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過(guò)敏性鼻炎患兒血清miR-124-3p 和GATA3表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度、Th1/ Th2 平衡的關(guān)系

2023-12-01 14:44:44陳玉卿莊潔蓮姜善雨
關(guān)鍵詞:鼻炎過(guò)敏性細(xì)胞因子

陳玉卿 莊潔蓮 姜善雨

江蘇省無(wú)錫市婦幼保健院兒童保健耳鼻喉科,江蘇無(wú)錫 214002

兒童過(guò)敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)又稱(chēng)變應(yīng)性鼻炎,是兒童主要的呼吸道炎癥疾病,主要臨床表現(xiàn)為鼻癢、鼻塞、打噴嚏及頭痛等癥狀,對(duì)兒童的生活質(zhì)量造成很大影響[1-2]。目前關(guān)于A(yíng)R 的發(fā)病機(jī)制尚未明確,多數(shù)研究認(rèn)為與Ⅱ型輔助性T 細(xì)胞[typeⅠhelper T cell,Th1)/Ⅱ型輔助性T 細(xì)胞(type Ⅱhelper T cell,Th2)免疫失衡有關(guān),糾正Th1/Th2 免疫失衡是防治AR 的關(guān)鍵[3]。微RNA(microRNA,miRNA)參與機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié),作為疾病診斷與病情評(píng)估的分子標(biāo)志物[4]。微RNA-124-3p(miR-124-3p)是一種重要的miRNA 之一,研究顯示,miR-124-3p 與腫瘤發(fā)生、病毒感染、炎癥反應(yīng)等多種病理過(guò)程有關(guān)[5-6]。Hou 等[7]通過(guò)分析異丙托溴銨治療AR 小鼠后miRNAs表達(dá)譜發(fā)現(xiàn),miR-124-3p 表達(dá)水平顯著升高,提示miR-124-3p 與AR 小鼠鼻黏膜過(guò)敏性免疫相關(guān)。GATA 結(jié)合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)是一種轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控原初性T 細(xì)胞向Ⅱ分化,Th2 細(xì)胞在A(yíng)R 中起著重要作用[8]。研究顯示,使用攜帶miR-466a-3p 的慢病毒治療AR 小鼠,miR-466a-3p可負(fù)調(diào)節(jié)GATA-3 表達(dá),減輕小鼠AR 癥狀[9]。經(jīng)生物信息學(xué)分析顯示,miR-124-3p 與GATA3 有靶向結(jié)合位點(diǎn),推測(cè)二者共同參與AR 的發(fā)生,本研究探討AR患兒血清miR-124-3p、GATA3 表達(dá)與患兒疾病嚴(yán)重程度、Th1/Th2 平衡的相關(guān)性,為AR 的防治提供理論支撐。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020 年6 月至2022 年4 月在江蘇省無(wú)錫市婦幼保健院(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”)兒童保健耳鼻喉科確診的AR 患兒87 例為觀(guān)察對(duì)象(AR 組),其中男42 例,女45 例;年齡3~12 歲,平均(7.40±2.35)歲。按癥狀嚴(yán)重程度[10]分為輕度組53 例,中重度組34例。另選取同期在我院健康體檢兒童85 名為對(duì)照組,其中男45 名,女40 名;年齡3~13 歲,平均(7.20±2.40)歲。兩組性別、年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合2019 年《兒童過(guò)敏性鼻炎診療——臨床實(shí)踐指南》[10]中的診斷標(biāo)準(zhǔn),其中輕度AR 為對(duì)睡眠、學(xué)習(xí)等生活質(zhì)量未產(chǎn)生明顯影響,中重度AR 表現(xiàn)為癥狀較重或?qū)ι钯|(zhì)量產(chǎn)生影響;②臨床資料完整;③所有患兒家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人知情并同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并哮喘、肺結(jié)核等呼吸道疾?。虎诤喜⒚庖呦到y(tǒng)疾病或其他慢性炎癥性疾??;③近期使用免疫抑制劑;④肝腎功能不全。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)的審核并批準(zhǔn)(2022-01-0302-03)。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集及保存 采集AR 患兒確診24 h 內(nèi)及對(duì)照組兒童體檢當(dāng)日清晨空腹靜脈血5 ml 各兩份,其中一份3 000 r/min(離心半徑15 cm),離心15 min,收集上清,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩A硪环菁尤肓馨图?xì)胞分離液,分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),檢測(cè)Th1/Th2。

1.2.2 血清miR-124-3p 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測(cè)血清miR-124-3p 水平,RNA 提取試劑盒(德國(guó)Qiagen)提取血清的總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 濃度及純度,取2 μg 的RNA 使用miScript Reverse Transcription kit(德國(guó)Qiagen)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,于-20℃冰箱保存。使用RT-PCR 試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)體系為50 μl,其中10×PCR Buffer 5 μl,dNTPs 1 μl,正反向引物各1 μl,DNA模板2 μl,Tap 酶0.5μl,加雙蒸水至50μl。反應(yīng)條件:95℃10min,38 個(gè)循環(huán),94℃30 s,60℃30 s,70℃30 s。引物購(gòu)自上海生物工程技術(shù)公司,miR-124-3p 正向引物(5’-3’):CGACGTAAGGCACGCG;反向引物(5’-3’):CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT;U6 正向引物(5’-3’):CGAGCACAGAATCGCTTCA;反向引物(5’-3’):CTCGCTTCGGCAGCACATAT。以U6 作為內(nèi)參,采用2-△△Ct分析miR-124-3p 表達(dá)水平。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1/Th2 外周血經(jīng)密度梯度離心分離PBMCs,分別加入PE/Cy5 表示的-CD3 抗體和FITC 標(biāo)記的CD8 抗體孵育20 min,經(jīng)裂解,破膜后,分別加入PE 標(biāo)記的γ 干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、PE 標(biāo)記的白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)抗體標(biāo)記細(xì)胞,抗體購(gòu)自美國(guó)BD 公司,采用FACS 型流式細(xì)胞儀檢測(cè),以IFN-γ、IL-4 表示Th1、Th2 細(xì)胞比例,并計(jì)算Th1/Th2。

1.2.4 其他指標(biāo)檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10、GATA3 水平,IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Abcam公司,GATA3 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢楚銳科藥業(yè)科技有限公司,嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,采用χ2檢驗(yàn)。AR 患兒血清miR-124-3p 表達(dá)與GATA3 相關(guān)性、miR-124-3p、GATA3 與Th1/Th2 及細(xì)胞因子相關(guān)性采用Pearson 法分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-124-3p、GATA3 水平比較

AR 組血清miR-124-3p 表達(dá)水平低于對(duì)照組,GATA3 水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中重度組血清miR-124-3p 表達(dá)水平低于輕度組,GATA3 水平高于輕度組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清miR-124-3p、GATA3 水平比較()

表1 兩組血清miR-124-3p、GATA3 水平比較()

注 與對(duì)照組比較,aP<0.05;與輕度組比較,bP<0.05。MiR-124-3p:微RNA-124-3p;GATA3:GATA 結(jié)合蛋白3;AR:過(guò)敏性鼻炎。

2.2 AR 組與對(duì)照組外周血Th1、Th2 細(xì)胞比例及Th1/Th2 比較

AR 組Th1 細(xì)胞比例和Th1/Th2 比值低于對(duì)照組,Th2 細(xì)胞比例高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 AR 組與對(duì)照組外周血Th1、Th2 細(xì)胞比例及Th1/Th2 比較()

表2 AR 組與對(duì)照組外周血Th1、Th2 細(xì)胞比例及Th1/Th2 比較()

注AR:過(guò)敏性鼻炎;Th:輔助性T 細(xì)胞。

2.3 AR 組與對(duì)照組Th1、Th2 細(xì)胞因子水平比較

AR 組血清IFN-γ、IL-12 水平低于對(duì)照組,IL-4、IL-5、IL-10 水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 AR 組與對(duì)照組Th1 與Th2 細(xì)胞因子水平比較(ng/L,)

表3 AR 組與對(duì)照組Th1 與Th2 細(xì)胞因子水平比較(ng/L,)

注AR:過(guò)敏性鼻炎;IFN-γ:γ 干擾素;IL:白細(xì)胞介素。

2.4 AR 患兒miR-124-3p、GATA3 水平相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示,AR 患兒血清miR-124-3p 表達(dá)水平與GATA3 水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.495,P<0.05),見(jiàn)圖1。經(jīng)starbase 分析顯示,miR-124-3p 與GATA3有靶向結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖2。

圖1 AR 患兒miR-124-3p、GATA3 水平相關(guān)性

圖2 miR-124-3p 與GATA3 靶向結(jié)合位點(diǎn)

2.5 AR 患兒miR-124-3p、GATA3 表達(dá)與Th1/Th2及細(xì)胞因子相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示,miR-124-3p 與Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-12 呈正相關(guān)(r>0,P<0.05),與Th2、IL-4、IL-5、IL-10 呈負(fù)相關(guān)(r<0,P<0.05);GATA3 與Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-12 呈負(fù)相關(guān)(r<0,P<0.05),與Th2、IL-4、IL-5、IL-10 呈正相關(guān)(r>0,P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 AR 患兒中miR-124-3p、GATA3 表達(dá)與Th1/Th2及細(xì)胞因子相關(guān)性分析

3 討論

AR 患兒的過(guò)敏癥狀易與普通感冒混淆,不能得到及時(shí)、規(guī)范治療,且患兒往往伴有哮喘、結(jié)膜炎等多類(lèi)疾病,給兒童生活造成很大困擾,研究認(rèn)為AR 的發(fā)病機(jī)制與Th1 和Th2 細(xì)胞免疫失衡有關(guān)[11-12]。

miRNA 通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控參與多種疾病的病理過(guò)程[13]。miR-124-3p 是miRNA 的一種,在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中異常表達(dá),成為疾病診斷的標(biāo)志物[14-15]。銀屑病是一種T 細(xì)胞介導(dǎo)皮膚病,研究顯示,miR-124-3p 在尋常型銀屑病患者皮損組織表達(dá)水平降低,與皮損面積和嚴(yán)重程度相關(guān)[16]。Zhang 等[17]研究顯示,miR-124-3p 在A(yíng)R 模型小鼠鼻黏膜組織中下調(diào)表達(dá),上調(diào)miR-124-3p 表達(dá),可緩解AR 癥狀及降低血清炎癥因子水平。GATA3 屬于Ⅳ型鋅指蛋白家族,是Th2 細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子,可以促進(jìn)Th2 相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)與分化,在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[18]。研究顯示,GATA3 在A(yíng)R小鼠肺組織中表達(dá)水平升高,給予玉屏風(fēng)散治療后,GATA3 蛋白的表達(dá)降低,提示GATA3 在參與AR 的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[19]。本研究結(jié)果顯示,miR-124-3p在A(yíng)R 患兒血清表達(dá)水平低于對(duì)照組,GATA3 水平高于對(duì)照組,且與輕度組比較,中重度組患兒血清miR-124-3p 表達(dá)水平顯著降低,GATA3 水平顯著升高,提示miR-124-3p、GATA3 與AR 患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)。

正常生理?xiàng)l件下,Th1 和Th2 細(xì)胞處于相對(duì)平衡,保持機(jī)體免疫平衡,Th1 和Th2 細(xì)胞既互相拮抗又互相調(diào)節(jié),機(jī)體在外界病原菌或過(guò)敏原刺激下,Th1/Th2 比例失衡導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答異常,引發(fā)疾病,Th1 和Th2 的免疫失衡是AR 的主要免疫學(xué)基礎(chǔ)與發(fā)病機(jī)制[20-21]。Th1 細(xì)胞主要分泌腫瘤壞死因子β(tumor necrosis factor,TNF-β)、IFN-γ、IL-2、IL-12 等細(xì)胞因子,介導(dǎo)細(xì)胞免疫,參與遲發(fā)型超敏性炎癥的形成,而Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子,介導(dǎo)體液免疫。研究顯示,AR 患者血清Th1 細(xì)胞亞群比例、Th1/Th2 比例、IL-4、IL-12 水平升高[22]。本研究結(jié)果顯示,AR 組Th1 細(xì)胞比例和Th1/Th2 顯著降低,Th2 細(xì)胞比例顯著升高,提示AR患兒體內(nèi)Th1/Th2 比例失衡,Th2 細(xì)胞可能在A(yíng)R 疾病中占免疫優(yōu)勢(shì)。Th1 和Th2 免疫調(diào)節(jié)主要通過(guò)其細(xì)胞因子發(fā)揮作用,李滿(mǎn)群等[23]研究顯示,過(guò)敏性鼻炎患兒血清TNF-β、IFN-γ、IL-2、IL-12 水平顯著降低,血清IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 水平顯著升高,存在Th1/Th2 免疫失衡。本研究結(jié)果顯示,AR 組血清IFN-γ、IL-12 水平顯著降低,IL-4、IL-5、IL-10 水平顯著升高,與李滿(mǎn)群等[23]研究結(jié)果類(lèi)似,提示AR 患兒體內(nèi)有炎癥反應(yīng),Th1/Th2 免疫失衡。

Th1/Th2 失衡參與AR 發(fā)病的具體機(jī)制尚不清楚。本研究經(jīng)相關(guān)性分析顯示,AR 患兒血清miR-124-3p表達(dá)水平與GATA3 水平呈負(fù)相關(guān),且經(jīng)生物學(xué)軟件在線(xiàn)分析顯示,miR-124-3p 與GATA3 有靶向結(jié)合位點(diǎn),miR-124-3p 可能靶向負(fù)調(diào)控GATA3 表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示,miR-124-3p、GATA3 與Th1/Th2 失衡相關(guān)。研究顯示,富含miR-124-3p 外泌體可增強(qiáng)結(jié)直腸癌荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫反應(yīng),miR-124-3p 的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)Th1 細(xì)胞分化[24]。Th 前體細(xì)胞分化受GATA3 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,GATA3 可促進(jìn)Th2 細(xì)胞的分化,并抑制IFN-γ 的生成[25]。因此,推測(cè)miR-124-3p 可能靶向負(fù)調(diào)控GATA3 表達(dá),影響Th1、Th2 細(xì)胞分化,導(dǎo)致Th1/Th2 失衡,參與AR 病情進(jìn)展。

綜上所述,AR 患兒血清miR-124-3p 表達(dá)水平降低,GATA3 水平升高,二者與患兒疾病嚴(yán)重程度和Th1/Th2 失衡有關(guān)。但miR-124-3p 與GATA3 具體作用機(jī)制需要做進(jìn)一步研究。

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