蔡佳煒,張 琛,靳榮帥,鮑志遠,張希宇,王 璠,翟 頻,趙博昊,陳 陽, 湯先偉,吳信生*

(1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院,揚州 225009;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所,南京 210014; 3.江蘇省邳州市東方養(yǎng)殖有限公司,邳州 221300)

近年來,隨著氣候的變暖,高溫對畜牧業(yè)發(fā)展的影響已成為全球關(guān)注的熱點[1]。適宜的溫濕度、優(yōu)良的飼養(yǎng)環(huán)境是家畜健康生長,高效生產(chǎn)的重要保障。熱應激(heat stress,HS)指動物機體對生長環(huán)境溫度升高產(chǎn)生的一系列非特異性防御應答的總和[2]。全球氣候變暖,機體暴露在極高溫度下會導致熱應激的發(fā)生[3]。熱應激會導致公畜精子數(shù)量、密度、畸形率等的改變,造成公畜繁殖性能的下降,甚至會出現(xiàn)不育的現(xiàn)象[4]。熱應激對豬生長發(fā)育危害嚴重,導致種公豬睪丸退化、交配欲減退,甚至喪失生育能力[5-7],母豬初情期延遲,發(fā)情期變短,無法正常排卵,受胎率下降[8]。熱應激狀態(tài)下,奶牛免疫機能下降,身體能量處于負平衡狀態(tài),采食量下降、產(chǎn)奶量和乳制品產(chǎn)量均會下降[9-11]。熱應激嚴重影響了家畜的健康、生長和繁殖性能。

家兔是恒溫動物,功能性汗腺較少,在高溫下,呼吸頻率增加、采食量下降、體內(nèi)代謝紊亂,導致生產(chǎn)性能下降[12]。高溫條件下暴露3 h,公兔體內(nèi)活性氧(ROS)、熱休克蛋白(HSP)生成異常,睪丸微環(huán)境發(fā)生改變,染色質(zhì)構(gòu)像和DNA甲基化改變,阻礙了精子的生成,精子功能遭到破壞[13]。環(huán)境溫度高于18 ℃,公兔不育發(fā)生率會顯著增加[14]。研究發(fā)現(xiàn),公兔精子在38～40 ℃下孵育3 h,受精率從98%下降至96%,胚胎存活率更是從59%下降到了34%[15]。熱應激還會通過線粒體途徑導致DNA損傷,導致DNA修復相關(guān)基因表達降低[16-18]。動物發(fā)生熱應激時,體內(nèi)線粒體凋亡、生殖細胞死亡-受體凋亡、AMPK等通路均會受到影響,進而影響精子的生成和發(fā)育[19-21]。

為了進一步了解家兔熱應激發(fā)生的分子機制,本研究分析了種公兔在熱應激和未熱應激條件下的睪丸組織形態(tài)差異,并采用RNA-Seq技術(shù)篩選了不同狀態(tài)下精子的差異表達基因,以探究熱應激對種公兔精子發(fā)生的影響,為種公兔耐熱性狀的選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

課題組前期選取具有相同飼養(yǎng)水平,體況和體重相近的20只新西蘭白兔種公兔作為試驗對象。通過計算溫濕度指數(shù)(THI),記錄了5月和8月溫濕度,將5月份定義為未熱應激組(non-heat stressed, NHS),8月份定義為熱應激組(heat stressed, HS)[22]。采精時間為2021年5月1～20日和8月1～20日。每組隨機選取3只種公兔,將采集的精液用于轉(zhuǎn)錄組分析。此外,用丙泊酚加塞拉嗪麻醉后,剖開腹腔取出睪丸,用于后期組織切片的制作。

1.2 睪丸組織切片的制作及HE染色

種公兔睪丸組織在PBS中清洗3次,加入4%多聚甲醛溶液固定24 h,濾紙吸凈多聚甲醛溶液,將組織依次放入由低到高濃度的酒精中脫水,然后通過二甲苯透明和石蠟包埋,將組織塊固定在切片機上,切取5～7 μm的組織,溫水展片,載玻片撈取,60 ℃烘箱烘干備用。

采用二甲苯去除睪丸切片中殘存的石蠟,再將制作好的睪丸切片依次放入由高到低濃度的酒精中,輕輕甩掉切片上多余的水分,蘇木素中浸染5 min,再用水漂洗數(shù)秒,1%鹽酸乙醇處理組織切片10 s,蒸餾水下沖洗后,用0.6%氨水使組織切片返藍,再用伊紅染色液染色2 min,染色后切片經(jīng)過無水乙醇脫水、二甲苯透明等過程,滴上樹膠、蓋上蓋玻片封片,用顯微鏡觀察卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組(RNA-Seq)測序分析

使用總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取6只新西蘭種公兔精子總RNA?？俁NA經(jīng)純化后檢測其完整性和濃度。檢測合格后,合成cDNA并構(gòu)建文庫?；贗llumina HiSeq 測序平臺,對文庫進行測序,回收測序數(shù)據(jù)。對原始下機數(shù)據(jù)進行過濾,將得到的Reads比對到參考基因組上,使用FPKM標準化對熱應激組和未熱應激組樣本進行基因表達量分析。建庫及測序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4 差異表達基因的分析和篩選

根據(jù)基因表達量對各樣品進行主成分分析(PCA),采用DESeq(http://wwwbioconductororg/packagcs/rclcascbioc/html/DEScq.html)對基因表達進行差異分析,篩選出符合表達差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1,P-value<0.05的差異表達基因。使用R語言Pheatmap軟件包對所有比較組差異基因的并集和樣品進行雙向聚類分析,并對篩選出的差異表達基因進行GO功能以及KEGG富集通路分析。

1.5 實時熒光定量驗證

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物,由擎科生物科技公司合成。使用ChamQTM SYBR qPCR Mster Mix(諾唯贊生物科技(南京)有限公司)試劑盒進行熒光定量驗證。引物序列見表1。反應體系共20 μL:2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL,cDNA 1 μL、ddH2O 7.8 μL。PCR擴增程序:預變性階段為95 ℃ 30 s;循環(huán)反應為95 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s(40個循環(huán));熔解曲線為95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件比較不同樣品間的均值與標準誤,試驗數(shù)據(jù)使用“平均數(shù)±標準差”表示。采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行定量分析,利用t檢驗分析數(shù)據(jù)的顯著性,并利用GraphPad Prism 8軟件進行繪圖,以*P<0.05表示差異顯著,**P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 熱應激下睪丸組織切片分析

種公兔睪丸組織切片HE染色表明,NHS組的睪丸曲細精管基膜清晰,生精上皮細胞排列緊密、整齊有序,各種排列相均清晰可辨,精原細胞、精母細胞和精子細胞在小管中排列緊密(圖1A)。而HS組的睪丸生精上皮較薄,受損情況顯著,中央出現(xiàn)明顯的空泡化和撕裂,精子細胞數(shù)量減少,生殖細胞和基底膜之間存在分離,間質(zhì)空間增加(圖1B)。

A. 未熱應激組;B. 熱應激組A. Non-heat stress group; B. Heat stress group圖1 睪丸切片圖Fig.1 Testicular section

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

采用Cutadapt去除3′端帶接頭的序列以及去除平均質(zhì)量分數(shù)低于Q20的序列,可以發(fā)現(xiàn)Q20、Q30及純凈序列的占比都在85%以上(表2),表明測序質(zhì)量好,完整性較高。此外,將過濾得到的純凈序列與兔參考基因組進行比對分析(表3),對比率均高于70%,表明得到的純凈序列對比率和可信度較高。同時,對樣品間進行PCA主成分分析,結(jié)果見圖2,PC1(84%),表明在受到熱應激刺激后兩組之間基因表達發(fā)生了明顯的變化,可進行后續(xù)差異基因的分析。

表2 測序數(shù)據(jù)過濾Table 2 Results of sequencing data filtering

表3 測序數(shù)據(jù)對比分析Table 3 Comparison and analysis of sequencing data

圖2 PCA主成分分析結(jié)果圖Fig.2 PCA principal component analysis result

2.3 差異表達基因分析

采用DESeq對基因表達進行差異分析,共檢測到差異表達基因1 676個,其中上調(diào)基因894個,下調(diào)基因782個,包括ATP5MC1、MDH2、ALDH7A1、GAPDHS、PRPS1基因等。對篩選出的差異基因進行聚類分析,結(jié)果顯示兩組間的差異基因聚類效果較好(圖3)。

A.差異表達基因火山圖;B.差異表達基因聚類分析A. Volcano plot of differentially expressed genes; B. Clustering analysis of differentially expressed genes圖3 差異表達基因分析圖Fig.3 Analysis of differentially expressed genes

2.4 差異表達基因的GO富集分析

按照生物學過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細胞組分(cellular component)對差異表達基因進行GO富集分析,挑選每個GO分類中富集最顯著的前10個GO 條目進行分析。差異上調(diào)基因主要富集在應激反應(response to stress)、細胞因子(response to cytokine)、蛋白質(zhì)代謝過程(protein metabolic process)、有機物質(zhì)運輸(organic substance transport)等功能;差異下調(diào)基因主要富集在代謝過程(metabolic process)、免疫反應(immune response)、催化活性(catalytic activity)等功能(圖4)。

A.差異基因表達GO分類圖;B.差異基因表達GO富集氣泡圖A. GO classification map of differential gene expression; B. GO enrichment bubble diagram of differential gene expression圖4 差異基因表達的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differential gene expression

2.5 差異表達基因的KEGG富集分析

在動物體內(nèi),基因間通過協(xié)同作用發(fā)揮各自的功能,對基因進行通路分析有助于確定相關(guān)基因行使的生物學功能。對差異表達基因進行KEGG富集分析,共涉及316條通路,其中,與熱應激相關(guān)的主要有MAPK(MAPK signaling pathway)、PI3K-Akt(PI3K-Akt signaling pathway)、Toll樣受體(Toll-like receptor signaling pathway)、Ras(Ras signaling pathway)等信號通路(圖5)。

2.6 差異表達基因的RT-PCR驗證

為了驗證RNA-Seq測序結(jié)果的可靠性,隨機選取5個差異表達基因(ATP5MC1、MDH2、PRPS1、ALDH7A1和GAPDHS)進行RT-qPCR驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATP5MC1、MDH2、ALDH7A1和GAPDHS基因在NHS種公兔精液中相對表達量高于HS種公兔(P<0.01),而PRPS1基因在NHS種公兔精液中相對表達量低于HS種公兔(P<0.01)(圖6)。RT-PCR結(jié)果與RNA-Seq測序結(jié)果趨勢一致,證明本次測序結(jié)果可靠。

A.差異基因表達KEGG分類圖;B.差異基因表達KEGG富集氣泡圖A. KEGG classification map of differentially expressed genes; B. Bubble diagram of KEGG enrichment of differential gene expression圖5 差異基因表達的KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of differential gene expression

A.差異基因測序時的表達量;B.差異基因RT-PCR驗證分析。**表示差異極顯著(P<0.01)A.Expression of differential gene sequencing; B. RT-PCR verification analysis of differential genes.** represents P<0.01, with significant difference圖6 差異基因的表達圖Fig.6 Expression map of differential genes

3 討 論

家兔汗腺不發(fā)達,大多通過呼吸和耳垂來進行散熱。熱應激會引起動物機體多種生理反應,對動物福利產(chǎn)生負面影響,并顯著降低繁殖性能[23-25]。在熱應激下,動物機體抗氧化能力下降,活性氧(ROS)增加,發(fā)生氧化應激反應,精子的DNA和運動能力均會受到影響,最終導致精液品質(zhì)的下降[26-28]。熱應激對睪丸功能有負面影響,能抑制睪丸激素的分泌,導致精子質(zhì)量和生育能力的下降[29]。家兔的最佳環(huán)境溫度范圍為15～25 ℃,最佳濕度為55%～65%,當環(huán)境溫度高于35 ℃時,家兔不能調(diào)節(jié)體溫,易產(chǎn)生熱應激[30]。種公兔比母兔對高溫更加敏感,高溫抑制了下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的合成和分泌,顯著影響睪丸的功能并導致精液品質(zhì)的下降[31]。種公兔的繁殖效率在生產(chǎn)中極為重要[32],因此具有高品質(zhì)的精液是實現(xiàn)高生育能力和提高經(jīng)濟效益所必需的。

本試驗采集了HS組和NHS組新西蘭種公兔睪丸和精液,通過HE染色,比較不同條件下睪丸組織結(jié)構(gòu)的差異,并利用RNA-Seq技術(shù)分析了精子的轉(zhuǎn)錄組,通過分析比較共發(fā)現(xiàn)1 676個差異基因,其中差異上調(diào)基因894個,差異下調(diào)基因782個。進一步對差異基因進行篩選、功能注釋和富集分析發(fā)現(xiàn),GO富集分析在代謝過程中的差異基因有843個,其中包括ATP5MC1、MDH2、PRPS1、ALDH7A1和GAPDHS等。ALDH7A1蛋白也稱遺蛋白,RNA-Seq分析方法鑒定經(jīng)過急性熱應激處理的黃羽肉雞肝臟中的差異表達基因,發(fā)現(xiàn)ALDH7A1基因參與丙酮酸代謝,并且在賴氨酸的分解代謝中也發(fā)揮了重要作用[33],賴氨酸是一種必需氨基酸,其代謝對維持細胞氮庫和酮體的形成具有重要意義[34]。據(jù)研究表明,ALDH7A1可通過甜菜堿醛生成滲透物甜菜堿來防止哺乳動物受到高滲應激方面的影響[35]。在哺乳動物中,GAPDHS是一種精子特異性糖酵解酶,是精子中唯一的GAPDH同工酶,可調(diào)節(jié)精子的運動,是精子活力和男性生育能力所必需的。研究表明,缺乏GAPDHS的小鼠無法生育,產(chǎn)生的精子ATP水平非常低且缺乏運動能力[36-38]。MDH2是一種檸檬酸循環(huán)酶,可催化蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸,并通過將草酰乙酸還原成蘋果酸和蘋果酸共同穿過線粒體內(nèi)膜參加糖異生過程。MDH2位于精子線粒體內(nèi),為精子尾部運動提供所需的能量[39-41],MDH2的異常表達會破壞精子內(nèi)部能量平衡,影響精子的活力、獲能過程以及降低生育能力[42]。研究發(fā)現(xiàn),MDH2的敲除顯著降低了細胞的ATP水平,同時提高了ADP/ATP和NAD/NADH的水平以及細胞內(nèi)ROS的濃度[43]。從GO富集分析看來,ALDH7A1、GAPDHS、MDH2等基因可能與熱應激狀態(tài)下公兔精液品質(zhì)下降有關(guān)。

此外,通過對差異表達基因的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),與熱應激相關(guān)的主要有MAPK、PI3K-Akt、Toll樣受體、Ras等信號通路。在熱應激中,MAPK通路被激活,可防止HS誘導的細胞凋亡[44],MAPK通路參與調(diào)節(jié)細胞的生存、增殖和分化等過程,這在保護細胞免受熱損傷中起著關(guān)鍵作用。PI3K-Akt通路是參與細胞生長、存活和代謝的重要通路之一,陳威[45]發(fā)現(xiàn),抑制睪丸中PI3K/Akt/FoxO1信號通路,凋亡因子Caspase-3被激活,進而導致睪丸組織細胞凋亡。睪丸支持細胞(SCs)是促使睪丸產(chǎn)生正常精子的重要細胞之一,PI3K/Akt信號通路可以通過調(diào)節(jié)激素水平來調(diào)控精子發(fā)生[46]。因此,推測熱應激與MAPK、PI3K-Akt等信號通路密切相關(guān),影響種公兔精子的發(fā)生。

綜上,HS的機制可能涉及ATP5MC1、MDH2、PRPS1、ALDH7A1和GAPDHS等多個基因,也可能通過MAPK、PI3K-Akt這些信號通路來調(diào)控細胞的生長、增殖和凋亡。通過了解熱應激反應的分子機制,確定新的靶點,可以有效地預防熱應激帶來的疾病和危害。

4 結(jié) 論

本研究對新西蘭種公兔精子熱應激組和未熱應激組進行轉(zhuǎn)錄組分析,檢測差異表達基因及相關(guān)信號通路,共篩選出1 676個差異表達基因(上調(diào)基因894個,下調(diào)基因782個),發(fā)現(xiàn)SIRT1、PHGDH、MDH2、ATP5MC1、PRPS1、ALDH7A1等5個可能與熱應激狀態(tài)下公兔精液品質(zhì)下降有關(guān)的潛在基因,本研究結(jié)果為高溫環(huán)境下家兔的選育提供理論基礎(chǔ),對養(yǎng)兔業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。