陳麗川，段 波，喻 昭，馬志毅，孟倩文

（武漢市中醫(yī)醫(yī)院 風(fēng)濕病科針灸科，武漢 430050）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）作為一種常見(jiàn)的炎癥性關(guān)節(jié)炎，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛和僵硬，伴隨終生的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)高達(dá)1%［1］，其診斷標(biāo)準(zhǔn)包括至少一個(gè)關(guān)節(jié)有明確的腫脹［2］。 RA的主要特征是炎癥途徑導(dǎo)致的關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖，形成的血管翳可能導(dǎo)致軟骨的破壞和骨質(zhì)的侵蝕，促炎因子大量產(chǎn)生更加促進(jìn)了這一過(guò)程的發(fā)生［3］。在RA 患者治療中，兩種或兩種以上的抗風(fēng)濕藥物聯(lián)合治療比單藥治療更有效，但是兩種以上的生物制劑的使用會(huì)帶來(lái)很大的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。

穴位埋線（acupoint catgut embedding，ACE）是現(xiàn)代針灸的一種，是指用無(wú)菌鑷子將腸線（1.0 ～1.5 cm）放入一次性無(wú)菌針的針尖，腸線與針尖內(nèi)緣平行，針頭隨針用鈍針，將消毒過(guò)的針頭插入消毒過(guò)的穴位，將針刺針推入片刻，取出無(wú)菌針，將腸線留在穴位［4－5］。 穴位埋線結(jié)合了針灸和穴位的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)穴位和機(jī)體產(chǎn)生全面持久的作用，此方法價(jià)格低廉，療效持久，臨床上被廣泛應(yīng)用。 研究證明，在與炎癥反應(yīng)有關(guān)的急性呼吸窘迫綜合征研究中，通過(guò)穴位埋線治療降低了白細(xì)胞介素－6（interleukin 6，IL-6）水平，抑制了促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［6］。 Lu等［7］總結(jié)發(fā)現(xiàn)，在治療以腸道炎癥為主的潰瘍性結(jié)腸炎疾病中，通過(guò)穴位埋線治療效果更持久，愈合所需時(shí)間更短。 目前也有很多研究通過(guò)穴位埋線能夠有效治療RA，但是對(duì)其機(jī)制研究尚不明確。

此外，程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）信號(hào)缺失或被阻斷可以導(dǎo)致一系列自身免疫性疾病，而腫瘤壞死因子受體超家族成員4（tumor necrosis factor receptor superfamily member 4，OX40）信號(hào)敲除或被阻斷則對(duì)自身免疫性疾病有治療作用。 PD-1 和OX40 共刺激信號(hào)失衡可促進(jìn)RA 疾病的進(jìn)展［8］。 因此，本研究通過(guò)建立RA 模型大鼠，對(duì)大鼠穴位埋線和給藥治療，從炎癥因子、滑膜形態(tài)以及流式檢測(cè)PD-1／OX40 及分化決定族抗原4（CD4）／T 細(xì)胞特異性表面糖蛋白（CD28）細(xì)胞含量方面，進(jìn)一步探討穴位埋線在RA 中可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠，SPF 級(jí)，雌性，8 周齡，體重150 ～180 g，共25 只，來(lái)源于三峽大學(xué)［SCXK（鄂）2022－0012］，在武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件下飼養(yǎng)［SYXK（鄂）2018－0104］。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司倫理委員會(huì)審批（HLK-20200110-001）。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

來(lái)氟米特（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，L129518）；戊巴比妥鈉和完全弗氏佐劑（美國(guó)sigma 公司，P3761、F5881）；IL-6 和白細(xì)胞介素－8（interleukin 8，IL-8）ELISA 試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，RA20607）；二甲苯（北京沃凱生物科技有限公司，40091060）；蘇木素和伊紅（北京碧云天生物科技有限公司，C0107 和C0109）；大鼠全血單個(gè)核細(xì)胞分離液KIT（上海微科生物技術(shù)有限公司，LDS1080）；所有抗體PD1（PAB47902）、OX40（PAB47968）、 GAPDH （PAB36269） 和Goat anti-Rabbit IgG（SAB43714）均購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司。 可吸收縫合線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療，66V1228A）；埋線針（高冠醫(yī)械，20162271059）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃，MK3）；電泳儀（Bio-Rad，mini protean 3 cell）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能，Tanon-5200）；流式細(xì)胞儀（艾森，NovoCyte）；倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，MIL LED）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

將動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字表（由SPSS17.0 程序生成）隨機(jī)分為5 組，每組5 只。 對(duì)照（control）組：造模后第10 天開(kāi)始予以等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)42 d。 模型（model）組：造模后第10 天開(kāi)始予以等劑量 生 理 鹽 水 灌 胃， 連 續(xù) 42 d。 來(lái) 氟 米 特（Leflunomide）組：造模后第10 天開(kāi)始予以大鼠灌胃來(lái)氟米特量為10 mg／（kg·d），灌胃劑量1 mL／100 g，連續(xù)42 d。 穴位埋線（acupoint catgut embedding，ACE）組：按照上述造模過(guò)程，造模后第10 天進(jìn)行穴位埋線，處理42 d，埋線3 次。 穴位埋線＋來(lái)氟米特（ACE＋Leflunomide）組：造模后第10 天開(kāi)始予以大鼠灌胃來(lái)氟米特量為10 mg／（kg·d），灌胃劑量1 mL／100 g，連續(xù)42 d，并進(jìn)行上述穴位埋線操作。

將各組大鼠右后足趾皮下注射完全弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）0.1 mL 致炎。 其中對(duì)照組按照造模過(guò)程注射等量PBS。

1.3.3 穴位埋線

實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食不禁飲12 h。 以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。 背部、右后腿剃毛后消毒備用。 參照文獻(xiàn)進(jìn)行穴位埋線［9］，定位雙側(cè)“足三里”“腎腧”?！澳I腧”位于第二腰椎下兩旁，左右各一穴，“足三里”位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm 處。將大鼠俯臥位固定，將9 號(hào)針頭（含0.8 cm 長(zhǎng)無(wú)菌羊腸線），刺入已消毒的雙側(cè)“足三里”和“腎腧”，將腸線完全置入穴內(nèi)。 操作完成后使用碘伏消毒創(chuàng)面。

1.3.4 取材

用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取抗凝新鮮全血用于細(xì)胞流式檢測(cè)；血清用于ELISA 檢測(cè)；滑膜組織用于病理HE 染色。

1.3.5 關(guān)節(jié)炎指數(shù)

參照前期方法［9］，每7 d 對(duì)大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分。 其標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

劉芒也是頑固的排外派，認(rèn)為大量的外來(lái)人口讓人看著就很討厭，把他們?cè)瓉?lái)的家園搞的亂七八糟，所以他制定了一個(gè)規(guī)矩，只要是當(dāng)?shù)厝藨{借一口當(dāng)?shù)卦捜ツ抢锍燥埦涂梢源蛭逭?，劉芒的老婆卻是個(gè)包容派，她認(rèn)為本來(lái)就沒(méi)有什么永遠(yuǎn)的家園，那都只是人類(lèi)遷徙過(guò)程里的落腳處，只是落腳的時(shí)間長(zhǎng)短不一而已，她為了讓外地人更好的融入這里，開(kāi)了一個(gè)收費(fèi)培訓(xùn)班，專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)外地人說(shuō)當(dāng)?shù)卦?。他們這樣一個(gè)組合真是非常奇怪，實(shí)在是無(wú)法計(jì)算他們的家庭總收入到底會(huì)多一點(diǎn)呢還是少一點(diǎn)。

表1 關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Arthritis scoring standard

1.3.6 炎癥因子檢測(cè)

采用ELISA 試劑盒測(cè)定大鼠血清中的IL-6 和IL-8 水平，其測(cè)定步驟嚴(yán)格按照按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)訕?，加酶及溫育，洗滌，顯色，最終加入終止液，在450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度，計(jì)算IL-6 和IL-8 的濃度。

1.3.7 滑膜組織病理檢測(cè)

將樣本經(jīng)過(guò)脫鈣、浸蠟及包埋、切片（3 μm）、烤片后進(jìn)行HE 染色，并采集樣本相關(guān)部位。 根據(jù)炎癥滑膜中的三大類(lèi)細(xì)胞群（定居細(xì)胞群、遷移細(xì)胞群和內(nèi)膜細(xì)胞群）對(duì)HE 染色進(jìn)行定量評(píng)分［10］。 評(píng)分范圍依次為0 分（正常）、1 分（輕度）、2 分（中度）、3 分（重度）。 將3 種炎癥特征的參數(shù)進(jìn)行匯總，總分0～1 分表示正常，炎癥級(jí)別為0；總分2 ～3分為輕度滑膜炎，炎癥級(jí)別為1；總分4～6 為中度滑膜炎，炎癥級(jí)別為2；總分7 ～9 分為重度滑膜炎，炎癥級(jí)別為3。

1.3.8 流式檢測(cè)

分離大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。取各組樣本，1×106個(gè)細(xì)胞，100 μL PBS 重懸后，每管加入2 μL OX40-APC、CD4-PerCP-eFluor 710 和CD28-PE 抗體，4℃避光孵育30 min；加入2 mL PBS洗滌1 次，4℃400 r／min，離心5 min，棄上清液；加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定30 min；用1 mL PBS洗2 次，每次3 min，棄去PBS；加入200 μL 用PBS 1 ∶200 稀釋后的抗體PD-1，室溫孵育1 h，用1 mLPBS 洗2 次，每次5 min，棄去PBS；加二抗稀釋液：加入200 μL 用PBS 1 ∶200 稀釋后的二抗，37℃，孵育1 h；用1 mL PBS 洗2 次，每次5 min，棄去PBS；400 μL 的PBS 重懸細(xì)胞，4℃避光保存，上機(jī)檢測(cè)，使用NovoCyte 分析軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.9 Western blot

取各組樣本，采用蛋白抽提試劑盒提取不同組別細(xì)胞總蛋白。 采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。 采用SDS-PAGE 電泳分離總蛋白，每道孔上樣50 μg 總蛋白質(zhì)。 電泳2 h 后，采用濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃孵育一抗PD1（1 ∶1000）、OX40（1 ∶1000）過(guò)夜，次晨采用TBST 漂洗膜，加入HRP 標(biāo)記的二抗Goat anti-Rabbit IgG（1 ∶20 000），37℃孵育1 h，ECL 顯影，保存圖像，采用Quantity One 側(cè)光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 檢驗(yàn)。 以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型鑒定

對(duì)照組大鼠的足均正常（圖1），跖骨和足骨形態(tài)規(guī)則，而模型組大鼠右后足出現(xiàn)明顯紅腫，炎癥嚴(yán)重，跖骨和足骨出現(xiàn)多處紅斑，足趾明顯腫脹，大鼠行走受限。 此模型構(gòu)建成功。

圖1 大鼠模型的鑒定Figure 1 Identification of rat model

2.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)

在大鼠免疫后每7 d 進(jìn)行1 次關(guān)節(jié)炎評(píng)分，結(jié)果如圖2 所示，在第7 天除對(duì)照組外，各組大鼠踝關(guān)節(jié)至跖骨處或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹，在第14天時(shí)除對(duì)照組外，各組大鼠炎癥加重，炎癥因子評(píng)分均在3 分以上，在14 d 以后模型組評(píng)分沒(méi)有明顯的變化，但是來(lái)氟米特組、穴位埋線組和穴位埋線＋來(lái)氟米特組炎癥因子評(píng)分開(kāi)始下降。 在第49 天時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組炎癥因子評(píng)分顯著升高；與模型組比較，來(lái)氟米特組、穴位埋線組和穴位埋線＋來(lái)氟米特組炎癥因子評(píng)分明顯下降，且穴位埋線＋來(lái)氟米特組最低。

注：與對(duì)照組相比， ＃＃P＜0.01；與模型組相比， **P＜0.01。圖2 各組關(guān)節(jié)炎指數(shù)Note.Compared with control group， ＃＃P ＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 2 Arthritis index of each group

2.3 血清中炎癥因子水平

模型組與對(duì)照組比較（圖3），大鼠血清中IL-6、IL-8 含量均顯著升高（P＜0.01）。 與模型組比較，來(lái)氟米特組、穴位埋線組和穴位埋線＋來(lái)氟米特組大鼠血清中IL-6、IL-8 的含量均顯著下降（P＜0.01）。

注：與對(duì)照組相比， ＃＃P＜0.01；與模型組相比， **P＜0.01。圖3 各組大鼠血清中IL-6、IL-8 的含量Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 3 Contents of IL-6 and IL-8 in serum of rats in each group

2.4 組織病理形態(tài)觀察

對(duì)大鼠滑膜組織進(jìn)行HE 染色（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠的關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常，模型組大鼠滑膜組織遭到破壞，有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張，纖維細(xì)胞增生，在進(jìn)行來(lái)氟米特和穴位埋線處理后大鼠滑膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯降低，血管增生被抑制，且在來(lái)氟米特和穴位埋線共同作用時(shí)效果最明顯。 此外，與對(duì)照比較，模型組評(píng)分顯著升高（P＜0.01）。 與模型組比較，來(lái)氟米特組、穴位埋線組和穴位埋線＋來(lái)氟米特組評(píng)分顯著降低（P＜0.01）。

注：與對(duì)照組相比， ＃＃P＜0.01；與模型組相比， **P＜0.01。圖4 大鼠滑膜組織HE 染色Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 4 HE staining of rat synovium

2.5 流式檢測(cè)

流式檢測(cè)的大鼠血中PD-1／OX40 及CD4／CD28 細(xì)胞含量（圖5），與對(duì)照組比較，模型組中大鼠的PD-1 和CD4／CD28 細(xì)胞含量顯著增加（P＜0.01），OX40 顯著降低（P＜0.01）。 與模型組比較，穴位埋線組和穴位埋線＋來(lái)氟米特組的PD-1 和CD4／CD28 細(xì)胞含量顯著降低（P＜0.01），OX40 顯著增加（P＜0.05）。 如圖6 所示，通過(guò)Western blot檢測(cè)相關(guān)通路的變化，與對(duì)照組比較，模型組PD-1的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），OX40 的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。 與模型組比較，來(lái)氟米特組、穴位埋線組和穴位埋線＋來(lái)氟米特組PD-1 的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），OX40 的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。

注：與對(duì)照組相比， ＃＃P＜0.01；與模型組相比， *P＜0.05，**P＜0.01。圖5 流式檢測(cè)PD-1／OX40 及CD4／CD28 細(xì)胞含量Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， *P＜0.05，**P＜0.01.Figure 5 Flow cytometry detection of PD-1／OX40 and CD4／CD28 cell

注：與對(duì)照組相比， ＃＃P＜0.01；與模型組相比， **P＜0.01。圖6 通過(guò)Western blot 檢測(cè)PD-1 和OX40 的蛋白表達(dá)Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 6 Detection of protein expression of PD-1 and OX40 by Western blot

3 討論

RA 是一種慢性的炎癥性關(guān)節(jié)疾病，可導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)損傷和嚴(yán)重殘疾，在過(guò)去的幾年里，在RA 治療方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但其治療機(jī)制尚不明確［11］。 而且，仍有一部分的患者對(duì)這些治療并沒(méi)有得到有效的反應(yīng)。 基于目前對(duì)穴位埋線的研究發(fā)現(xiàn)，穴位埋線不僅能夠有效治療多種疾病，而且還彌補(bǔ)了傳統(tǒng)針灸治療周期長(zhǎng)和刺激時(shí)間短的缺點(diǎn)［12－14］。 李小蘭等［15］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)穴位埋線聯(lián)合西藥治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，結(jié)果實(shí)現(xiàn)其治療效果顯著改善。 本研究中，通過(guò)對(duì)大鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分發(fā)現(xiàn)，穴位埋線和來(lái)氟米特治療后，大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低。 在RA 發(fā)病機(jī)制中，活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子刺激巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。本研究中，在RA 治療中通過(guò)穴位埋線能夠顯著降低大鼠血清中IL-6、IL-8 的含量，緩解了大鼠關(guān)節(jié)炎癥，通過(guò)HE 染色觀察滑膜組織發(fā)現(xiàn)，在穴位埋線后大鼠滑膜關(guān)節(jié)的損傷明顯的得到緩解。

程序性死亡受體1（PD-1），是一種重要的免疫抑制分子，負(fù)責(zé)T 細(xì)胞的激活增殖和細(xì)胞毒性的分泌［16］。 在慢性感染期間，PD-1 由于失去甲基化啟動(dòng)子而在耗盡的CD8 細(xì)胞中表達(dá)［17］。 在一項(xiàng)研究中表明，與健康者比較，三名HL 患者腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞中的PD-1 水平顯著升高［18］。 PD-1 能夠向下調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對(duì)人體細(xì)胞的反應(yīng)，以及通過(guò)抑制T細(xì)胞炎癥活動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。 OX40 是一種有效的共刺激受體，能夠增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞表面的T 細(xì)胞受體信號(hào)，是能被特異性識(shí)別的信號(hào)［19］，其主要由T 細(xì)胞表達(dá)，并在CD4＋T 細(xì)胞上的表達(dá)較高［20］，能夠增強(qiáng)T 細(xì)胞對(duì)效應(yīng)分子和細(xì)胞因子的增殖和表達(dá)，對(duì)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。

之前有研究證明，PD-1 的缺失或阻斷可導(dǎo)致自身免疫性疾病［21］，而OX40 信號(hào)對(duì)自身免疫性疾病具有治療作用［22］。 Ma 等［23］發(fā)現(xiàn)，具有高水平的OX40 和低水平的PD-1 會(huì)使晚期胰腺導(dǎo)管腺癌患者具有更長(zhǎng)的生存時(shí)間。 本研究中，在穴位埋線和給予來(lái)氟米特后OX40 的含量顯著增加，CD4＋CD28＋和PD-1 細(xì)胞含量顯著下降；而RA 模型組中OX40＋的含量最低，CD4＋CD28＋和PD-1 細(xì)胞含量較高。 我們推測(cè)這是在RA 病理中可能存在PD-1 和OX40 共刺激信號(hào)的不平衡，使CD4＋T 細(xì)胞異常激活，從而導(dǎo)致自身免疫。 共刺激分子PD-1 和OX40分別屬于免疫球蛋白家族和TNF 家族，均在CD4＋T細(xì)胞的激活直接具有重要的作用，其異常信號(hào)與多種自身免疫性疾病有關(guān)［9］。

綜上所述，本研究采用CFA 誘導(dǎo)構(gòu)建RA 模型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行穴位埋線和來(lái)氟米特治療后，能夠明顯降低RA 的炎癥程度，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PD-1／OX40 信號(hào)通路有關(guān)。