鄭二帥，曹 猛，李 孌，梁蘭蘭，廖熙娜

（廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東中山 528400）

0 引言

大腸菌群作為食品安全控制環(huán)節(jié)中重要指標(biāo)之一，GB 4789.3—2016 中提供了2 種方法，分別為第一法（MPN 法） 與第二法（平板計(jì)數(shù)法）[1]，不同的企業(yè)會(huì)根據(jù)自身的試驗(yàn)室設(shè)備、試劑、人員技能、樣品種類及對(duì)檢測(cè)結(jié)果交期的需求。自主選擇第一法（MPN 法） 或第二法（平板計(jì)數(shù)法） 進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于2 種方法檢測(cè)靈敏性，不同類型樣品最適的檢測(cè)方法，以確保結(jié)果的符合性研究的較少。規(guī)范不同類產(chǎn)品最適宜的檢測(cè)方法，把好質(zhì)量關(guān)，確保生產(chǎn)產(chǎn)品的食品安全性，是作為食品生產(chǎn)品控工作者的核心職責(zé)。

通過(guò)對(duì)不同類型樣品同時(shí)用2 種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果差異性，對(duì)差異性原因進(jìn)行調(diào)查研究，為不同樣品選擇檢測(cè)方法提供指導(dǎo)依據(jù)[2]。

大腸菌群測(cè)定第一法（MPN 法），采用以月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） 為主要試劑的檢測(cè)方法，通過(guò)在（36±1） ℃培養(yǎng)24～48 h，對(duì)產(chǎn)氣發(fā)酵管，轉(zhuǎn)接到煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） 管中，（36±1） ℃培養(yǎng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，確定樣品中大腸菌群最大可能數(shù)MPN 值。

GB/T 4789.3—2016 大腸菌群測(cè)定第二法（平板計(jì)數(shù)法），采用結(jié)晶紫中性膽鹽瓊脂（VRBA） 主要試劑，以通過(guò)在（36±1） ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取典型和可疑菌落至煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） 管中，（36±1） ℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24～48 h 進(jìn)行復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)。

1 材料試劑與試驗(yàn)方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

抽取兩類典型樣品，A：某公司經(jīng)生產(chǎn)加工產(chǎn)品，細(xì)胞遭受破損的樣品，分別為醬料半成品樣200 份和腐乳半成品樣220 份；B：某公司員工手部、工作服擦拭抽樣，菌落細(xì)胞未經(jīng)物理化學(xué)破壞的樣品，共150 份。

1.1.2 試劑

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（KHPO）、無(wú)菌生理鹽水、1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl 溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：GB 4789.3—2016 的方法要求，分別采用第一法（MPN 法） 和第二法（平板計(jì)數(shù)法） 對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)產(chǎn)品內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照檢測(cè)結(jié)果對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行合格率判定。

1.3 樣品合格率判定標(biāo)準(zhǔn)

樣本的大腸菌群數(shù)合格判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定，大腸菌群數(shù)＜3.6 MPN/g 或者＜3.6 CFU/g。

2 檢測(cè)過(guò)程及結(jié)果

2.1 檢測(cè)過(guò)程

樣品檢測(cè)均使用同一品牌同一批次的試劑，消除試劑的誤差影響，檢測(cè)人員為同一組2 名人員，均為檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)3 年以上人員，以消除檢測(cè)過(guò)程的人員操作誤差。

2.2 檢測(cè)結(jié)果

第一法（MPN 法） 和第二法（平板計(jì)數(shù)法） 的檢測(cè)結(jié)果比較見表1，不同檢測(cè)方法樣品不合格率對(duì)比見圖1。

圖1 不同檢測(cè)方法樣品不合格率對(duì)比

表1 第一法（MPN 法） 和第二法（平板計(jì)數(shù)法） 的檢測(cè)結(jié)果比較

2.2.1 結(jié)果分析

由表1 可知，采用GB 4789.3—2016 檢測(cè)腐乳、醬料半成品樣、員工手部、工作服擦拭樣的不合格率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（X2=0.076，p＞0.05） 差異無(wú)顯著性，在總計(jì)570 份樣品，第一法（MPN 法） 檢測(cè)結(jié)果超出內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)為44 個(gè)，占比7.72%。第二法（平板計(jì)數(shù)法） 檢測(cè)結(jié)果超出內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)為33 個(gè)，占比5.79%。第二法（平板計(jì)數(shù)法） 與第一法（MPN 法） 相比，絕對(duì)偏低1.93%，同比相對(duì)偏低25.0%。

不同類樣品檢測(cè)結(jié)果差異性較大，其中腐乳、醬料半成品樣品，第一法（MPN 法） 的檢測(cè)結(jié)果依據(jù)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)判定不合格率，分別為8.18%，5.50%；第二法（平板計(jì)數(shù)法） 檢測(cè)結(jié)果依據(jù)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)判定不合格率分別為5.45%，3.50%。第二法（平板計(jì)數(shù)法） 與第一法（MPN 法） 相比，分別絕對(duì)偏低2.75%，2.00%，同比相對(duì)偏低33.6%，36.4%；2 種方法的檢測(cè)結(jié)果偏差比較大，第二法（平板計(jì)數(shù)法） 檢測(cè)量明顯低于第一法（MPN 法） 的檢出量。

員工手部、工作服抽樣品，第一法的檢測(cè)結(jié)果依據(jù)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)判定不合格率為10.0%，第二法（平板計(jì)數(shù)法） 的檢測(cè)結(jié)果依據(jù)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)判定不合格率為9.3%，第二法（平板計(jì)數(shù)法） 與第一法（MPN 法）相比，絕對(duì)偏低0.7%，同比相對(duì)偏低7%；2 種方法的檢測(cè)結(jié)果偏差不明顯。

2.2.2 原因分析

（1） 樣品的差異性- 細(xì)胞破損程度。腐乳、調(diào)味醬樣品中存在的鹽分、香辛料、防腐劑等抑菌物質(zhì)會(huì)使微生物生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致微生物代謝緩慢、代謝速率不一致。同時(shí)，調(diào)味醬樣品中存在的油脂會(huì)包埋微生物，影響生長(zhǎng)。該類產(chǎn)品經(jīng)歷了物理打磨、加熱等生產(chǎn)加工破壞，部分細(xì)胞處于受損狀態(tài)，活性不足。需要在修復(fù)受損細(xì)胞后方能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行繁殖生長(zhǎng)。

設(shè)備、容器工器具表面、手部表面取樣，通過(guò)涂抹、擦拭或沖洗取得的樣品中，含量微生物大多處于完好活躍狀態(tài)，在適宜條件下能夠快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行繁殖，在檢測(cè)過(guò)程中顯化出來(lái)。

（2） 檢測(cè)方法差異性。第一法（MPN 法） 中，初發(fā)酵試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白豚肉湯（LST） 中含有磷酸氫二甲和磷酸二氫鉀是較好的緩沖劑，能夠較好維持LST 肉湯的PH 處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，更適合大腸菌群生長(zhǎng)[3]。第一法（MPN 法） 的初發(fā)酵時(shí)間是24～48 h，相對(duì)延長(zhǎng)的初發(fā)酵時(shí)間，可使受損的細(xì)胞得到較為充分的恢復(fù)時(shí)間。因?yàn)榧庸な称反蠖嘟?jīng)過(guò)磨碎、高溫或冷凍等處理，大部分細(xì)菌的細(xì)胞處于受損狀態(tài)，細(xì)胞修復(fù)恢復(fù)活性需要時(shí)間較長(zhǎng)，延長(zhǎng)到48 h，可以使細(xì)胞得到較為充分的恢復(fù)時(shí)間，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后積累一定的量，使檢測(cè)結(jié)果顯化出來(lái)，從而使初發(fā)酵管呈陽(yáng)性，降低漏檢幾率。

第二法（平板計(jì)數(shù)法） 中，在結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂的培養(yǎng)時(shí)間為18～24 h，此過(guò)程中，部分受損的細(xì)胞尚未修復(fù)完畢進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[4]。沒有充足的時(shí)間在平板上形成菌落形態(tài)，檢測(cè)操作時(shí)覆蓋的瓊脂厚薄程度存在差異，也會(huì)造成菌落呈現(xiàn)的不一致性，存在一定數(shù)量的漏檢菌落群，因此結(jié)果偏低[5]。

3 結(jié)論

3.1 第一法（MPN 法） 和第二法（平板計(jì)數(shù)法） 檢測(cè)靈敏性

（1） 對(duì)于經(jīng)過(guò)破壞性生產(chǎn)加工的樣品，使用第一法（MPN 法） 檢測(cè)的檢出量要平均高于第二法（平板計(jì)數(shù)法） 的檢出量。第一法（MPN 法） 的檢測(cè)靈敏性更高一些。

（2） 對(duì)于一般性表面擦拭抽取樣品，如設(shè)備、容器工器具表面、手部表面取樣等，第一法（MPN法） 和第二法（平板計(jì)數(shù)法） 的檢測(cè)量水平基本一致，無(wú)明顯差異性。2 種方法檢測(cè)靈敏性無(wú)明顯差異性。

3.2 檢測(cè)方法優(yōu)劣對(duì)比性

在方法優(yōu)劣性對(duì)比，第一法（MPN 法），優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)靈敏度高，準(zhǔn)確性更強(qiáng)，檢測(cè)操作過(guò)程相對(duì)比較簡(jiǎn)便，對(duì)人員操作技能要求相對(duì)較低；缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)，需要72～96 h。第二法（平板計(jì)數(shù)法）[6]，優(yōu)點(diǎn)：耗時(shí)短，需要48～72 h；缺點(diǎn)：相對(duì)第一法的靈敏度要略低，檢測(cè)操作步驟多，操作比較繁瑣，對(duì)平板典型菌落的判定和計(jì)數(shù)需要較高的認(rèn)知能力，對(duì)檢測(cè)人員技能要求高，檢測(cè)成本高。

3.3 檢測(cè)指導(dǎo)建議

在方法選擇上，可以按照如下原則選擇：

（1） 對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程半成品及終產(chǎn)品等經(jīng)歷破壞性加工的樣品，可優(yōu)先選擇第一法（MPN 法） 進(jìn)行檢測(cè)，以確保檢測(cè)結(jié)果接近的真實(shí)水平的符合度。

（2） 對(duì)于一般性表面擦拭抽取樣品，如設(shè)備、容器工器具表面、手部表面取樣等，第一法（MPN法） 和第二法的檢測(cè)量水平基本一致，無(wú)明顯差異性。試驗(yàn)室可根據(jù)自身的試劑、儀器及交期要求自由選擇檢測(cè)方法。

（3） 對(duì)于部分樣本目標(biāo)菌含量較高，需要盡快了解樣本目標(biāo)菌群大致含量的，可采用第二法（平板計(jì)數(shù)法） 進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)平板上的典型菌落，做出大致性的初步結(jié)果報(bào)告，然后復(fù)發(fā)酵進(jìn)一步長(zhǎng)期驗(yàn)證試驗(yàn)。

建立在選取的2 種典型樣本類型基礎(chǔ)上做的分析結(jié)論，作為指導(dǎo)性的建議，并無(wú)絕對(duì)的要求，各實(shí)驗(yàn)室需要綜合根據(jù)試驗(yàn)條件、檢驗(yàn)交期、成本控制、人員技能等方面進(jìn)行綜合判斷，選擇檢測(cè)方法。