范金金，丁立，張躍亮，陳俊，張貝，李雪清，佟旭，王云甫，艾志兵

目的 探究人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）調(diào)控磷脂 肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠周細(xì)胞表達(dá)和神經(jīng)功能變化的影響。

方法 取雄性SD大鼠共72只，隨機(jī)分組為假手術(shù)組、模型組、干細(xì)胞組、干細(xì)胞+抑制劑組，每組18只。除假手術(shù)組外，剩余各組均建立腦缺血再灌注模型。造模成功后，模型組尾靜脈注射0.1 mL的磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS），干細(xì)胞組尾靜脈注射0.1 mL含有2×106個(gè)hUCBMSCs的PBS，干細(xì)胞＋抑制劑組尾靜脈注射0.1 mL含2×106個(gè)hUCBMSCs的PBS及腹腔注射PI3K/Akt抑制劑LY294002（0.03 mg/100 g），LY294002每天給藥1次，直至處死。術(shù)后1、3、7、14 d測定改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity scores，mNSS）。術(shù)后7、14 d，采用2，3，5-氯化三苯基四氮 （2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法檢測大鼠腦梗死面積，尼氏染色檢測大腦皮質(zhì)缺血半暗帶正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)，免疫組織化學(xué)法檢測大腦皮質(zhì)缺血半暗帶血小板衍生生長因子受體-β（platelet derived growth factor receptor-β，PDGFRβ）陽性周細(xì)胞的數(shù)量，免疫印跡法檢測大腦皮質(zhì)缺血半暗帶PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白p-Akt及Akt的表達(dá)。

結(jié)果 術(shù)后7 d，4組各項(xiàng)指標(biāo)整體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，模型組的大鼠正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)[（55.42±4.75）個(gè) vs.（8.50±1.64）個(gè)，P＜0.001]和p-Akt/Akt（1.00±0.00 vs.0.47±0.06，P=0.002）均降低，腦PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)量[（1.08±0.29）個(gè) vs.（13.67±2.47）個(gè)，P＜0.001]增加；與模型組比較，干細(xì)胞組大鼠的mNSS評(píng)分[（6.33±0.71）分 vs.（4.78±0.98）分，P＜0.001]和腦梗死率（32.66%±1.76% vs.14.60%±0.52%，P＜0.001）均降低，正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)[（8.50±1.64）個(gè) vs.（23.17±1.77）個(gè)，P＜0.001]、腦PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)量[（13.67±2.47）個(gè) vs.（28.50±3.19）個(gè)，P＜0.001]和p-Akt/Akt（0.47±0.06 vs.0.83±0.18，P=0.017）均增加；與干細(xì)胞組比較，干細(xì)胞+抑制劑組的大鼠mNSS評(píng)分[（4.78±0.98）分 vs.（6.11±0.78）分，P=0.002]和腦梗死率（14.60%±0.52% vs.27.85%±0.59%，P＜0.001）均增加，正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)[（23.17±1.77）個(gè) vs.（11.83±0.88）個(gè)，P=0.003]、腦PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)量[（28.50±3.19）個(gè) vs.（20.33±1.44）個(gè)，P=0.007]和p-Akt/Akt（0.83±0.18 vs.0.36±0.11，P=0.003）均降低。術(shù)后14 d，4組各項(xiàng)指標(biāo)整體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，模型組的大鼠正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)[（57.08±3.79）個(gè) vs.（11.25±5.52）個(gè)，P＜0.001]和p-Akt/Akt（1.00±0.00 vs.0.53±0.12，P=0.002）均降低，腦PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)量[（2.00±0.25）個(gè) vs.（13.42±1.04）個(gè)，P＜0.001]增加；與模型組比較，干細(xì)胞組大鼠的mNSS評(píng)分[（4.89±0.78）分 vs.（2.33±0.87）分，P＜0.001]和腦梗死率（32.58%±1.96% vs.11.78%±1.92%，P＜0.001）均降低，正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)[（11.25±5.52）個(gè) vs.（31.00±1.89）個(gè)，P＜0.001]、腦PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)量[（13.42±1.04）個(gè) vs.（31.42±3.66）個(gè)，P＜0.001]和p-Akt/Akt（0.53±0.12 vs.0.93±0.12，P=0.004）均增加；與干細(xì)胞組比較，干細(xì)胞+抑制劑組大鼠的mNSS評(píng)分[（2.33±0.87）分 vs.（4.44±0.53）分，P＜0.001]和腦梗死率（11.78%±1.92% vs.25.25%±2.76%，P＜0.001）均增加，正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)[（31.00±1.89）個(gè) vs.（13.83±1.04）個(gè)，P=0.002]、腦PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)量[（31.42±3.66）個(gè) vs.（20.67±1.42）個(gè)，P＜0.001]和p-Akt/Akt（0.93±0.12 vs.0.53±0.09，P=0.005）均降低。

結(jié)論 hUCBMSCs可能通過激活PI3K/Akt通路促進(jìn)周細(xì)胞的存活募集，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用，進(jìn)而促進(jìn)腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。

再灌注治療是缺血性卒中（ischemic stroke，IS）臨床治療最有效的方法，但由于其治療時(shí)間窗較短，限制了再灌注治療的廣泛應(yīng)用[1]。因此，新型治療靶點(diǎn)及方法的研究對(duì)于IS的治療具有重要的意義。

周細(xì)胞直接與內(nèi)皮細(xì)胞相接觸，是包裹、支持和控制微血管的壁細(xì)胞，位于神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）的中心[2]。周細(xì)胞作為血腦屏障（blood brain bar r ier，BBB）的重要組成部分，對(duì)于維持BBB的完整性十分重要[3-4]。周細(xì)胞募集至新形成的微血管，促進(jìn)其成熟、穩(wěn)定，被認(rèn)為是卒中治療的潛在靶點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）由于其多向分化潛能已成為治療IS的一個(gè)極具吸引力的候選細(xì)胞[5]。既往研究表明，MSCs對(duì)IS有神經(jīng)保護(hù)作用[6-7]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路是介導(dǎo)細(xì)胞存活、分化、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和新陳代謝的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MSCs可激活PI3K/Akt通路，改善小鼠脊髓的缺血損傷[9]。更重要的是，該通路的激活通過增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞之間以及內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞之間的相互作用來促進(jìn)周細(xì)胞向新生內(nèi)皮管的募集，對(duì)促進(jìn)血管生成起著重要作用[10-11]。本研究旨在觀察人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）通過PI3K/Akt通路對(duì)周細(xì)胞存活及募集的作用，以及對(duì)腦損傷大鼠的神經(jīng)功能的影響，探討干細(xì)胞治療IS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2019-0008。所有大鼠均飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度25 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%。將72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、干細(xì)胞組、干細(xì)胞+抑制劑組，每組18只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 hUCBMSCs、完全細(xì)胞培養(yǎng)基、Akt抗體、p-Akt抗體、血小板衍生生長因子受體-β（platelet derived growth factor receptor-β，PDGFRβ）抗體、β肌動(dòng)蛋白、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、LY294002（PI3K/Akt抑制劑）、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 完全細(xì)胞培養(yǎng)基重懸hUCBMSCs，把細(xì)胞放入37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的顏色變黃時(shí)則予以換液，換液間隔為3 d。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合時(shí)，按照1∶2進(jìn)行傳代，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，將第3代細(xì)胞磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）重懸后用于后續(xù)的大鼠尾靜脈注射。

1.2.2 模型制作與給藥 由頸外動(dòng)脈插入栓線制備大腦中動(dòng)脈閉塞模型，缺血90 min后，抽出栓線實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組僅做血管鈍性分離，其余3組均制作缺血再灌注模型。待實(shí)驗(yàn)大鼠完全蘇醒后，根據(jù)Longa 5分法進(jìn)行評(píng)估，1～3分為造模成功。造模不成功及術(shù)中出血量過多死亡的大鼠共13只，補(bǔ)足脫漏只數(shù)。造模成功后，模型組于尾靜脈注射0.1 mL無菌PBS；干細(xì)胞組尾靜脈注射等體積含有2×106個(gè)hUCBMSCs的無菌PBS；干細(xì)胞＋抑制劑組尾靜脈注射等體積含2×106個(gè)hUCBMSCs的PBS及模型制作前30 min腹腔注射LY294002（0.03 mg/100 g），此后每天給藥1次，直至處死。術(shù)后7、14 d，完成改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity scores，mNSS）測定后，處死大鼠用于后續(xù)的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色、免疫組化和免疫印跡實(shí)驗(yàn)。1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.3.1 大鼠改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分 術(shù)后1、3、7、14 d，每組隨機(jī)選取9只大鼠，對(duì)大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)、感覺、反射及不正常運(yùn)動(dòng)等方面的評(píng)估，滿分18分，評(píng)分越高說明大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.3.2 TTC染色檢測大鼠腦梗死面積 術(shù)后7、14 d，每組隨機(jī)選取3只大鼠，將大鼠麻醉后斷頭取腦，置于腦切片膜具中。-20 ℃冰箱中冷凍，沿冠狀面切成7片，2% TTC中避光顯色。梗死區(qū)呈現(xiàn)白色，正常腦組織呈現(xiàn)鮮紅色。拍照獲取圖像，Image J軟件分析腦梗死面積。公式為：腦梗死率=腦梗死面積/全腦面積×100%。

1.3.3 尼氏染色檢測神經(jīng)元細(xì)胞損傷及正常神經(jīng)元數(shù)量 術(shù)后7、14 d，每組隨機(jī)選取3只大鼠，麻醉后斷頭取腦，石蠟包埋，切片機(jī)做病理切片，片厚3 μm，脫蠟、脫水，尼氏染色。鏡下觀察大腦皮質(zhì)缺血半暗帶神經(jīng)元細(xì)胞損傷變化，計(jì)數(shù)4個(gè)不同視野的正常神經(jīng)元的數(shù)量，取其平均值。

1.3.4 免疫組化染色檢測PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù) 術(shù)后7、14 d，每組隨機(jī)選取3只大鼠，前述步驟同尼氏染色，石蠟切片脫蠟，抗原修復(fù)，3% H2O2孵育10 min，PBS沖洗3次，10%山羊血清孵育30 min，滴加PDGFRβ抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，37 ℃的濕盒中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG聚合物孵育30 min；PBS沖洗3次，二氨基聯(lián)苯胺顯色，再蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。計(jì)數(shù)大腦皮質(zhì)缺血半暗帶4個(gè)非重疊區(qū)域的PDGFRβ抗體標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)量，并取其平均值。

1.3.5 免疫印跡檢測p-Akt及Akt蛋白表達(dá)水平 術(shù)后7、14 d，每組隨機(jī)選取3只大鼠，冰上斷頭取腦，取大腦皮質(zhì)缺血半暗帶（根據(jù)Ashwal等[12]方法確定）腦組織提取總蛋白。腦組織稱重，加入裂解液，勻漿機(jī)中迅速勻漿。冰上裂解30 min，4 ℃離心15 min取上清液。BCA法蛋白定量，100 ℃加熱蛋白變性。SDSPAGE凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上、膜封閉2 h。一抗：Akt抗體（1∶1000）、p-Akt抗體（1∶1000）及β肌動(dòng)蛋白（1∶5000），4 ℃過夜孵育。TBST洗膜，二抗（1∶4000）室溫孵育90 min，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影。使用Image J軟件分析Akt、p-Akt條帶灰度值，β肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部對(duì)照，Akt作為p-Akt的比值對(duì)照，將假手術(shù)組標(biāo)準(zhǔn)化為1。

2 結(jié)果

2.1 改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 各時(shí)間點(diǎn)、各組大鼠mNSS評(píng)分的整體差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。術(shù)后1、3、7、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組、干細(xì)胞組及干細(xì)胞+抑制劑組的mNSS評(píng)分均增加（P＜0.001）。與模型組比較，干細(xì)胞組在術(shù)后1 d的mNSS評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.912），術(shù)后3、7、14 d的mNSS評(píng)分均降低（P＜0.001）；術(shù)后1、3、7、14 d，與模型組比較，干細(xì)胞+抑制劑組的mNSS評(píng)分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.988，P=0.730，P=0.912，P=0.465）。與干細(xì)胞組比較，干細(xì)胞+抑制劑組在術(shù)后1 d的mNSS評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.988），術(shù)后3、7、14 d的mNSS評(píng)分均增加（P=0.003，P=0.002，P＜0.001）（表1）。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)段神經(jīng)功能缺損評(píng)分Table 1 Neurological deficit scores of rats in different periods after operation

2.2 各組大鼠腦梗死率比較 術(shù)后7、14 d，各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的腦梗死率的整體差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。術(shù)后7、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組、干細(xì)胞組及干細(xì)胞+抑制劑組大鼠的腦梗死率均增大（P＜0.001）；與模型組比較，干細(xì)胞組大鼠的腦梗死率均減小（P＜0.001），干細(xì)胞+抑制劑組大鼠的腦梗死率均減?。≒=0.001，P=0.008）；與干細(xì)胞組比較，干細(xì)胞+抑制劑組大鼠的腦梗死率均增大（P＜0.001）（圖1，表2）。

圖1 各組大鼠TTC染色結(jié)果Figure 1 TTC staining results of rats in each group

表2 各組大鼠腦梗死率比較Table 2 Comparison of the cerebral infarction rate of rats in each group

2.3 各組大鼠正常神經(jīng)元數(shù)量比較 術(shù)后7、14 d，各組大鼠正常神經(jīng)元數(shù)量的整體差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。術(shù)后7、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組、干細(xì)胞組及干細(xì)胞+抑制劑組大鼠的正常神經(jīng)元數(shù)量均降低（P＜0.001）；與模型組比較，干細(xì)胞組大鼠的正常神經(jīng)元數(shù)量均增加（P＜0.001），干細(xì)胞+抑制劑組大鼠的正常神經(jīng)元數(shù)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.474，P=0.806）；與干細(xì)胞組比較，干細(xì)胞+抑制劑組大鼠的正常神經(jīng)元數(shù)量均降低（P=0.003，P=0.002）（圖2，表3）。

圖2 各組大鼠腦組織尼氏染色結(jié)果Figure 2 Results of Nissl staining in brain tissue of rats in each group

表3 各組大鼠正常神經(jīng)元數(shù)量比較Table 3 Comparison of the number of normal neurons in each group

2.4 各組大鼠PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù) 術(shù)后7、14 d，各組大鼠PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)的整體差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。術(shù)后7、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組、干細(xì)胞組及干細(xì)胞+抑制劑組大鼠PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)均增加（P＜0.001）；與模型組比較，干細(xì)胞組大鼠PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)均增加（P＜0.001），干細(xì)胞+抑制劑組大鼠PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)均增加（P=0.022，P=0.01）；與干細(xì)胞組比較，干細(xì)胞+抑制劑組大鼠PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)均降低（P=0.007，P＜0.001）（圖3，表4）。

圖3 各組大鼠PDGFRβ+周細(xì)胞Figure 3 PDGFRβ+ pericytes of rats in each group

表4 各組大鼠PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)結(jié)果比較Table 4 Comparison of the number of PDGFRβ+ pericytes in each group

2.5 大鼠腦組織PI3K/Akt通路蛋白p-Akt、Akt的表達(dá) 術(shù)后7、14 d，各組大鼠腦組織p-Akt/Akt蛋白比值的整體差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。術(shù)后7、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠p-Akt/Akt均降低（P=0.002，P=0.002），干細(xì)胞組大鼠p-Akt/Akt差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.326，P=0.820），干細(xì)胞+抑制劑組大鼠p-Akt/Akt均降低（P＜0.001，P=0.002）；與模型組比較，干細(xì)胞組大鼠p-Akt/Akt均增加（P=0.017，P=0.004），干細(xì)胞+抑制劑組大鼠p-Akt/Akt差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.592，P＞0.999）；與干細(xì)胞組比較，干細(xì)胞+抑制劑組大鼠p-Akt/Akt均降低（P=0.003，P=0.005）（圖4，表5）。

圖4 各組大鼠腦組織中p-Akt、Akt蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of p-Akt and Akt protein in brain tissue of rats in each group

表5 各組大鼠p-Akt/Akt結(jié)果比較Table 5 Comparison of p-Akt/Akt results in each group

3 討論

干細(xì)胞移植治療IS的作用機(jī)制仍在繼續(xù)研究中，目前認(rèn)為可能的途徑主要為：①替代受損的神經(jīng)細(xì)胞和組織；②旁分泌功能作用，包括免疫調(diào)節(jié)、促血管生成、神經(jīng)保護(hù)及神經(jīng)營養(yǎng)功能等[13-14]。研究表明，通過尾靜脈注射MSCs外泌體，可以促進(jìn)腦缺血大鼠的神經(jīng)血管重建和神經(jīng)功能恢復(fù)[15]。在本研究中，尼氏染色、TTC染色及大鼠mNSS評(píng)分結(jié)果顯示造模后，大鼠正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯減少，腦梗死率及神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯增加；進(jìn)行hUCBMSCs注射治療后，大鼠正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯增加，腦梗死率及神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯降低；而相比干細(xì)胞組，干細(xì)胞+抑制劑組大鼠正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)減少，腦梗死率及神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯增加。由此說明，hUCBMSCs可以有效改善缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)細(xì)胞損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，但這些保護(hù)作用均被PI3K/Akt通路抑制劑LY294002所削弱。

PDGFRβ可以作為“活性周細(xì)胞”的標(biāo)志物，其表達(dá)在腦缺血后的周細(xì)胞中被顯著誘導(dǎo)。既往研究表明，腦缺血損傷后，梗死周圍區(qū)域的周細(xì)胞中PDGFRβ表達(dá)隨時(shí)間的變化而逐漸上調(diào)[16-17]，腦周細(xì)胞中PDGFRβ的上調(diào)參與了周細(xì)胞向內(nèi)皮管的遷移和募集，有利于BBB的維持和修復(fù)，對(duì)腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)發(fā)揮重要作用[18-19]。PI3K/Akt通路與IS密切相關(guān)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)。研究表明，缺血再灌注損傷大鼠模型中，PI3K/Akt通路的激活可減輕腦組織的損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[20-21]。還有研究表明MSCs可激活PI3K/Akt通路，改善小鼠脊髓的缺血損傷。更重要的是，該通路的激活增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)了周細(xì)胞向新生內(nèi)皮管的募集和血管生成[10]。既往研究證明，在慢性下肢缺血模型中，抑制PI3K/Akt通路可減少側(cè)支循環(huán)形成[22]，PI3K抑制劑LY294002也會(huì)導(dǎo)致周細(xì)胞存活率降低[23]。也有研究證實(shí)，在大鼠腦出血模型中，激活PI3K/Akt通路可以促進(jìn)周細(xì)胞的存活、增殖和募集，從而增加內(nèi)皮細(xì)胞的周細(xì)胞覆蓋，促進(jìn)了神經(jīng)功能的恢復(fù)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)：相比模型組，干細(xì)胞組大鼠腦組織p-Akt/Akt及PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)明顯升高；相比干細(xì)胞組，干細(xì)胞+抑制劑組大鼠腦組織p-Akt/Akt及PDGFRβ+周細(xì)胞數(shù)明顯降低。由此可得，hUCBMSCs治療大鼠腦缺血再灌注損傷過程中，可能通過增強(qiáng)Akt磷酸化，增加大鼠腦PDGFRβ+周細(xì)胞的存活及募集，減輕了神經(jīng)元細(xì)胞的損傷和腦梗死面積，進(jìn)而促進(jìn)了神經(jīng)功能的恢復(fù)。然而，這些保護(hù)作用被PI3K/Akt抑制劑LY294002所削弱，進(jìn)一步說明hUCBMSCs通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮上述神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本研究通過建立腦缺血再灌注損傷模型，給予hUCBMSCs治療處理，減輕了神經(jīng)元細(xì)胞的損傷和腦梗死面積，進(jìn)而促進(jìn)了神經(jīng)功能的恢復(fù)，發(fā)揮腦保護(hù)作用。上述保護(hù)機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號(hào)通路從而促進(jìn)周細(xì)胞的存活及募集有關(guān)。但本研究存在一定的不足，考慮到實(shí)驗(yàn)周期較長以及參照既往研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，故并沒有單獨(dú)設(shè)立抑制劑組，這是后續(xù)研究需要關(guān)注的問題，本課題組在后續(xù)的研究中會(huì)進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。另一方面，hUCBMSCs對(duì)腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用是否還有其他通路參與及其具體分子作用機(jī)制如何仍有待進(jìn)一步研究，這也是本研究的局限性之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。