陳 薇,楊 勇

(江西省人民醫(yī)院/南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院甲狀腺頭頸外科,江西 南昌 330006)

喉癌是一種來源于喉部黏膜上皮的惡性腫瘤,其中96%～98%為鱗狀細(xì)胞癌,2020年全球喉部鱗癌發(fā)病率占頭頸部鱗癌的21%,位居第二,男性發(fā)病率高于女性,男性喉癌發(fā)病率為3.6/10萬,死亡率為1.9/10萬,女性喉癌發(fā)病率為0.5/10萬,死亡率為0.3/10萬[1]。喉癌臨床表現(xiàn)多見為聲音嘶啞、咽喉異物感、咳嗽、吞咽困難、頸部質(zhì)硬包塊、呼吸困難等,其發(fā)生主要與吸煙喝酒、病毒感染、環(huán)境及遺傳因素相關(guān)[2]。目前喉癌治療方案為以手術(shù)治療為主,以放療、化療及免疫治療為輔的綜合治療[3]。早期喉癌癥狀不明顯,明確診斷時多為中晚期,盡管喉癌的治療方式日趨完善,但晚期喉癌患者在治療后多因局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致預(yù)后較差。進(jìn)一步研究喉癌的病因和分子機(jī)制,尋找和開發(fā)有效的治療靶點,將會對喉癌的早期診斷、治療及改善預(yù)后產(chǎn)生重要作用。近年來,針對腫瘤細(xì)胞的異常代謝過程,靶向代謝重編程已成為潛在的腫瘤治療方案之一。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP2)是近年來在多種研究中異常表達(dá)的調(diào)控脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)靶向SREBP2具有一定的抗腫瘤效果,可作為靶向代謝重編程的靶點[4]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白C2(mTORC2)信號通路參與了眾多癌癥細(xì)胞自噬、凋亡、組織轉(zhuǎn)移過程,其異常激活會影響多種腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的演進(jìn)過程[5]。PI3K/AKT/mTORC2信號通路是調(diào)控SREBP2表達(dá)的關(guān)鍵通路,在卵巢癌中可促進(jìn)膽固醇的合成及腫瘤生長[6]。然而PI3K/AKT/mTORC2信號通路及SREBP2分子在喉癌中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不清楚。本研究聚焦PI3K/AKT/mTORC2及SREBP2在喉癌組織中的表達(dá)水平,為開發(fā)以SREBP2為靶點的喉癌靶向代謝重編程療法提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年1月至2022年6月病理確診為原發(fā)性喉癌的患者60例,其中男55例,女5例,年齡47～87歲,平均(67.93±8.83)歲。所有研究病例均已知曉本次研究內(nèi)容及目的,且自愿簽署知情同意書。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)曾接受放療、化療及免疫治療者;(2)合并其他器官、造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者;(3)合并精神或神經(jīng)性疾病患者。

1.2方法

1.2.1樣本采集 收集患者的腫瘤組織(喉鱗狀細(xì)胞腫瘤組織)及癌旁組織(聲帶息肉)樣本,使用多聚甲醛固定10～12 h后脫水、石蠟包埋、組織切片,用于免疫組織化學(xué)(免疫組化)檢測。

1.2.2主要試劑 兔抗人SREBP2單克隆抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司,兔抗人PI3K單克隆抗體購自福建邁新生物技術(shù)公司,鼠抗人AKT單克隆抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,鼠抗人mTORC2單克隆抗體購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2.3免疫組化(Envsion二步法) 將組織置于67 ℃烤箱中烘烤30 min,二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。使用高壓熱修復(fù)行抗原修復(fù),冷卻后蒸餾水沖洗 2次,后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,每次3 min。以含1% 牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽平衡生理鹽水緩沖液(PBS)進(jìn)行封閉處理,作用30 min。3%過氧化氫去離子水室溫下孵育10 min,PBS沖洗3次,每次3 min。滴加一抗(預(yù)試驗選定PI3K抗體為即用型,AKT抗體的工作濃度為1∶200,mTORC2抗體的工作濃度為1∶200,SREBP2抗體的工作濃度為1∶200),室溫下孵育2 h。PBS沖洗3次,每次5 min。滴加新鮮配制的DAB顯色,顯微鏡下觀察以適度為止。蘇木精復(fù)染,自來水沖洗,梯度乙醇脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固。上述步驟中由試劑公司提供照片作為陽性對照,用 PBS代替一抗作為陰性對照,以排除非特異性著色。

1.2.4免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 按切片中細(xì)胞染色強(qiáng)度評分:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;每張切片在400×顯微鏡下任意選取5格不重疊視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù),每個視野計數(shù)200個細(xì)胞,計算5個視野中的陽性細(xì)胞色平均百分比,按照百分比計分:0為0分,>0～25%為1分,>25%～50%為2分,>50%～75%為3分,>75%～100%為4分。以上兩項得分相加(0～7分),<3分為(-),3分為(+),>3～5分為(++),>5～7分為(+++)。分別計數(shù)各項得分的例數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1不同倍數(shù)顯微鏡觀察下各分子在喉癌組織中表達(dá)情況 在高倍顯微鏡(400×)觀察下,相較于癌旁組織,PI3K、AKT、mTORC2在喉癌組織中高表達(dá),并主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中;SREBP2在喉癌組織中高表達(dá),并主要定位于細(xì)胞核中,見圖1。PI3K、AKT、mTORC2與SREBP2在低倍顯微鏡(200×)觀察下表達(dá)情況見圖2。

2.2各分子在不同組織中陽性表達(dá)情況 各分子在腫瘤組織中表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3不同臨床特征患者各分子陽性表達(dá)情況比較 不同性別、年齡、吸煙(包/年)、腫瘤部位患者PI3K、AKT、mTORC2、SERBP2表達(dá)情況比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);腫瘤直徑大于或等于3 cm患者AKT、mTORC2、SERBP2陽性表達(dá)率均高于腫瘤直徑小于3 cm患者,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者AKT、SERBP2陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期患者,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);不同分化程度患者PI3K、AKT陽性表達(dá)率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),不同分化程度患者mTORC2、SERBP2陽性表達(dá)率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床特征患者各分子陽性表達(dá)情況比較[n(%)]

2.4各分子不同表達(dá)患者預(yù)后情況比較 PI3K、AKT、mTORC2、SERBP2陽性表達(dá)患者2年生存率均低于陰性表達(dá)患者,但是兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各分子不同表達(dá)患者預(yù)后情況比較

3 討 論

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤。有研究認(rèn)為,吸煙是喉癌發(fā)生的首要致病因素,長期大量的吸煙、喝酒會干擾細(xì)胞抑癌基因的代謝,促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖,導(dǎo)致喉癌的發(fā)生[7]。目前,與喉癌相關(guān)的分子機(jī)制主要有:(1)信號調(diào)控異常,如NER、BER、DSBR通路及MMR信號通路傳導(dǎo)異常;(2)基因突變,如MYCT、POM121突變及編碼多種microRNA的基因突變;(3)抑癌基因的異常甲基化;(4)線粒體基因改變;(5)線粒體呼吸功能障礙等。

喉癌細(xì)胞生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移與能量代謝和遺傳相關(guān)。腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移需要大量能量,故腫瘤細(xì)胞的演進(jìn)過程常與脂質(zhì)代謝異常相伴而行[8]。SREBP是脂類代謝合成和致癌信號通路中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子[9],有3種亞型:SREBP1a、SREBP1c和SREBP2,其中SREBP2在各臟器中均廣泛表達(dá),主要調(diào)控膽固醇合成代謝[10],轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體產(chǎn)生SREBP2m,可進(jìn)入細(xì)胞核后,調(diào)控MVA通路,參與脂質(zhì)代謝及膽固醇合成[11]。多種細(xì)胞信號通路對SREBP2成熟具有調(diào)控作用,胰島素可以通過PI3K/AKT/mTORC2信號通路激活SREBP2的表達(dá),加速膽固醇從頭合成。SREBP2與炎癥、自噬和細(xì)胞凋亡的致病過程密切相關(guān),加速多種代謝紊亂的發(fā)生、發(fā)展[12]。SREBP2在多種癌細(xì)胞中被激活,其下游參與脂代謝的靶基因表達(dá)升高,參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展[4]。JIE等[13]研究發(fā)現(xiàn),SREBP2通過促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和乳腺癌轉(zhuǎn)移來加重乳腺癌相關(guān)的骨質(zhì)溶解。GAO等[14]通過使用SREBP活化的特異性抑制劑fatostatin,證實阻斷子宮內(nèi)膜癌中SREBP調(diào)節(jié)的代謝途徑可抑制腫瘤生長并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。李曉楓等[15]研究顯示SREBP2在原發(fā)性肝癌中高表達(dá),與病理類型、分化程度、門靜脈侵襲及TNM分期等臨床特征及預(yù)后有關(guān),SREBP2高表達(dá)明顯增加患者死亡風(fēng)險。劉坤等[16]研究在腎癌細(xì)胞中,SREBP等許多脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子發(fā)生改變,通過脂類抑制劑能抑制腎癌細(xì)胞的生長;膽固醇代謝基因SREBP1和SREBP2的表達(dá),可通過增加VEGF-C的表達(dá)誘導(dǎo)淋巴管生成,促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。張莉等[17]證實了SREBP2通過改變結(jié)腸癌的細(xì)胞代謝來抑制結(jié)腸癌的生長,同時降低了與癌癥干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。YU等[18]研究發(fā)現(xiàn)lincRNA,SNHG16通過直接miR-195/SREBP 2軸調(diào)控脂肪生成,促進(jìn)胰腺癌的發(fā)展。目前,在肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中均已發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的SREBP2[13-16]。

近年來,針對腫瘤細(xì)胞的異常代謝過程,靶向代謝重編程已成為潛在的腫瘤治療方案之一。PI3K/AKT/mTORC2信號通路是調(diào)節(jié)SREBP1和SREBP2表達(dá)的關(guān)鍵信號通路,通過mTORC2分子調(diào)控卵巢癌細(xì)胞中SREBP2表達(dá),并影響膽固醇代謝及腫瘤生長[6]。目前,許多靶向PI3K信號通路抑制劑已進(jìn)入臨床試驗,如BKM120(布帕利西布)是一種口服泛Ⅰ類可逆PI3K抑制劑,在耐受劑量下在人腫瘤異種移植模型中表現(xiàn)出良好的口服生物利用度和顯著的抗腫瘤活性[17]。靶向SREBP2同樣具有潛在的抗腫瘤作用。WEI等[19]證實可溶的青蒿素類似物青蒿琥酯可通過抑制SREBP2的核定位及其靶基因HMGCR的表達(dá),限制MVA途徑來加速膠質(zhì)瘤細(xì)胞衰老,具有潛在的抗腫瘤作用。KIM等[20]證實大黃素聯(lián)合索拉非尼可抑制肝癌細(xì)胞中SREBP2轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制膽固醇生物合成和致癌AKT信號傳導(dǎo),是晚期肝癌患者潛在的療法之一。有研究證實,SREBP1和SREBP2是PI3K信號通路調(diào)控的下游分子之一[21],而靶向SREBP2的基礎(chǔ)研究也顯示了較好的腫瘤抑制效果[22],表明靶向PI3K治療腫瘤的可能機(jī)制之一是抑制SREBP2表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)喉鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織中PI3K/AKT/mTORC2通路分子及SREBP2高表達(dá),而間質(zhì)組織細(xì)胞陰性,相較于癌旁組織,喉癌組織PI3K、AKT、mTORC2及SREBP2分子表達(dá)陽性率顯著升高,蛋白質(zhì)水平證實了PI3K/AKT/mTORC2信號通路及SREBP2分子在喉癌組織中的異常表達(dá),是潛在的喉癌靶向代謝重編程治療的靶點。

本文選取原發(fā)性喉癌患者60例,取腫瘤組織及癌旁組織樣本,以免疫組化法測定PI3K、AKT、mTORC2及SREBP2表達(dá)情況并進(jìn)行比較。腫瘤組織PI3K(88.3%vs.40.0%)、AKT(76.7%vs.31.7%)、mTORC2(78.3%vs.21.7%)、SERBP2(65.0%vs.8.3%)陽性表達(dá)率高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。腫瘤直徑大于或等于3 cm患者AKT、mTORC2、SERBP2陽性表達(dá)率高于腫瘤直徑小于3 cm患者,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者AKT、SERBP2陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期患者,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);不同分化程度患者mTORC2、SERBP2陽性表達(dá)率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PI3K、AKT、mTORC2、SERBP2陽性表達(dá)患者2年生存率低于陰性表達(dá)患者,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述,喉癌患者腫瘤組織中PI3K/AKT/mTORC2信號通路分子及SREBP2分子蛋白質(zhì)水平存在異常表達(dá),相較于聲帶息肉,喉癌組織PI3K、AKT、mTORC2及SREBP2分子表達(dá)陽性率顯著升高,是潛在的喉癌靶向代謝重編程治療的靶點。