，多態(tài)性占總條數(shù)的98.8%。下一步研究擬將ISSR技術(shù)與SCAR標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，增加多態(tài)性引物數(shù)量，開發(fā)特異的SCAR標(biāo)記，構(gòu)建更準(zhǔn)確、穩(wěn)定的藍(lán)莓DNA指紋圖譜，為藍(lán)莓品種鑒定等相關(guān)研究服務(wù)。

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（責(zé)任編輯：馮新）