葛丹丹，吳兵黨,2，楊晶晶,2，許曉毅,2，吳瑋,2，黃天寅,2*

1.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院

2.蘇州市海綿城市技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

微生物燃料電池（microbial fuel cell，MFC）通過(guò)微生物活動(dòng)消耗有機(jī)質(zhì)并將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能[1]。MFC 與污水處理相結(jié)合可以同步實(shí)現(xiàn)廢水處理和電能回收，這使得MFC 成為一種有前途的廢水處理技術(shù)，而受到廣泛關(guān)注[2-3]。近年來(lái)，許多研究者嘗試采用MFC 處理含硝酸鹽廢水，取得了較好的污染物去除及產(chǎn)電效果[4-5]。然而，MFC 陽(yáng)極反硝化對(duì)碳氮比（C/N）依賴性強(qiáng)，高C/N 條件下有利于硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮廢水降解[6]。因此，增加低C/N 陽(yáng)極反硝化脫氮產(chǎn)電的能力顯得尤為重要。

為了增強(qiáng)MFC 處理低C/N 廢水的效能，研究人員已通過(guò)電刺激或添加硫化物、鐵、氫等無(wú)機(jī)化合物引入自養(yǎng)反硝化的方式，降低了對(duì)碳源的依賴性[7-9]。Tong 等[10]發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)-自養(yǎng)反硝化能引起異養(yǎng)菌與自養(yǎng)菌之間的協(xié)同作用，提高反硝化效率和處理能力，降低電能消耗和有機(jī)碳源消耗。Liu 等[11]研究表明，在較低的外加電流下，微生物和電流之間的協(xié)同作用增強(qiáng)，反硝化作用得到改善。Ai 等[12]開(kāi)發(fā)了以醋酸鹽和硫化物（Na2S）作為電子供體的陽(yáng)極混合營(yíng)養(yǎng)型反硝化微生物燃料電池，結(jié)果表明，在不同碳氮硫比條件下硝酸鹽去除率達(dá)到91.37%~98.75%，硫化物被證明既是反硝化又是發(fā)電的有效電子供體。但現(xiàn)有研究鮮有將生物脫氮與電化學(xué)相結(jié)合以提高體系在低C/N 下脫氮性能的報(bào)道，且報(bào)道中所添加的硫化物（H2S、HS-、S2-等）多為常見(jiàn)的水體污染物，對(duì)環(huán)境和人類會(huì)產(chǎn)生一定危害。FeS2是固態(tài)硫源，來(lái)源廣泛，較其他硫源硫酸鹽釋放量更低，理論上以FeS2為電子供體的自養(yǎng)反硝化每去除1 g NO3-生成4.57 g SO42-，而以單質(zhì)硫和硫化物為電子供體的自養(yǎng)反硝化生成的SO42-含量分別是FeS2的1.65 倍和1.21 倍。此外，F(xiàn)eS2可以刺激反硝化微生物和產(chǎn)電微生物的生長(zhǎng)，有望強(qiáng)化MFC 實(shí)現(xiàn)低C/N脫氮。研究表明，F(xiàn)eS2在生物反應(yīng)器中是一種很有前途的基質(zhì)，可以在缺乏足夠的可生物降解有機(jī)碳的情況下提高廢水中硝酸鹽的去除率[13-14]。此外，F(xiàn)eS2有利于提高胞外電子轉(zhuǎn)移能力，也有利于電化學(xué)活性細(xì)菌的富集與生長(zhǎng)[15]。然而，F(xiàn)eS2在微生物燃料電池中強(qiáng)化脫氮產(chǎn)電的應(yīng)用和機(jī)理分析的相關(guān)研究較少，因此亟須探究FeS2對(duì)MFC 脫氮產(chǎn)電的可行性與作用，尤其是對(duì)低C/N 下MFC 運(yùn)行的影響。

筆者將FeS2引入陽(yáng)極反硝化微生物燃料電池中，構(gòu)建FeS2-微生物燃料電池脫氮體系（pyritesmicrobial fuel cell，Pyr-MFC）。研究FeS2的加入對(duì)陽(yáng)極反硝化MFC 脫氮產(chǎn)電的作用以及探究減少有機(jī)碳源的投加對(duì)Pyr-MFC 體系穩(wěn)定運(yùn)行的影響，并通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析Pyr-MFC 陽(yáng)極微生物群落運(yùn)行前后特征變化，通過(guò)各項(xiàng)表征和鐵硫元素貢獻(xiàn)解析等分析FeS2強(qiáng)化體系低C/N 下的脫氮機(jī)理，以期為低C/N 下MFC 反硝化脫氮提供可能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置與材料

試驗(yàn)采用H 型雙室微生物燃料電池（圖1）。陽(yáng)極室和陰極室均采用有機(jī)玻璃制成，尺寸為5 cm×5 cm×8 cm，有效容積為200 mL。兩極室均為獨(dú)立裝置，中間用陽(yáng)離子交換膜隔開(kāi)（4 cm×4 cm，CMI-7000，Membranes International Inc，美國(guó)）。陽(yáng)極和陰極電極使用鈦絲導(dǎo)線相連，外電路負(fù)載1 000 Ω 電阻，同時(shí)連通數(shù)據(jù)采集器。數(shù)據(jù)采集器每5 min 收集1 次實(shí)時(shí)電壓，每個(gè)數(shù)據(jù)取6 次測(cè)量平均值，反應(yīng)器放置于磁力攪拌器上并置于（30±1）℃的生化培養(yǎng)箱中。

陽(yáng)離子交換膜在使用前先用去離子水浸泡24 h進(jìn)行預(yù)處理。陽(yáng)極和陰極電極均采用碳纖維刷（直徑3 cm×長(zhǎng)度3 cm）。在組裝MFC 前，對(duì)碳纖維刷進(jìn)行預(yù)處理：在丙酮中浸泡12 h，取出后放在無(wú)水乙醇中超聲沖洗3~5 次；接著分別用1 mol/L 的HCl和1 mol/L 的NaOH 浸泡4 h；然后用蒸餾水超聲沖洗至中性，置于烘箱中于80 ℃烘干；最后，用砂紙打磨去除鈦絲表面的金屬氧化層。

陽(yáng)極室投加的材料為酸洗的天然FeS2粉末，其預(yù)處理方式如下：天然FeS2粉碎過(guò)200 目篩后，用無(wú)水乙醇超聲5 min，除去粉末中的細(xì)顆粒和表面雜質(zhì)；然后用1 mol/L HNO3洗滌5 min 約2~3 次，接著用蒸餾水和乙醇沖洗至中性；最后于25 ℃真空干燥箱干燥，并保存在干燥箱中。通過(guò)濃硝酸消解方式測(cè)得0.1 g 材料可釋放SO42-約0.2 kg/L。在衍射角（2θ）為20°~80°的范圍內(nèi)測(cè)定材料的X 射線衍射（XRD）掃描光譜（圖2），根據(jù)Jade 軟件匹配得到該材料對(duì)應(yīng)的衍射峰與黃鐵礦相FeS2的標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF#42-1340）基本一致。證明材料的主要成分為FeS2，晶體結(jié)構(gòu)相似度較高。

圖2 FeS2 材料XRD 圖Fig.2 XRD diagram of FeS2 material

1.2 接種污泥與MFC 的啟動(dòng)

MFC 的接種污泥采用蘇州某市政污水廠缺氧段反硝化污泥，接種量為40 mL。MFC 采用序批式培養(yǎng)方式運(yùn)行，所有條件下均平行運(yùn)行2 組MFC 反應(yīng)器。MFC 陽(yáng)極微生物起初以C/N 為15 培養(yǎng)，便于脫氮產(chǎn)電菌快速培養(yǎng)啟動(dòng)，接著以C/N 為5 穩(wěn)定培養(yǎng)，然后不斷降低C/N（分別為4、3、2、1）探究其對(duì)MFC 運(yùn)行性能的影響。每次試驗(yàn)前，陽(yáng)極液需氮吹30 min 去除水中溶解氧，待運(yùn)行后出水COD 或硝態(tài)氮測(cè)量值各自相差小于5%時(shí)（認(rèn)為是1 個(gè)周期）更換陽(yáng)極液和陰極液。當(dāng)MFC 的輸出電壓與脫氮效果在3 個(gè)周期內(nèi)穩(wěn)定時(shí)，即認(rèn)為啟動(dòng)成功。

試驗(yàn)設(shè)置不加FeS2的空白對(duì)照組（C-MFC）和加入FeS2的試驗(yàn)組（Pyr-MFC）。陽(yáng)極液為0.641 g/L的NaAc（即0.5 g/L COD）、0.607 1 g/L NaNO3（即0.1 g/L NO3--N）、0.02 g/L KH2PO4以及10 mL/L 微量元素濃縮液（表1），初始pH 為7.0 左右。在Pyr-MFC 的陽(yáng)極室投加7 g FeS2粉末。陰極液采用鐵氰化鉀作為電子受體（10 g/L K3[Fe(CN)6]），其pH 用25 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液維持在7.0左右。

表1 微量元素溶液組成Table 1 Composition of trace element solution

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）加入FeS2對(duì)MFC 陽(yáng)極反硝化脫氮與產(chǎn)電的影響

將FeS2加入到NO3--N 廢水中混合，檢測(cè)5 d 內(nèi)NO3--N 濃度的變化，探究FeS2在Pyr-MFC 中是否存在化學(xué)脫氮效果。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)比不加FeS2的空白對(duì)照組（C-MFC）和加7 g FeS2的試驗(yàn)組（Pyr-MFC），探究FeS2的加入對(duì)MFC 陽(yáng)極反硝化脫氮與產(chǎn)電的影響，該試驗(yàn)在C/N 為5 下進(jìn)行，120 h為1 個(gè)運(yùn)行周期。

（2）不同C/N 對(duì)Pyr-MFC 陽(yáng)極反硝化脫氮與產(chǎn)電的影響

建立4 組不同C/N 的Pyr-MFC 反應(yīng)器，C/N分別為4、3、2、1，F(xiàn)eS2投加量均為7 g，72 h 為1 個(gè)運(yùn)行周期，進(jìn)水NO3--N 濃度為100 mg/L，初始pH 約為7.0，探究不同C/N 對(duì)MFC 陽(yáng)極反硝化脫氮與產(chǎn)電的影響。

（3）運(yùn)行結(jié)束后陽(yáng)極表面形態(tài)及微生物群落變化

在反應(yīng)器運(yùn)行結(jié)束后，取C/N 為3 時(shí)的MFC 陽(yáng)極室內(nèi)使用前后的碳刷電極，采用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)C-MFC、Pyr-MFC 反應(yīng)器掛膜前后（空白碳刷和反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行后的碳刷生物膜）的表面形態(tài)進(jìn)行成像，觀察碳刷表面微生物生長(zhǎng)變化和FeS2附著效果。采用高通量基因測(cè)序技術(shù)，以接種污泥和C-MFC、Pyr-MFC 反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行后的陽(yáng)極碳刷表面微生物作為樣品，對(duì)MFC 陽(yáng)極室微生物群落變化進(jìn)行分析。

（4）MFC 中物質(zhì)轉(zhuǎn)移試驗(yàn)

取試驗(yàn)前后硫鐵礦進(jìn)行XPS 表征，探究MFC中的硫鐵礦元素變化。在4 組MFC 反應(yīng)器中分別加入FeCl2、FeCl3、Na2S、NaS2O3，對(duì)比各反應(yīng)器對(duì)NO3--N 的去除效果，在試驗(yàn)結(jié)束后取4 組反應(yīng)器內(nèi)污泥樣品進(jìn)行高通量基因測(cè)序，探究不同價(jià)態(tài)鐵或硫在MFC 中的脫氮性能。

1.4 分析檢測(cè)方法

1.4.1 水質(zhì)分析方法

水質(zhì)指標(biāo)依據(jù)《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》4 版[16]中的方法進(jìn)行檢測(cè)。其中pH 采用pH 計(jì)（WTW 7110）測(cè)定；COD 采用重鉻酸鉀法測(cè)定；TN 濃度采用過(guò)硫酸鉀分光光度法測(cè)定；NH4+-N 濃度采用納氏試劑分光光度法測(cè)定；NO3--N、NO2--N、SO42-濃度采用離子色譜法（ICS-900，Thermo，美國(guó)）測(cè)定；Fe2+和總鐵濃度采用鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定。

COD、氮等的去除率通過(guò)反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)濃度與初始狀態(tài)下濃度之比計(jì)算得到，數(shù)據(jù)顯著性分析通過(guò)SPSS 20.0 軟件進(jìn)行，采用獨(dú)立樣本進(jìn)行t檢驗(yàn)。

1.4.2 物理表征方法

采用XRD 儀對(duì)FeS2材料的晶型進(jìn)行表征分析；采用X 射線光電子能譜（XPS）對(duì)反應(yīng)前后的FeS2進(jìn)行Fe、S 元素精細(xì)譜分析。

1.4.3 電化學(xué)分析方法[17]

通過(guò)輸出電壓（U）、體積功率密度（W）、陰（陽(yáng)）極電極電位（E）等電化學(xué)指標(biāo)分析MFC 產(chǎn)電性能；采用循環(huán)伏安（CV）法測(cè)定陽(yáng)極微生物電化學(xué)活性；采用電化學(xué)阻抗測(cè)試法（EIS）對(duì)MFC 陽(yáng)極的阻抗行為和內(nèi)阻大小進(jìn)行分析。

U由安捷倫34972A 數(shù)據(jù)采集器每5 min 采集1 次，每個(gè)數(shù)據(jù)取6 次測(cè)量的平均值，以運(yùn)行時(shí)間和U分別為橫、縱坐標(biāo)作MFC 電壓曲線圖。

電極電勢(shì)趨勢(shì)可以用來(lái)觀察MFC 陰（陽(yáng)）極的性能，將參比電極（飽和甘汞電極）與陰（陽(yáng)）極用萬(wàn)用表連接則可得陰（陽(yáng)）極電極電位。根據(jù)吉布斯函數(shù)和能斯特方程可知，當(dāng)任意2 個(gè)電極組成電池時(shí)，該電池電動(dòng)勢(shì)等于其陰極電勢(shì)與陽(yáng)極電勢(shì)之差。

體積功率密度是單位時(shí)間、單位體積MFC 所輸出的能量，反映了MFC 的產(chǎn)電能力。計(jì)算公式如下：

式中：U為MFC 輸出電壓，V；R為外電路電阻，Ω；V為陽(yáng)極室有效容積，m3。

利用華辰 CHI660 電化學(xué)工作站比較C-MFC和Pyr-MFC 陽(yáng)極室微生物的氧化還原活性，繪制CV（電流-電壓）曲線。采用三電極測(cè)量體系：陽(yáng)極碳刷為工作電極，陰極碳刷為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解液為MFC 陽(yáng)極液，對(duì)電壓最高時(shí)MFC 陽(yáng)極室微生物進(jìn)行CV 掃描。電勢(shì)掃描范圍為-0.85~0.80 V，掃描速度為10 mV/s。

采用華辰CHI660 電化學(xué)工作站進(jìn)行EIS 的測(cè)定，比較C-MFC 和Pyr-MFC 陽(yáng)極的阻抗行為和內(nèi)阻大小，以阻抗實(shí)部Z′為橫坐標(biāo)、虛部-Z′′為縱坐標(biāo)，繪制Nyquist 曲線。測(cè)試在MFC 運(yùn)行狀態(tài)下進(jìn)行，測(cè)試前先將MFC 開(kāi)路處理（外電路斷開(kāi)約10 min），待開(kāi)路電壓穩(wěn)定后，將MFC 接入電化學(xué)工作站，采用三電極測(cè)量體系：陽(yáng)極為工作電極，陰極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極，進(jìn)行電壓最高時(shí)體系的EIS 測(cè)試。頻率掃描范圍為10-2~103Hz，正弦擾動(dòng)幅度為10 mV。

1.4.4 微生物分析方法

電極微生物在掃描前需要經(jīng)過(guò)固定、脫水、干燥、噴金等預(yù)處理，具體步驟如下：首先采用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗微生物樣品3 次；再加入2.5%戊二醛固定12 h；然后用PBS 清洗3 次，每次浸泡10 min；接著用30%、50%、70%、80%、90%、100%梯度濃度的乙醇依次脫水，每次5~7 min；最后自然干燥后經(jīng)噴金用掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于FeS2 構(gòu)建的Pyr-MFC 脫氮產(chǎn)電性能

2.1.1 脫氮效果

在化學(xué)脫氮試驗(yàn)中，Pyr-MFC 中的NO3--N 濃度基本保持不變，NO3--N 和FeS2沒(méi)有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，這與已有研究結(jié)論[18-19]相符。C-MFC 和Pyr-MFC生物脫氮效果變化如圖3 所示。由圖3（a）可知，在前8 h，Pyr-MFC 和C-MFC 中的NO3--N 濃度均不斷下降，Pyr-MFC 的NO3--N 降解速率為15.54 mg/(L·h)，高于C-MFC〔12.02 mg/(L·h)〕，Pyr-MFC 和C-MFC 中的NO3--N 分別在第8 和12 小時(shí)被完全降解。與NO3--N 降解規(guī)律類似，Pyr-MFC 的COD 去除速率〔62.5 mg/(L·h)〕同樣高于C-MFC〔42.12 mg/(L·h)〕，隨著NO3--N 的完全降解，C-MFC 和Pyr-MFC 的COD降解速率迅速降至1.21 和1.24 mg/(L·h)，降解速率更加平穩(wěn)。

圖3 不同MFC 脫氮效果對(duì)比Fig.3 Comparison of nitrogen removal effect of different MFCs

由圖3（b）可知，C-MFC 和Pyr-MFC 中的NO2--N濃度最高分別達(dá)到3.58 和5.02 mg/L，在2 組MFC反應(yīng)器中均未出現(xiàn)明顯的累積。由圖3（c）可知，2 組MFC 反應(yīng)器內(nèi)的pH 均呈先上升后下降的趨勢(shì)，C-MFC 和Pyr-MFC 的平均pH 分別為8.06 和7.71，Pyr-MFC 中 的pH 較C-MFC 偏 低，可 能 是FeS2自養(yǎng)反硝化產(chǎn)生的酸度部分中和了異養(yǎng)反硝化產(chǎn)生的堿度[20]。C-MFC 中的硫酸鹽濃度基本保持不變，而Pyr-MFC 中的硫酸鹽濃度以1.28 mg/(L·h)的速率不斷上升，在第8 小時(shí)NO3--N 完全降解后，硫酸鹽的產(chǎn)生速率繼續(xù)保持在0.83 mg/(L·h)，在1 個(gè)周期（120 h）結(jié)束時(shí)，硫酸鹽濃度最終達(dá)到107.38 mg/L。

2.1.2 產(chǎn)電效果

C-MFC 和Pyr-MFC 產(chǎn)電效果對(duì)比如圖4 所示。由圖4（a）可知，C-MFC 與Pyr-MFC 的初始電壓分別為0.261 和0.630 V。C-MFC 反應(yīng)器的電壓在0~8 h 從0.261 V 左右逐漸降低，在8 h 降低到谷值0.202 V；8~12 h 電壓重新升高，至12 h 達(dá)到峰值0.511 V；12~120 h 電 壓 緩 慢 下 降 并 穩(wěn) 定 在0.100 V 左右。在整個(gè)產(chǎn)電周期內(nèi)，C-MFC 的最大電壓達(dá)到0.511 V，相應(yīng)的最大功率密度為1.30 W/m3。Pyr-MFC 反應(yīng)器的電壓在0~4.5 h 從0.630 V 左右逐漸降低，至4.5 h 降低到谷值0.536 V；4.5~10 h 電壓重新升高，至10 h 達(dá)到峰值0.780 V；10~120 h 電壓下降緩慢且相對(duì)穩(wěn)定。在整個(gè)產(chǎn)電周期內(nèi)，Pyr-MFC 的最大電壓達(dá)到0.780 V，相應(yīng)的最大功率密度為3.04 W/m3。說(shuō)明FeS2的加入增強(qiáng)了Pyr-MFC 的產(chǎn)電性能。Ju 等[21]在單室MFC 中使用FeS2顆粒也提高了生物電輸出，解釋其原因在于硫和鐵價(jià)態(tài)的轉(zhuǎn)變?yōu)轶w系提供了電子，比如S2-變成SO42-、Fe2+和Fe3+相互轉(zhuǎn)化。

MFC 電壓大小取決于陰極電勢(shì)與陽(yáng)極電勢(shì)的相對(duì)差值。如圖4（b）所示，在產(chǎn)電周期內(nèi)陰極電勢(shì)基本穩(wěn)定在0.300 V 左右，而陽(yáng)極電勢(shì)波動(dòng)較大，表明MFC 的輸出電能主要由陽(yáng)極電勢(shì)調(diào)控，陽(yáng)極反應(yīng)是產(chǎn)電的決定因素。采用CV 和EIS 對(duì)電壓峰值時(shí)刻MFC 電化學(xué)性能進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4（c）~圖4（d）。Pyr-MFC 具有一對(duì)氧化還原峰，-0.016 V 出氧化峰對(duì)應(yīng)電流-0.012 9 A，-0.369 V 出還原峰對(duì)應(yīng)電流0.017 5 A。C-MFC 基本沒(méi)有氧化還原峰。Pyr-MFC的閉合曲線面積（即電化學(xué)活性面積）大于C-MFC，說(shuō)明Pyr-MFC 電化學(xué)催化活性更高，更有利于電子轉(zhuǎn)移。通過(guò)EIS 測(cè)試發(fā)現(xiàn)，投加FeS2后溶液的內(nèi)阻（Rs）和材料氧化還原反應(yīng)電荷轉(zhuǎn)移內(nèi)阻（Rct）降低，說(shuō)明Pyr-MFC 細(xì)菌之間電子轉(zhuǎn)移速度更快，具有更好的導(dǎo)電性能。

2.2 C/N 對(duì)Pyr-MFC 運(yùn)行性能的影響

反硝化過(guò)程中C/N 過(guò)高容易導(dǎo)致反應(yīng)器出水COD 升高，而Pyr-MFC 可以在減少碳源的條件下進(jìn)行自養(yǎng)反硝化反應(yīng)，既能節(jié)省碳源的消耗，又能提高反硝化脫氮效果。由圖5（a）可知，當(dāng)C/N 為4、3 時(shí)，Pyr-MFC 的NO3--N 去除效果較好，去除率分別達(dá)到100%和97.8%；但是C/N 為2、1 時(shí)，Pyr-MFC 的NO3--N 去除率明顯降低，分別為58.4%和49.7%，說(shuō)明有機(jī)碳的存在有利于反硝化過(guò)程進(jìn)行，但碳源不足會(huì)導(dǎo)致反硝化反應(yīng)無(wú)法徹底進(jìn)行。在不同C/N 條件下，Pyr-MFC 中的NO3--N 去除率均高于沒(méi)有投加FeS2的C-MFC 反應(yīng)器，表明FeS2的加入對(duì)MFC 反硝化脫氮有促進(jìn)作用，同時(shí)也說(shuō)明在缺乏足夠碳源的情況下，F(xiàn)eS2的投加可以提高脫氮性能。以C/N=3 為 例，將72 h 的NO3--N 去 除 率 數(shù) 據(jù) 通 過(guò)SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果表明，Pyr-MFC 的NO3--N 去 除 率 顯 著 高 于C-MFC（P<0.05）。研究表明，F(xiàn)eS2可以刺激異養(yǎng)反硝化細(xì)菌，同時(shí)能夠進(jìn)行FeS2驅(qū)動(dòng)的自養(yǎng)反硝化，彌補(bǔ)碳源減少帶來(lái)的不利影響[22]。由圖5（b）可知，無(wú)論碳源是否充足，反硝化過(guò)程中的亞硝態(tài)氮變化趨勢(shì)基本相同，即反硝化過(guò)程中均會(huì)出現(xiàn)亞硝態(tài)氮積累且隨后逐漸消失的現(xiàn)象，在C/N 為3 時(shí)，亞硝酸鹽的累積量較多，濃度最高達(dá)到11.29 mg/L，原因可能是硝酸鹽還原速率相對(duì)較高，且電子供體相對(duì)較少，導(dǎo)致亞硝酸鹽產(chǎn)生了積累。由圖5（c）可知，當(dāng)C/N 從4 減至1 時(shí)，即進(jìn)水COD 呈梯度降低時(shí)，出水COD 均能維持在較低水平。由圖5（d）可知，不同C/N 下，各Pyr-MFC 的硫酸鹽濃度均不斷增加，而各C-MFC 的硫酸鹽濃度與初始相比基本沒(méi)有變化。當(dāng)C/N 為2、1 時(shí)，Pyr-MFC 中產(chǎn)生的硫酸鹽濃度較高，分別達(dá)到98.51 和108.26 mg/L。硫酸鹽濃度升高可能與硫的自養(yǎng)反硝化有關(guān)，當(dāng)碳源不足時(shí)，微生物以硫及硫的化合物作為電子供體還原硝酸鹽并產(chǎn)生硫酸鹽，從而導(dǎo)致低C/N 時(shí)硫酸鹽釋放量增加[23]。

由圖6 可知，C/N 對(duì)MFC 的產(chǎn)電能力影響較大。隨著C/N 的降低，Pyr-MFC 的產(chǎn)電能力均大于C-MFC，但整體電壓卻大幅度降低。這說(shuō)明FeS2可以提高M(jìn)FC 產(chǎn)電性能；同時(shí)，碳源對(duì)MFC 電壓的影響較大，在低C/N 情況下COD 越高，產(chǎn)電性能越好。由圖6 可知，MFC 產(chǎn)電首先受到陽(yáng)極反硝化脫氮影響呈下降趨勢(shì)，到脫氮尾聲電壓迅速升高進(jìn)行發(fā)電作用，隨著碳源的消耗電壓再逐漸降低，完成1 個(gè)周期脫氮產(chǎn)電。電子供體不足時(shí)，優(yōu)先陽(yáng)極反硝化脫氮，碳源較低不足以在產(chǎn)電階段再次升高電壓發(fā)電。

圖6 C/N 對(duì)不同MFC 產(chǎn)電效果影響Fig.6 Effect of C/N ratio on the electricity production effect of different MFCs

2.3 Pyr-MFC 脫氮產(chǎn)電機(jī)理

2.3.1 生物膜形貌表征

圖7 分別顯示使用前、運(yùn)行60 d 后C-MFC 和Pyr-MFC 陽(yáng)極室電極表面的SEM，放大倍數(shù)均為10 000 倍。Pyr-MFC 生物膜表面分布著大量的縫隙，使其便于與廢水充分接觸，提高微生物的反應(yīng)效率。且Pyr-MFC 生物膜中微生物群體以菌膠團(tuán)形式存在，菌膠團(tuán)表面有很多細(xì)菌分泌的黏性物質(zhì)，使菌膠團(tuán)之間連接更加緊密，也提升了抗沖擊能力。

圖7 陽(yáng)極碳刷表面微生物SEMFig.7 SEM of microorganisms on the surface of anode carbon brush

2.3.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)微生物在不同物種分類學(xué)水平上進(jìn)行分析，研究反應(yīng)器內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)變化，推斷出主要微生物的功能與作用。微生物門水平的相對(duì)豐度如圖8（a）所示。Proteobacteria（變形菌門）相對(duì)豐度最高，在接種污泥、C-MFC 和Pyr-MFC 中的相對(duì)豐度分別為58.22%、68.09%、76.21%，是產(chǎn)電菌與反硝化菌的主要優(yōu)勢(shì)菌門。Proteobacteria 是革蘭氏陰性菌，廣泛存在于城市污水及活性污泥中，且大多數(shù)的異養(yǎng)和自養(yǎng)反硝化菌屬于Proteobacteria[23-24]，該菌門包含了許多固氮微生物，能夠強(qiáng)化脫氮作用[25-26]。Bacteroidetes（擬桿菌門）為化能異養(yǎng)菌[27]，相對(duì)豐度僅次于Proteobacteria，分別為25.31%、22.85%和10.65%。Pyr-MFC 中Bacteroidetes 的相對(duì)豐度低于C-MFC，表明Pyr-MFC 反應(yīng)器中的自養(yǎng)反硝化水平不斷提高。

圖8 微生物不同物種分類學(xué)水平的相對(duì)豐度Fig.8 Relative abundance of microorganisms at the taxonomic level of different species

研究表明，最常見(jiàn)的電化學(xué)活性細(xì)菌在門水平上一般屬于Proteobacteria、Acidobacteria（酸桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Actinobacteria（放線菌門）[28]。通過(guò)在MFC 系統(tǒng)中培養(yǎng)，該類微生物占比增加。此外，F(xiàn)eS2的投加使得這4 個(gè)菌門的相對(duì)豐度從C-MFC 中的68.09%、2.52%、0.03%、0.03%分別提高到Pyr-MFC 中的76.21%、4.52%、0.64%、0.19%。表明MFC 系統(tǒng)有利于產(chǎn)電菌的富集，且FeS2的投加進(jìn)一步提高了產(chǎn)電能力。

微生物屬水平的相對(duì)豐度如圖8（b）所示。接種污泥、C-MFC、Pyr-MFC 反應(yīng)器中占比最大的菌屬為異養(yǎng)反硝化菌Thauera（陶厄氏菌屬），其屬于Proteobacteria，相對(duì)豐度分別為0.94%、37.38%和44.12%。Shen 等[29]的研究表明，Thauera是在以乙酸鈉為反硝化碳源時(shí)相對(duì)豐度最高的菌屬。自養(yǎng)反硝化菌是指能夠?qū)o(wú)機(jī)化合物（如硫化物、鐵、分子氫、其他金屬）的氧化與硝酸鹽的還原耦合起來(lái)的菌屬[30]。異養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的CO2作為自養(yǎng)反硝化菌的額外無(wú)機(jī)碳源[31]。Thiobacillus（硫桿菌屬）是常見(jiàn)的自養(yǎng)反硝化菌，相對(duì)豐度分別為0.00%、0.03%和1.05%，在硫自養(yǎng)反硝化中起著關(guān)鍵作用，可以利用單質(zhì)硫、硫化物及硫代硫酸鹽等作為電子供體，還原硝酸鹽和亞硝酸鹽[32]。與C-MFC 相比，Pyr-MFC 中的異養(yǎng)與自養(yǎng)反硝化菌的相對(duì)豐度都得到了增長(zhǎng)。Hydrogenophaga（噬氫菌屬）是一種兼性噬氫自養(yǎng)菌，具有促進(jìn)同步硝化反硝化系統(tǒng)脫氮性能[33]。接種 污 泥、C-MFC、Pyr-MFC 3 組 污 泥 樣 品 中 的Hydrogenophaga相對(duì)豐度分別為0.04%、0.77%和2.43%，表明FeS2的投加可以促進(jìn)該菌的富集生長(zhǎng)，其原因可能是與投加的鐵有關(guān)[33]。Denitratisoma是一種典型的可利用硝酸鹽為電子受體的異養(yǎng)反硝化菌，具有去除氮和其他化合物的能力，接種污泥、C-MFC、 Pyr-MFC 中該菌的相對(duì)豐度分別為6.90%、1.43%和2.27%，表明低C/N 不利于該菌在C-MFC、Pyr-MFC 2 組反應(yīng)器的生長(zhǎng)。此外，Geobacter（地桿菌屬）的相對(duì)豐度分別為0.00%、0.03%和1.70%。Geobacter是參與電子形成的產(chǎn)電微生物，是一種鐵還原菌[34]。電化學(xué)活性細(xì)菌（EAB）可以通過(guò)電子的直接轉(zhuǎn)移參與并加速反硝化過(guò)程。電流對(duì)異養(yǎng)反硝化菌有一定的刺激作用，能刺激異養(yǎng)反硝化菌的新陳代謝，提高其脫氮速率[35]。

FeS2的投加使得體系中與脫氮相關(guān)的菌屬提高了約9.43%，表明FeS2能影響微生物群落的分布，從而可以促進(jìn)硝酸鹽的去除，同時(shí)產(chǎn)生生物電。

2.3.3 物質(zhì)轉(zhuǎn)移分析

FeS2的理論S/Fe 約為1.15，本試驗(yàn)中反應(yīng)前FeS2的初始S/Fe 約為3.53，比例偏高，可能是部分鐵在稀硝酸預(yù)處理過(guò)程中流失所致。反應(yīng)后FeS2的S/Fe 降至2.02。圖9 表明，反應(yīng)后的FeS2顆粒表面硫含量降低，F(xiàn)eS2中Sn2-、S0等多價(jià)態(tài)硫含量出現(xiàn)變化，說(shuō)明FeS2在物質(zhì)轉(zhuǎn)移過(guò)程中出現(xiàn)了多價(jià)態(tài)硫中間產(chǎn)物。反應(yīng)后鐵峰形復(fù)雜，可能有多種鐵氧化物或鐵硫化物存在。且711 eV 左右的峰較大（可能為三價(jià)鐵的峰值）、708 eV 左右的峰較?。赡転槎r(jià)鐵的峰值），其原因可能是鐵參與循環(huán)所致[33]。研究表明，鐵元素影響著反硝化過(guò)程中與電子傳遞相關(guān)的酶的作用[36]，許多異種金屬還原細(xì)菌，如Geobacter和Shewanella oneidensis，使用Fe（Ⅲ）作為電子受體，而元素硫也介導(dǎo)了細(xì)菌鐵還原過(guò)程中的電子傳遞[37-38]。

圖9 FeS2 反應(yīng)前后XPS 圖Fig.9 XPS diagram before and after FeS2 reaction

由圖9 可知，反應(yīng)后的FeS2中Sn2-、S0等多價(jià)態(tài)硫含量出現(xiàn)變化，F(xiàn)eS2在物質(zhì)轉(zhuǎn)移過(guò)程中出現(xiàn)了多價(jià)態(tài)硫中間產(chǎn)物，最終轉(zhuǎn)化為SO42-，證明FeS2中的元素S 參與了MFC 脫氮產(chǎn)電。且Thiobacillus的增長(zhǎng)，進(jìn)一步證明Pyr-MFC 體系中發(fā)生了FeS2驅(qū)動(dòng)的硫自養(yǎng)反硝化。以FeS2為電子供體的自養(yǎng)反硝化方程如式（2）所示。其中，F(xiàn)eS2是雙電子供體，F(xiàn)eS2中元素S 氧化為SO42-時(shí)產(chǎn)生14 個(gè)電子，而Fe2+氧化為Fe3+時(shí)產(chǎn)生1 個(gè)電子，產(chǎn)生大部分能量的是硫化物部分的氧化，而不是鐵。因此，F(xiàn)eS2作為電子供體，一定程度上彌補(bǔ)了碳源不足的缺陷，通過(guò)自養(yǎng)反硝化提高低C/N 脫氮效果，且FeS2對(duì)反硝化微生物的刺激也提高了MFC 脫氮效果。

加入FeCl2、FeCl3、Na2S、NaS2O3的MFC 反應(yīng)器對(duì)NO3--N 的去除率分別為77.0%、72.0%、93.2%和89.2%（數(shù)據(jù)圖未展示）。如圖10 所示，在4 組MFC 的污泥樣品中，Thauera的總相對(duì)豐度最高，在FeCl2-MFC、FeCl3-MFC、Na2S-MFC和Na2S2O3-MFC中的占比分別為9.05%、1.10%、35.28%和9.63%。因此，相對(duì)于鐵元素，硫元素在MFC 陽(yáng)極反硝化脫氮時(shí)的貢獻(xiàn)比鐵元素更大。

圖10 不同價(jià)態(tài)鐵或硫在MFC 中的微生物相對(duì)豐度Fig.10 Relative microbial abundance of different valence states of iron or sulfur in MFC

Pyr-MFC 反應(yīng)機(jī)理如圖11 所示。FeS2中的S 主要作為電子供體、Fe 主要作為電子穿梭體起作用。FeS2具有捕獲更多電子、促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移的能力，可以刺激反硝化微生物與產(chǎn)電微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而提高M(jìn)FC 脫氮產(chǎn)電性能。

圖11 Pyr-MFC 反應(yīng)機(jī)理示意Fig.11 Schematic diagram of Pyr-MFC reaction mechanism

3 結(jié)論

（1）陽(yáng)極室中加入FeS2構(gòu)建Pyr-MFC 系統(tǒng)提高了體系反硝化脫氮產(chǎn)電效果。相對(duì)于沒(méi)有加入FeS2的C-MFC，Pyr-MFC 具有更高的反硝化脫氮效率和功率密度。在C/N 為5，NO3--N 濃度為100 mg/L時(shí)，NO3--N 去除速率由C-MFC 中的12.02 mg/(L·h)提 高 到Pyr-MFC 的15.54 mg/(L·h)，最 高 電 壓 由0.511 V 提高到0.780 V。

（2）FeS2的加入抑制了MFC 對(duì)高C/N 的依賴性，低C/N 下脫氮效果依然突出。C/N 為4、3、2、1時(shí)，Pyr-MFC 中NO3--N 去除率分別為100%、97.8%、58.4%和49.7%，去除率均高于對(duì)照組反應(yīng)器（99.5%、82.1%、45.9%和38.7%）。根據(jù)不同C/N 的產(chǎn)電規(guī)律可知，F(xiàn)eS2可以提高M(jìn)FC 產(chǎn)電性能，但是不能替代碳源的產(chǎn)電貢獻(xiàn)，在低C/N 范圍COD 越高，產(chǎn)電性能越好。FeS2作為電子供體，一定程度上彌補(bǔ)了碳源不足，通過(guò)自養(yǎng)反硝化提高了低C/N 的脫氮效果。

（3）相比于C-MFC，Pyr-MFC 中碳刷電極生物負(fù)載量增加，細(xì)菌間的黏附力增大，反硝化菌和產(chǎn)電菌的豐度增加，微生物群落更加多樣化，如Thauera、Thiobacillus和Geobacter的相對(duì)豐度分別由37.38%、0.03%、0.03%提高到44.12%、1.05%、1.70%，與脫氮相關(guān)的菌屬相對(duì)豐度提高了約9.43%。FeS2的投加為微生物生長(zhǎng)提供了附著空間，且刺激了多種微生物的繁殖，從而提高了反硝化性能和電回收率。