孫語(yǔ)新，龔曉娟，郝秀麗，田雨馨，陳藝銘，張寶，閻春霞

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061；2.國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西安交通大學(xué)，陜西 西安 710061；3.中國(guó)西部科技創(chuàng)新港 西安交通大學(xué)生物證據(jù)研究院，陜西 西安 712000

嬰兒猝死綜合征（sudden infant death syndrome，SIDS）是指小于1 歲的嬰兒突發(fā)的、意外的在睡眠中發(fā)生的死亡，通過(guò)尸體檢驗(yàn)、毒物分析、現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)以及對(duì)死亡環(huán)境、臨床病史的詳細(xì)調(diào)查，仍無(wú)法解釋其原因[1]。約90%的SIDS 發(fā)生在6 月齡及以下的嬰兒[2]，在2～4 月齡時(shí)發(fā)生率最高。在發(fā)達(dá)國(guó)家，SIDS 的發(fā)生率約為0.5‰～2.5‰[3]，在我國(guó)SIDS 約占嬰兒總死亡率的11.9%[4]。有研究[5-8]顯示，心律失常、腦干的神經(jīng)化學(xué)異常、感染等可能參與SIDS 的發(fā)生。但迄今為止，SIDS 的致病機(jī)制仍不明確，是目前法醫(yī)鑒定實(shí)踐面臨的難點(diǎn)問(wèn)題之一。

三重風(fēng)險(xiǎn)模型是SIDS的主要病因模型，該模型提出，SIDS由3個(gè)因素共同導(dǎo)致，即脆弱的嬰兒進(jìn)入關(guān)鍵發(fā)育期并受外源性應(yīng)激因素影響容易發(fā)生猝死[9]。研究[5,10-12]表明，遺傳因素是導(dǎo)致嬰兒脆弱性的內(nèi)在因素，包括導(dǎo)致長(zhǎng)QT 間期綜合征（long QT syndrome，LQTS）的基因突變、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的基因多態(tài)性。而在環(huán)境危險(xiǎn)因素方面，嬰兒感染與SIDS的關(guān)系也被廣泛關(guān)注。SIDS的年齡分布與母源抗體水平在新生兒出生后逐漸下降有關(guān)聯(lián)[13]。有調(diào)查[13-14]發(fā)現(xiàn)，很多SIDS病例死亡前有感染現(xiàn)象，尸體檢驗(yàn)時(shí)微生物檢測(cè)呈陽(yáng)性，提示感染和炎癥反應(yīng)可能對(duì)SIDS產(chǎn)生影響，但仍未發(fā)現(xiàn)與SIDS相關(guān)的特異性微生物。細(xì)菌毒素假說(shuō)認(rèn)為，在母源抗體降低、自身免疫系統(tǒng)未發(fā)育成熟之前，嬰兒上呼吸道內(nèi)的微生物及其所產(chǎn)生的毒素可能會(huì)導(dǎo)致炎癥因子風(fēng)暴，從而引起中毒性休克或敗血性休克導(dǎo)致死亡[15]。

嬰兒感染性猝死（infectious sudden death in infancy，ISDI）與SIDS 均屬于嬰兒人群中突然的、意外的猝死，但是ISDI 直接死因明確，為病原體感染所致，而SIDS 直接死因不明確。為了探究SIDS 與ISDI是否存在共同的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，尋找SIDS 發(fā)生的免疫炎癥機(jī)制和精準(zhǔn)診斷的分子標(biāo)記，以便在醫(yī)療糾紛、家庭暴力、殺嬰、虐待嬰幼兒等案件中精準(zhǔn)鑒別SIDS 與ISDI，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，對(duì)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）公共數(shù)據(jù)平臺(tái)GSE70422 和GSE136992 數(shù)據(jù)集中的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，篩選SIDS 和ISDI 死者不同組織樣本中共同的差異表達(dá)mRNA，利用基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）對(duì)共同的差異表達(dá)mRNA進(jìn)行富集分析，并確定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)中的hub 基因。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從NCBI 的GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載mRNA數(shù)據(jù)集GSE70422和GSE136992。GSE70422 數(shù)據(jù)集包括15 例SIDS 和15 例對(duì)照（意外事故、分娩并發(fā)癥等）死者的腦、心臟和肝組織，其中SIDS 和對(duì)照死者均經(jīng)過(guò)系統(tǒng)尸體解剖明確死因，年齡相匹配。使用全基因組基因表達(dá)芯片DASL HT（美國(guó)Illumina 公司）測(cè)定mRNA 表達(dá)。GSE136992 數(shù)據(jù)集包括14 例ISDI 和14 例對(duì)照（非急性感染性死亡）死者的腦、心臟和肝組織，其中ISDI 病例在死亡前沒(méi)有嚴(yán)重的器質(zhì)性疾病史；該數(shù)據(jù)集中ISDI 和對(duì)照死者均經(jīng)過(guò)系統(tǒng)尸體解剖明確死因，年齡相匹配。使用全基因組基因表達(dá)芯片DASL HT 測(cè)定mRNA 表達(dá)。兩個(gè)數(shù)據(jù)集均已使用R 4.1.0 軟件Bioconductor 包進(jìn)行背景校正和分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，且兩個(gè)數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)分析均表明種族和年齡對(duì)基因的差異表達(dá)沒(méi)有影響[16-17]，樣本詳細(xì)信息見表1。

表1 GSE70422 和GSE136992 數(shù)據(jù)集的樣本統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics of the samples in GSE70422 and GSE136992 database （例）

1.2 差異基因的分析

對(duì)GSE70422 和GSE136992 數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用R 4.1.0 軟件將GPL14951 平臺(tái)探針I(yè)D 轉(zhuǎn)化為基因符號(hào)，對(duì)同一個(gè)基因的多個(gè)探針取表達(dá)量均值最高的探針。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，檢查并刪除缺失值過(guò)多的基因和樣本。將數(shù)據(jù)按照腦、心臟、肝組織分成3 組，分別對(duì)不同組織的基因表達(dá)量用R 軟件limma 包進(jìn)行差異表達(dá)分析[18]，篩選出3 個(gè)組織的差異基因，篩選條件：差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）取以2為底的對(duì)數(shù)（log2FC）的絕對(duì)值大于1、P值小于0.05。最后使用R 軟件ggplot2 包繪制火山圖。

1.3 SIDS 和ISDI 數(shù)據(jù)集共同差異基因的篩選

對(duì)于同一個(gè)組織，將SIDS 差異基因（GSE70422數(shù)據(jù)集）與ISDI 差異基因（GSE136992 數(shù)據(jù)集）取交集，將P的閾值設(shè)置為0.01，獲得每個(gè)組織的共同差異基因，按差異基因來(lái)源組織、在SIDS 組的P值大小進(jìn)行排序。

1.4 GO 和KEGG 富集分析

GO 數(shù)據(jù)庫(kù)將基因功能分成生物過(guò)程（biological process）、分子功能（molecular function）和細(xì)胞組分（cellular component）3 個(gè)部分。為了解析共同差異基因的功能和信號(hào)通路，利用R 軟件clusterProfiler、org.Hs.eg.db 和ggplot2 包以及enrichgo 和enrichKEGG 函數(shù)對(duì)共同差異基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析[19]，并繪制條形圖與表格。

1.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

STRING（https://www.string-db.org/）是分析已知和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)于同一組織，將SIDS 和ISDI 組共同差異基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)[20]，以互作評(píng)分大于0.75 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 3.8.2 軟件（https://cytoscape.org/）中cytoHubba 插件的Betweenness、Closeness、Degree、EPC、MNC 5 種拓?fù)浞治鏊惴ㄓ?jì)算共同差異基因的得分，并取交集。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的分析結(jié)果

數(shù)據(jù)集中沒(méi)有檢查到缺失值過(guò)多的基因和樣本。與對(duì)照病例相比，SIDS 病例的腦組織中有200 個(gè)差異基因，心臟組織中有1 058 個(gè)差異基因，肝組織中有597個(gè)差異基因；ISDI病例的腦組織中有339個(gè)差異基因，心臟組織中有798 個(gè)差異基因，肝組織中有469 個(gè)差異基因。SIDS 病例和ISDI 病例不同組織中差異基因的火山圖見圖1，上調(diào)和下調(diào)情況見表2。

圖1 SIDS 和ISDI病例腦、心臟和肝組織中差異基因的火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes in SIDS and ISDI samples of brain，heart and liver tissue

表2 SIDS 和ISDI病例不同組織中差異基因的數(shù)量統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of the differentially expressed genes in SIDS and ISDI in different tissues（個(gè)）

2.2 SIDS 和ISDI 病例的共同差異基因

通過(guò)重疊分析，SIDS 和ISDI 病例3 個(gè)組織中共有207 個(gè)共同差異基因，其中腦組織中22 個(gè)、心臟組織中126 個(gè)、肝組織中59 個(gè)。在207 個(gè)共同差異基因中進(jìn)一步選取P值均小于0.01 的共同差異基因，得到19 個(gè)顯著差異表達(dá)的基因（表3）。其中星形肌動(dòng)蛋白1（astrotactin 1，ASTN1）在SIDS 和ISDI 病例中差異表達(dá)的P值均低于0.001。

表3 SIDS 和ISDI病例中的共同差異基因Tab.3 The common differentially expressed genes in SIDS and ISDI

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了探究SIDS 與ISDI 發(fā)生過(guò)程是否存在相同的機(jī)制，對(duì)得到的207 個(gè)共同差異基因進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。結(jié)果顯示，腦組織的共同差異基因中沒(méi)有顯著的交互關(guān)系；心臟組織的共同差異基因中共有109 個(gè)節(jié)點(diǎn)和14 條連線（圖2 中僅顯示有交互關(guān)系的節(jié)點(diǎn)）；肝組織的共同差異基因中共有54 個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 條連線，交互關(guān)系并不顯著。

圖2 心臟組織中共同差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network of common differentially expressed genes in the heart tissue

此外，由于心臟組織中的共同差異基因在PPI 網(wǎng)絡(luò)中相互作用顯著，本研究采取5 種拓?fù)渌惴ǚ治鲞@些共同差異基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算出得分排名前5 位的hub 基因（表4）。將5 種算法的結(jié)果取交集后獲得同時(shí)參與SIDS 和ISDI 的3 個(gè)關(guān)鍵基因，即RHOA、整合素亞單 位α1（integrin subunit alpha 1，ITGA1）和H2B 簇狀組蛋白5（H2B clustered histone 5，H2BC5）。

表4 5 種拓?fù)浞治鏊惴ㄓ?jì)算得到的排名前5 位的hub 基因Tab.4 Top 5 hub genes by five topology analysis algorithms

2.4 GO 和KEGG 富集分析

對(duì)上述SIDS 和ISDI 病例的207 個(gè)共同差異基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。

GO 分析結(jié)果（圖3）顯示：在心臟組織中，生物過(guò)程主要富集在對(duì)霉酚酸的反應(yīng)和后腎發(fā)育，共同差異基因p21 活化激酶2（p21 activated kinase 2，PAK2）、纖維連接蛋白1（fibronectin 1，F(xiàn)N1）和Ras同源基因家族成員A（ras homolog family member A，RHOA）主要參與軸突發(fā)生的調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分主要富集在頂端連接復(fù)合體和核周質(zhì)；分子功能主要富集在蛋白酪氨酸激酶激活劑活性中。在肝組織中，細(xì)胞組分主要富集在次級(jí)顆粒與三級(jí)顆粒；分子功能主要富集在激酶調(diào)節(jié)活性。在腦組織中無(wú)顯著富集結(jié)果。

圖3 SIDS 和ISDI病例心臟組織和肝組織中共同差異基因的GO 富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes of heart and liver tissue both in SIDS and ISDI groups

KEGG 結(jié)果顯示：在心臟組織中，通路主要涉及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（P=9.5×10-5）和黏著斑（P=4.7×10-4）。在肝組織和腦組織中無(wú)顯著富集結(jié)果。

3 討論

在SIDS 發(fā)生機(jī)制不明晰、感染與SIDS 關(guān)系密切的背景下，探究免疫功能相關(guān)蛋白在SIDS 致病過(guò)程中的作用至關(guān)重要。越來(lái)越多的證據(jù)[21-23]表明，炎癥和免疫影響心肌細(xì)胞的電生理特性，可能參與調(diào)節(jié)先天性LQTS的臨床表型，也是獲得性LQTS的潛在病因。此外，有研究[24]發(fā)現(xiàn)，免疫調(diào)節(jié)基因多態(tài)性導(dǎo)致細(xì)胞因子循環(huán)水平上調(diào)或下調(diào)，可能會(huì)破壞正常和過(guò)渡細(xì)胞功能與免疫反應(yīng)之間的平衡，從而導(dǎo)致嬰兒容易受到細(xì)胞因子風(fēng)暴的影響。據(jù)報(bào)道，IL-10基因啟動(dòng)子多態(tài)性與SIDS 的發(fā)生顯著相關(guān)[25]，SIDS 腦脊液中IL-6水平與死于腦膜炎和敗血癥的嬰兒腦脊液中高水平的IL-6（大于100 pg/mL）相當(dāng)[26]，在SIDS 中發(fā)現(xiàn)炎癥相關(guān)基因的顯著差異表達(dá)[16]。以上研究提示，免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化合并感染，可能會(huì)誘發(fā)SIDS。

本研究結(jié)果表明，心臟組織中ASTN1、H2A簇狀組蛋白6（H2A clustered histone 6，H2AC6）和神經(jīng)軟骨素（neurochondrin，NCDN）基因表達(dá)在SIDS 和ISDI 病例均顯著下調(diào)。肝組織中，Krüppel樣因子4（Krüppellike factor 4，KLF4）基因表達(dá)在SIDS 和ISDI 病例均顯著下調(diào)。ASTN1 是一種神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，在神經(jīng)母細(xì)胞的遷移中發(fā)揮作用[27]。神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵期與SIDS 發(fā)生高峰期時(shí)間重合，提示神經(jīng)發(fā)育異?？赡軈⑴cSIDS 的發(fā)生。同時(shí)，在非中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者中也發(fā)現(xiàn)有ASTN1基因突變，研究顯示，ASTN1降低了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其表達(dá)與B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在原發(fā)性肝癌中的浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)[28]，且影響小細(xì)胞肺癌的進(jìn)程[29]。這些研究提示ASTN1 不僅在中樞神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，還與細(xì)胞增殖、免疫防御相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ASTN1基因表達(dá)量在SIDS 和ISDI 病例的心臟組織中顯著下調(diào)（P<0.001），而在肝和腦組織中表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ASTN1 在心臟中的功能值得進(jìn)一步研究。H2AC6 是真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)核小體結(jié)構(gòu)的4 個(gè)核心組蛋白之一，研究[30]發(fā)現(xiàn)，H2AC6表達(dá)與冠心病相關(guān)，也與空腹血糖、收縮壓、舒張壓等6 個(gè)心血管代謝特征相關(guān)[31]。NCDN 是一種胞質(zhì)蛋白，在神經(jīng)生長(zhǎng)、谷氨酸受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和突觸可塑性中發(fā)揮重要作用[32]。NCDN會(huì)在缺血性腦卒中患者的血液樣本中差異表達(dá)[33]，其變異可引發(fā)癲癇[26]。此外，NCDN 還與自身免疫相關(guān)聯(lián)，NCDN 通過(guò)限制中性粒細(xì)胞對(duì)細(xì)菌感染的清除作用抑制小鼠對(duì)肺炎球菌感染的先天免疫[34]；NCDN 被鑒定為自身免疫性小腦變性中的神經(jīng)元靶抗原[35]，其抗體的產(chǎn)生與自身免疫性小腦性共濟(jì)失調(diào)相關(guān)[36]。KLF4 是一種含鋅指的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化。多項(xiàng)研究表明，KLF4 在調(diào)節(jié)炎癥的過(guò)程中發(fā)揮作用[37]，被認(rèn)為是細(xì)胞抗病毒反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子[38]，并調(diào)控細(xì)胞因子IL-6[39]、IL-1β 和IL-10[40-41]的表達(dá)。此外，KLF4 還通過(guò)結(jié)合蛋白在多種血管疾病中產(chǎn)生影響[42]。

其余共有的差異表達(dá)基因與SIDS 或ISDI 的關(guān)聯(lián)還不明晰。共同差異基因集中在心臟組織，提示心臟功能基因表達(dá)失調(diào)是引起猝死的重要機(jī)制。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，發(fā)病1 h 內(nèi)死亡者多為心臟性猝死，一項(xiàng)對(duì)490 例1～35 歲心臟性猝死者的研究[43]發(fā)現(xiàn)，心臟性猝死最常見的原因是冠狀動(dòng)脈疾?。ㄕ?4%）和遺傳性心肌病（占16%）。而免疫功能發(fā)育不完全可能是SIDS的深層原因，最終關(guān)聯(lián)到心臟，表現(xiàn)出心功能的失常。

KEGG 富集分析結(jié)果表明，在SIDS 和ISDI 病例心臟組織中，共同差異基因參與的通路主要涉及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)和黏著斑。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架影響細(xì)胞的遷移、收縮和吞噬作用[44]。黏著斑是細(xì)胞的定位點(diǎn)，細(xì)胞黏附對(duì)免疫細(xì)胞外滲、遷移及炎癥等防御反應(yīng)至關(guān)重要。GO 結(jié)果顯示，在心臟組織中，生物過(guò)程主要富集在對(duì)霉酚酸的反應(yīng)和后腎發(fā)育通路中。霉酚酸是一種應(yīng)用廣泛的免疫抑制劑，在臨床上具有抗免疫排斥反應(yīng)、抗腫瘤與抗病毒的應(yīng)用價(jià)值，可選擇性地阻斷淋巴細(xì)胞的增殖，抑制抗原呈遞細(xì)胞的活性，從而抑制B 淋巴細(xì)胞向記憶細(xì)胞與漿細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且降低細(xì)胞因子分泌[45]。肝組織中，細(xì)胞組分富集在次級(jí)顆粒和三級(jí)顆粒中，兩者主要存在于中性粒細(xì)胞的分泌顆粒[46]。綜上，共同差異基因富集在免疫與炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路中，表明SIDS 與ISDI 病例在免疫相關(guān)基因表達(dá)缺陷方面存在共同之處。

本研究結(jié)果表明，心臟組織中共有3 個(gè)hub 基因（RHOA、ITGA1、H2BC5）參與SIDS 與ISDI。RHOA屬于小GTP 酶，是Ras 同源家族成員；RHOA 蛋白能促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組并調(diào)節(jié)細(xì)胞的形狀、附著和運(yùn)動(dòng)，通過(guò)調(diào)控微絲重組參與細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等過(guò)程，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中起分子開關(guān)的作用[47]。RHOA 所在的信號(hào)通路與充血性心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化和急性缺血性腦卒中等心血管疾病相關(guān)[48]。RHOA 還是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵因子[49]。ITGA1 作為整合素的組成部分，通過(guò)控制細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附影響發(fā)育、免疫、炎癥等調(diào)節(jié)[50]。多項(xiàng)研究[51-52]表明，ITGA1 與自身免疫性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤的發(fā)展有關(guān)。H2BC5 是組成染色質(zhì)的核小體結(jié)構(gòu)的基本蛋白分子。這3 個(gè)hub 基因和免疫與炎癥反應(yīng)相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫功能在SIDS 中的作用。

綜上，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選出了SIDS與ISDI猝死者腦、心臟和肝組織中差異表達(dá)的mRNA，發(fā)現(xiàn)了ASTN1、H2AC6和NCDN等共同差異基因；經(jīng)功能和通路分析發(fā)現(xiàn)，共同差異基因富集在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、黏著斑和免疫反應(yīng)等相關(guān)的信號(hào)通路；構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，確定了RHOA、ITGA1和H2BC5共3 個(gè)在互作網(wǎng)絡(luò)中有高連接度的基因。上述結(jié)果表明，SIDS 與ISDI 可能存在某些共同的調(diào)控機(jī)制，這些發(fā)現(xiàn)有望為嬰兒猝死的法醫(yī)學(xué)鑒定提供分子標(biāo)志物參考。