祖力皮卡爾·吾斯曼 張數(shù)數(shù) 閆 明 李治建 霍仕霞

1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥物研究所，新疆烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830049

白癜風(fēng)是一種常見的黑素細胞缺失導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)色素脫失斑的色素障礙性皮膚病，患病率為0.5%～2.0%，其病因尚未確定[1]。目前臨床上治療白癜風(fēng)的方法有手術(shù)、光療[2]、外用激素[3]、口服免疫抑制劑[4]及抗氧化劑[5]等，雖然有一定的效果，但也有一定的副作用。高良姜素（Galangin，GA）是從高良姜的根部提取的一種天然黃酮（3，5，7-三羥基黃酮），具有抗腫瘤[6]、抗氧化[7]和抗感染[8]活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GA具有促進黑色素合成的作用[9]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[10-11]及分子對接等分析方法，對GA 乳膏抗白癜風(fēng)作用機制進行研究，以期為白癜風(fēng)治療藥物的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 作用靶點的篩選 運用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，獲取其吸收、分布、代謝、排泄和毒性水平，并結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺的中藥動學(xué)參數(shù)篩選標(biāo)準(zhǔn)對GA 靶點進行篩選。

1.1.2 構(gòu)建白癜風(fēng)疾病靶點數(shù)據(jù)庫 利用TTD、OMIM、DrugBank 數(shù)據(jù)庫，以“vitiligo”為關(guān)鍵詞，檢索與白癜風(fēng)相關(guān)的基因，構(gòu)建白癜風(fēng)疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

1.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 用R 語言進行維恩圖映射交集處理藥物和疾病靶點，將藥物和疾病靶點輸入String平臺（https://cn.string-db.org/），通過Cytoscape 3.7.1 尋找核心靶點，構(gòu)建藥物-疾病靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.1.4 基因富集分析 為了闡明GA 治療白癜風(fēng)的作用，將得到的核心靶標(biāo)進行GO 富集分析和KEGG 信號通路富集分析。

1.1.5 分子對接 借助ZINC 數(shù)據(jù)庫（http://zinc.docking.org/）下載GA 的3D 結(jié)構(gòu)，作為對接配體。采用Auto Tools 對核心靶點晶體結(jié)構(gòu)蛋白進行預(yù)處理，作為分子對接的受體。以配體和受體使用Autodock Vina 1.2進行對接，最后取優(yōu)勢構(gòu)象進行分析，對接結(jié)果中Vina 分值≤-4.5，說明關(guān)鍵靶點與化合物的結(jié)合能力較好[12]。

1.2 動物實驗材料

1.2.1 實驗動物 選取60 只4 周齡SPF 級雄性C57 BL/6 小鼠，體重（21±3）g，購自湖南精達實驗動物有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（湘）2019-0004。本實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（IACUC-20211118-03），動物接收后飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)內(nèi)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，每籠5 只，自由進食、進水。

1.2.2 主要試劑與儀器1%GA 乳膏（20190910），規(guī)格為20 g/支，淡黃色膏體，由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥物研究所提供。1%8-甲氧補骨脂素（8-methoxypsoralen，8-MOP）（重慶華邦制藥股份有限公司，M861678）；10%H2O2溶液（河南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心，MY15480）。酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司，包括內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）（210620），白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）（210715），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（210723）。BCA 蛋白定量試劑盒（WB0028）、TBST（WB0043）均購自天德瑞生物科技有限公司。Trizol（美國Thermo，15596026）；ET-1 一抗（美國Abcam，ab2786）；TNF-α一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-2081）；二抗HPR goat anti-mouse IgG（美國Sigma，SA00001-1）；mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)有限公司，CW 2569）。引物均由上海生工公司合成。ET-1 引物序列：正向引物為5’-GAAGTTGACGCACAACCGAG-3’，反向引物為5’-CTCTGCCCGTCTGAACAAGA-3’；IL-18引物序列：正向引物為5’-TCAGCTGGGAAAACTCAGGA-3’，反向引物為5’-AGCTAATGTGACGCACTGGG-3’；TNF-α 引物序列：正向引物為5’-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3’，反向引物為5’-CACCCCGAAGTTCAGTAGACA-3’。實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo，PIKOREAL96）；臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，L-420）。

1.2.3 藥物的制備 制備低（1%）、中（2%）、高（4%）劑量GA 乳膏，在原有乳膏的基礎(chǔ)上提高GA 含量，稱取各輔料，將所需的油相及水相分別放入不同的燒杯，在85℃的水浴中融化并均勻化。將油相慢慢倒入水相中，以600 r/min 的速度攪拌5 min，冷卻至室溫，濃縮后得到不同劑量的GA 乳膏。

1.3 動物實驗方法

1.3.1 動物分組及干預(yù) 選取10 只小鼠設(shè)為正常對照組，其余50 只將背部2 cm×2 cm 區(qū)域剃毛，剃毛1次/3 d。剃毛區(qū)域均勻涂抹10%H2O2構(gòu)建白癜風(fēng)動物模型[13]，以造模區(qū)域毛發(fā)顏色變化及皮膚白斑情況確認造模成功[14]。造模成功后按隨機數(shù)字表法將其分為模型組、陽性藥組及GA 乳膏低、中、高劑量組，每組10 只。GA 乳膏各劑量組在造模區(qū)進行涂抹給藥，1 g/次，1 次/d；陽性藥組灌胃8-MOP4.25 mg/kg，2 次/d，間隔時間為6 h，連續(xù)給藥30 d。模型組及正常對照組不進行干預(yù)。

1.3.2 血液和皮膚樣本的制備 實驗結(jié)束后，采集血樣，靜置1 h 后在4℃的條件下分離血清，用手術(shù)刀在小鼠造模區(qū)域皮膚進行1.5 cm×1.5 cm 的切取，將皮膚組織樣本部分放在4%多聚甲醛中，部分儲存在-80℃冰箱中。

1.3.3 組織病理學(xué)檢查 取小鼠造模部位的皮膚，用石蠟塊包裹，并切成3～5 μm 的切片，用蘇木精-伊紅染色。

1.3.4 血清ET-1、TNF-α 及IL-18 檢測 用酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測血清中的ET-1、TNF-α 及IL-18。

1.3.5 Western blot 分析 使用BCA 蛋白測定試劑盒測定皮膚組織中的蛋白濃度，將組織樣品（50 μg）煮沸5 min，裝入10%的聚丙烯酰胺凝膠，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用三緩沖鹽水加TBST 緩沖液和3%的牛血清白蛋白在室溫下將膜封鎖1 h。將膜與一抗（稀釋度1∶500）在4℃下孵育過夜，用TBST（3～5 次）沖洗5 min，然后與二抗（稀釋度1∶1 000）在室溫下孵育1 h，用TBST（3～5 次）沖洗5 min。采用增強型化學(xué)發(fā)光法檢測印跡，使用圖像分析軟件對照β-actin 蛋白確定蛋白條帶的密度。

1.3.6 RT-qPCR 分析 依試劑盒說明書制備PCR 體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，Primer A（10 μmol/L）1 μl，Primer B（10 μmol/L）1 μl，ddH2O 11 μl，2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 μl，共30 μl。將制備完成的PCR 反應(yīng)管放入實時熒光定量PCR 儀內(nèi)，在95℃預(yù)變性15 s，然后以95℃15 s，60℃30 s，70℃15 s 循環(huán)40 次進行PCR 反應(yīng)，以2-ΔΔCt法計算mRNA 表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗；多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GA 作用靶點篩選

SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫分別輸入GA 的mol2結(jié)構(gòu)式獲取蛋白作用靶點，經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot校驗后根據(jù)z’score＞0 得到最終符合條件的17 個基因靶點：NOS2、ET1、ARNT、PTGS2、DPP6、TNF、BCL2、CDk4、CDk1、CYP1A1、IL18、GSTP1、ARNT、NLRP3、IL1β、Casp1、TYR。

2.2 白癜風(fēng)候選靶點

以“vitiligo”為關(guān)鍵詞，應(yīng)用數(shù)據(jù)庫查相關(guān)疾病靶點。經(jīng)整理合并后共得到459 個靶點，映射交集處理結(jié)果顯示，獲得GA-白癜風(fēng)交集靶基因有10 個。見圖1。

圖1 GA-白癜風(fēng)交集靶基因維恩圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

GA 治療白癜風(fēng)靶點及其功能的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖共有10 個節(jié)點，25 條邊，平均節(jié)點自由度為5，酪氨酸酶、NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶、TNF、IL-1β、IL-18 等為核心靶點。見圖2。

圖2 GA 治療白癜風(fēng)靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路分析

藥物疾病交集核心靶點進行GO 富集分析及KEGG 通路富集分析，前10 的途徑見圖3，對富集得到的通路結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，GA 中有效成分可能通過核因子κB、NOD 樣受體及HIF-1 通路等發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用。

圖3 GA 治療白癜風(fēng)核心靶點GO 富集分析

圖4 GA 治療白癜風(fēng)核心靶點KEGG 通路富集分析

2.5 GA 抗白癜風(fēng)關(guān)鍵靶點分子對接

將篩的3 個關(guān)鍵靶點的空間結(jié)構(gòu)與GA 的分子結(jié)構(gòu)進行分子對接，結(jié)果顯示，GA 與ET-1、TNF-α 和IL-18的對接結(jié)合能分別為-4.6、-8.2 和-7.2 kcal/mol。見圖5。

圖5 GA 與作用于白癜風(fēng)關(guān)鍵靶點的分子對接

2.6 六組皮膚組織染色

正常對照組皮膚無明顯異常。模型組皮膚與正常對照組比較，表皮棘層皺襞變厚，毛囊破損及角質(zhì)層明顯增生。GA 乳膏各劑量組表皮雖有輕微棘層皺襞，與模型組比較明顯改善。見圖6。

圖6 六組皮膚組織蘇木精-伊紅染色（100×）

2.7 六組血清ET-1、TNF-α 及IL-18 水平比較

模型組血清ET-1、IL-18、TNF-α 水平高于正常對照組，GA 乳膏低、中、高劑量組血清ET-1、IL-18、TNF-α 水平低于模型組（P＜0.05）。見圖7。

圖7 六組血清ET-1、TNF-α 及IL-18 水平比較（n=10）

2.8 六組皮膚組織中ET-1 和TNF-α 蛋白表達比較

模型組皮膚組織中ET-1、TNF-α 蛋白表達高于正常對照組（P＜0.05）。GA 乳膏高劑量組皮膚組織ET-1蛋白表達低于模型組，GA 乳膏中、高劑量組皮膚組織TNF-α 蛋白表達低于模型組（P＜0.05）。GA 乳膏中、高劑量組皮膚組織TNF-α 蛋白表達低于GA乳膏低劑量組，GA 乳膏高劑量組皮膚組織ET-1 蛋白表達低于GA 乳膏低劑量組（P＜0.05）。見圖8。

圖8 六組皮膚組織中ET-1 和TNF-α 蛋白表達比較（n=10）

2.9 六組皮膚組織中ET-1、TNF-α 及IL-18 mRNA表達比較

模型組皮膚組織中ET-1、IL-18、TNF-α mRNA表達高于正常對照組，GA 乳膏低、中、高劑量組皮膚組織ET-1、TNF-α mRNA 表達低于模型組，GA 乳膏中、高劑量組皮膚組織IL-18 mRNA 表達低于模型組和GA 乳膏低劑量組（P＜0.05）。見圖9。

圖9 六組皮膚組織中ET-1、TNF-α 及IL-18 mRNA 表達比較（n=10）

3 討論

白癜風(fēng)是一種自身免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，全身任何部位的皮膚均可發(fā)生，但好發(fā)于易受摩擦、陽光暴曬的暴露部位及褶皺部位[15-16]。白癜風(fēng)發(fā)病的關(guān)鍵是黑素細胞合成黑素功能的減退和缺失[17]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討了GA 及其作用靶點的相關(guān)性，GA 中存在1 個活性成分與多個核心靶標(biāo)作用的現(xiàn)象，體現(xiàn)了中藥多成分與多靶標(biāo)之間共同作用的機制，得出ET-1、TNF-α 及IL-18 是GA 治療白癜風(fēng)的關(guān)鍵靶點。

黑素細胞旁分泌網(wǎng)絡(luò)與黑素細胞功能減退密切相關(guān)[18]，黑素細胞旁分泌網(wǎng)絡(luò)是一個復(fù)雜的系統(tǒng)[19]，對其功能具有重要調(diào)節(jié)作用[20]。ET-1 已被證實在白癜風(fēng)的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色[21]。本研究結(jié)果顯示，GA 乳膏治療可顯著降低白癜風(fēng)模型動物血清和皮膚組織中ET-1 的表達水平。

TNF-α 是一種由活化的單核巨噬細胞釋放的炎癥因子，可對黑素細胞產(chǎn)生細胞毒性作用，進而抑制黑素細胞色素生成[22]。白癜風(fēng)患者TNF-α 水平高于正常人，TNF-α 高表達可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞凋亡，誘發(fā)白癜風(fēng)[23]。本研究結(jié)果顯示，GA 乳膏治療可顯著降低白癜風(fēng)模型動物血清和皮膚組織中TNF-α 蛋白及其mRNA的表達水平，發(fā)揮顯著的抗黑素細胞凋亡的作用。

IL-18 水平的升高可促進和誘導(dǎo)γ 干擾素及CD8+T 細胞活性而參與白癜風(fēng)的炎癥反應(yīng)及發(fā)病過程[24]。ET-1 通過p38 MAPK 通路依賴性機制誘導(dǎo)IL-18 的表達[25]。本研究結(jié)果提示，GA 乳膏可顯著降低白癜風(fēng)模型動物血清IL-18 水平及其mRNA 在皮膚組織中的表達水平。

綜上，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，初步闡釋了GA 治療白癜風(fēng)的作用機制。實驗研究結(jié)果顯示，GA 乳膏很可能通過增加黑素細胞旁分泌網(wǎng)絡(luò)ET-1 及炎癥因子TNF-α、IL-18 表達發(fā)揮作用，為后續(xù)研究白癜風(fēng)的作用機制提供了研究基礎(chǔ)。