張 倩,崔 燕,余四九,何俊峰,潘陽陽,王 萌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070)

近年來,多項研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究生物體發(fā)育階段的基因調(diào)控,并把從轉(zhuǎn)錄組分析中獲得的相關(guān)基因與轉(zhuǎn)錄本的功能表征結(jié)合[1-2],深入探究機(jī)體生長發(fā)育過程與遺傳和環(huán)境間的互作關(guān)系。大腦皮質(zhì)是感覺、自主運動和認(rèn)知功能的中樞,高度有序的結(jié)構(gòu)功能及發(fā)育依賴于基因在時空上精確的調(diào)控,其發(fā)育的異常會導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[3]。前期有研究對不同年齡人類[4]及小鼠[5]大腦皮質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果顯示隨著年齡增長突觸活性和免疫功能上升。

牦牛是青藏高原高寒牧區(qū)的特有畜種,也是當(dāng)?shù)啬撩瘾@取奶、肉、皮等畜產(chǎn)品的重要來源,高寒、低氧、強(qiáng)輻射是青藏高原最顯著的環(huán)境特征,牦牛各器官對低氧形成了其獨特的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機(jī)制,尤其體現(xiàn)在呼吸和心血管系統(tǒng)[6-7]。梁林[8]報道,高原低氧牦牛腦組織對低氧產(chǎn)生了適應(yīng)性,其大腦皮質(zhì)分層數(shù)和神經(jīng)元類型與其他哺乳類動物大體相同,發(fā)育特點與其他哺乳類動物也相似,皮質(zhì)厚度隨著年齡的增長逐漸增加,大腦皮質(zhì)微血管密度均體現(xiàn)出隨年齡增長而逐漸上升的趨勢。此外,黃興[9]運用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對牦牛大腦低氧適應(yīng)性進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示隨著海拔升高,牦牛的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量逐漸增加,表達(dá)網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜,具有更多差異顯著的低氧適應(yīng)相關(guān)通路,而低海拔牛的表達(dá)調(diào)控相對單一。近年來,學(xué)者們除了關(guān)注牦牛腦組織的低氧適應(yīng)性,也開始關(guān)注在高原環(huán)境下牦牛各器官的生長發(fā)育機(jī)制,目前關(guān)于不同發(fā)育階段牦牛轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究僅限于瘤胃[10]、肝臟[11]、肺臟[12]和肌肉[13]的發(fā)育機(jī)制?；诖?本研究對初生和成年牦牛大腦皮質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,旨在深入挖掘影響牦牛大腦皮質(zhì)生長發(fā)育的因子,最終為進(jìn)一步探究高原動物大腦的生長發(fā)育機(jī)理提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物分為初生(1～7日齡,NYB)和成年(3～4歲,AYB)組的健康雄性青海高原牦牛,每組3 個生物學(xué)重復(fù)。2021年7 月采自青海省西寧市,放血處死,快速采集初生及成年牦牛大腦皮質(zhì)額葉組織置于液氮,之后轉(zhuǎn)至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 牦牛大腦皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組測序

選取初生和成年牦牛各3個大腦皮質(zhì)組織樣品,使用TRIzol 試劑(Invitrogen)提取總RNA,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,利用Nano-Drop ND-1000 (Thermo scientific)和2100 Bioanalyzer(Agilent)分別對RNA的量與純度進(jìn)行質(zhì)控,之后使用 Illumina Hiseq xten測序平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3 牦牛大腦皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組測序分析

運用FastQC和 Trim-Glore軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過濾,之后借助HISAT2 軟件 (https://daehwankimlab.github.io/hisat2/,版本為hisat2-2.0.4)[14]將得到的Clean Data比對到牦牛參考基因組上(版本為 BosGruv3. 0),然后使用Htseq-count[15]軟件對Clean Reads進(jìn)行計數(shù),再用String Tie軟件 (版本為1.3.4d.Linux_x86_64)[16]進(jìn)行FPKM定量。使用R包DESeq2對樣本進(jìn)行差異顯著分析[17],將P<0.05和|log2(fold change)|≥1作為篩選條件,之后獲得差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs),并用ClusterProfiler[18]軟件對DEGs進(jìn)行GO (Gene ontology)和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。

1.4 qRT-PCR差異驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性,隨機(jī)選出9個DEGs,通過qRT-PCR 技術(shù)進(jìn)行驗證分析,采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物(表1),以β-actin作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析[19],通過SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析。

表1 RT-qPCR 引物序列信息Table 1 Primers information for RT-qPCR

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

本研究分別采集初生和成年的牦牛大腦皮質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,RNA 樣品量>18 μg,純度檢測值(OD260 nm/OD280 nm)>2.0,RNA 完整性檢測(RNA intergrity number, RIN)>9.0,說明所有 RNA 樣本質(zhì)檢合格,符合建庫要求。各樣本過濾后的序列數(shù)據(jù)不少于4.75×107條,所測數(shù)據(jù)的堿基長度達(dá)到6.41 G以上,Q20 均大于 99.89%,Q30在97.26%以上,并且GC 含量在48.00%～51.00% (表2),比對到參考基因組的 Reads 與 Clean Reads 的比率在 86.53%以上,表明測序所得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠,可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析要求。

2.2 初生及成年牦牛腦組織的DEGs篩選

在成年組相對初生牦牛的大腦皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組分析中共獲得4 790個DEGs,其中包括2 670個上調(diào)表達(dá)的DEGs,2 120個下調(diào)表達(dá)的DEGs(圖1)。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測分析

虛線左側(cè)代表顯著下調(diào)基因,虛線右側(cè)代表顯著上調(diào)基因。NYB代表初生組;AYB代表成年組 The left side of the dotted line represents significantly down-regulated genes, and the right side of the dotted line represents significantly up-regulated genes. NYB stands for the newborn group; AYB stands for the adult group圖1 不同年齡牦牛大腦皮質(zhì)發(fā)育中DEGs火山圖(AYB vs. NYB)Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes in the yak cerebral cortex at different age (AYB vs. NYB)

2.3 差異表達(dá)基因GO功能聚類

對在成年組和初生組牦牛大腦皮質(zhì) (AYBvs. NYB) 中4 790個DEGs進(jìn)行GO 功能分類富集,共富集到 8 751個GO條目,包括845個細(xì)胞組成 (cellular component, CC),1 734個分子功能 (molecular function, MF),6 172個生物過程 (biological process, BP)。前50條顯著富集到的GO條目如圖2所示,在BP分類中,其中占比例最大的3個二級條目從高到低為轉(zhuǎn)錄調(diào)控(255個基因),RNA聚合酶II正調(diào)控轉(zhuǎn)錄(237個基因),蛋白質(zhì)磷酸化(166個基因)。在CC分類中,細(xì)胞質(zhì)(598個基因)占比例最多,其次為質(zhì)膜(564個基因)和細(xì)胞核(554個基因)。在MF分類中,其中占比例最大的3個二級條目為蛋白結(jié)合(806個基因),相同的蛋白結(jié)合(274個基因)以及ATP結(jié)合(272個基因)。

2.4 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

KEGG富集分析的結(jié)果表明,在成年組相對初生組牦牛大腦皮質(zhì)篩選出的DEGs主要在325條信號通路,圖3中列出了前20條顯著富集到的通路,分別為PI3K-Akt信號通路(129個基因)、MAPK信號通路(119個基因)、HIF信號通路(90個基因)和軸突導(dǎo)向(85個基因)等。

2.5 qRT-PCR 驗證

為了進(jìn)一步檢測 RNA-Seq 所識別 DEGs 的可靠性,9個DEGs被隨機(jī)篩選進(jìn)行 qRT-PCR驗證,如圖 4 顯示,以初生牦牛為對照,成年牦牛VEGFA、PDGFA、IGF1、AKT1、ERK1、BDNF、NGF及Slit2顯著上調(diào);HIF1α顯著下調(diào),上述挑選的DEGs表達(dá)模式均與 RNA-Seq 數(shù)據(jù)一致。

圖2 不同年齡牦牛大腦皮質(zhì)發(fā)育中DEGs富集分析中前50個GO條目 (AYB vs. NYB)Fig.2 Top 50 GO items in DEGs enrichment analysis of cerebral cortex development in yaks at different ages (AYB vs. NYB)

圖3 不同年齡牦牛大腦皮質(zhì)發(fā)育中DEGs富集分析中前20條KEGG通路 (AYB vs. NYB)Fig.3 Top 20 KEGG pathways in DEGs enrichment analysis of cerebral cortex development in yaks at different ages (AYB vs. NYB)

*. P<0.05圖4 qRT-PCR檢測9個DEGs在初生及成年牦牛大腦皮質(zhì)的表達(dá)模式Fig.4 qRT-PCR verification of the expression tendency of 9 DEGs in the cerebral cortex of newborn and adult yaks

2.6 調(diào)控大腦皮質(zhì)發(fā)育的候選基因篩選

通過篩選KEGG富集到的信號通路,共得到與神經(jīng)元神經(jīng)突發(fā)育及可塑性、突觸囊泡傳遞、膠質(zhì)細(xì)胞增殖、免疫防御及低氧適應(yīng)相關(guān)的13個DEGs,其中11個上調(diào)基因,2個下調(diào)基因(表3、圖5)。

表3 參與調(diào)控大腦皮質(zhì)發(fā)育的信號通路及基因Table 3 Signaling pathway and genes realated to the development of yak cerebral cortex

3 討 論

本研究利用RNA-seq技術(shù)對初生和成年牦牛大腦皮質(zhì)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,篩選出了2 670個上調(diào)表達(dá)的差異基因,2 120個下調(diào)表達(dá)的差異基因,并對DEGs進(jìn)行了GO功能分類富集,分析發(fā)現(xiàn)占比最多的條目是轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶II 正調(diào)控轉(zhuǎn)錄、蛋白結(jié)合和ATP結(jié)合,大部分都與能量產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程緊密相關(guān),說明成年牦牛大腦皮質(zhì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和能量利用較為活躍,提示成年牦牛神經(jīng)遞質(zhì)生成、釋放等生理活動較旺盛。

KEGG富集分析得到了DEGs的主要富集通路,包括PI3K-Akt、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、 MAPK、軸突導(dǎo)向、鈣信號、磷脂酶D信號、突觸囊泡運輸、Toll樣受體等與大腦發(fā)育相關(guān)的通路,這與前人對其他動物大腦增齡性轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相似[3-5],但有意思的是,本研究顯示HIF信號通路也在TOP通路中,這與其他動物不一樣,可能與牦牛常年生活在高原低氧環(huán)境相關(guān),有研究報道低氧誘導(dǎo)因子通路是重要的缺氧適應(yīng)性調(diào)節(jié)因子信號,在缺氧條件下HIF觸發(fā)多種基因的表達(dá),這些基因能夠啟動紅細(xì)胞生成、血管生成、糖代謝及轉(zhuǎn)運、細(xì)胞存活等,可在低氧腦組織起到保護(hù)作用[20]。Wang等[21]和Zhang等[22]報道,PI3K-AKT 是神經(jīng)細(xì)胞增殖、生長、存活和代謝的正向調(diào)節(jié)信號,可以將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核,激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控應(yīng)激蛋白基因的表達(dá),促進(jìn)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成,如神經(jīng)營養(yǎng)因子生長及神經(jīng)細(xì)胞表面受體等,完成對胞外刺激的反應(yīng)蛋白。神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路主要存在于突觸小泡、軸突末端和樹突的胞漿中,促進(jìn)突觸傳遞[4]。軸突導(dǎo)向因子信號不僅能夠調(diào)控軸突的生長,還能定向細(xì)胞遷移,幫助在大腦損害后起到抗凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移、調(diào)節(jié)軸突方向形成作用[23]。鈣信號在突觸傳遞和改變神經(jīng)突動力學(xué)方面發(fā)揮功能[24]。磷脂酶D信號能夠參與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖[25]。突觸囊泡運輸信號能夠決定神經(jīng)遞質(zhì)運輸?shù)奶禺愋訹26]。MAPK信號具有廣泛的神經(jīng)發(fā)育和生理功能,在神經(jīng)發(fā)育過程中調(diào)節(jié)神經(jīng)組織的細(xì)胞增殖和分化是至關(guān)重要的,尤其能夠促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖及遷移,有利于損傷修復(fù)[27]。上述信號通路被富集,說明成年牦牛大腦皮質(zhì)中突觸發(fā)育及可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、膠質(zhì)細(xì)胞增殖、免疫防御、低氧適應(yīng)相關(guān)的功能非?；钴S,即成年牦牛大腦皮質(zhì)發(fā)育可能更完善。

在KEGG富集排名較前且符合大腦發(fā)育通路中,挑選顯著上調(diào)或下調(diào)P值最小的基因,篩選出與牦牛大腦皮質(zhì)生長發(fā)育相關(guān)的13個候選基因,有研究表明這些基因均與大腦發(fā)育相關(guān)。其中SEMA5A和Slit2在成年牦牛大腦皮質(zhì)高表達(dá),Carulli等[28]報道SEMA5A有兩個功能相反的結(jié)構(gòu)域TSP和SEMA,通過與細(xì)胞外基質(zhì)中特定蛋白多糖的互作介導(dǎo)軸突延伸或抑制過程;Slit2可以引導(dǎo)軸突選擇正確途徑,從而成功到達(dá)靶區(qū),促進(jìn)神經(jīng)元、軸突與靶器官之間形成精準(zhǔn)聯(lián)系[29],以上提示成年牦牛可能軸突調(diào)節(jié)較活躍以及突觸傳遞較準(zhǔn)確。另外,FGF18在成年牦牛大腦組織內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào),Klimaschewski和Claus[30]研究發(fā)現(xiàn),FGF18在膠質(zhì)細(xì)胞形成過程中起著神經(jīng)元源性膠質(zhì)細(xì)胞生長因子的作用,對星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞都具有有絲分裂活性,說明成年牦牛先天免疫能力和血腦屏障可能更完善,具有調(diào)節(jié)損傷和修復(fù)的能力。同樣,作為表達(dá)量顯著上調(diào)的BDNF,它在維持神經(jīng)元的生長及分化過程中至關(guān)重要,尤其是對多巴胺能神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)恢復(fù)作用,還可以調(diào)節(jié)神經(jīng)突向外生長和維持突觸連接穩(wěn)態(tài),從而維持神經(jīng)元的正常功能和突觸可塑性[31],此基因的高表達(dá)提示其可能與大腦皮質(zhì)發(fā)育密切相關(guān)。Rab3a大量分布在囊泡前神經(jīng)末端,與突觸囊泡膜結(jié)合,通過調(diào)節(jié)囊泡運輸過程的定向和捆綁過程,來決定囊泡轉(zhuǎn)運過程的特異性[26],本研究發(fā)現(xiàn)Rab3a在成年牦牛大腦皮質(zhì)顯著上調(diào),說明成年牦?？赡芫哂懈鼮榫珳?zhǔn)的囊泡運輸。VEGFA能促進(jìn)血管生成發(fā)揮營養(yǎng)作用,在發(fā)育和成年期可以刺激神經(jīng)突生長和成熟,以及星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖、遷移和存活,成年牦牛大腦皮質(zhì)VEGFA表達(dá)量上升,表明成年牦牛的星型膠質(zhì)細(xì)胞可能發(fā)育更完善,有利于血腦屏障的形成及穩(wěn)定[32]。NGF在成年牦牛大腦皮質(zhì)顯著上調(diào),Rocco等[33]報道NGF對中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿能神經(jīng)元的神經(jīng)突生長、發(fā)育和存活至關(guān)重要,有研究報道在胎兒生長過程中,NGF合成異常會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常,長期影響神經(jīng)元連接及信息傳遞,提示成年牦牛腦組織內(nèi)膽堿能神經(jīng)元神經(jīng)突的發(fā)育更為完善。CaMK2A在大腦皮質(zhì)的突觸后致密部含量豐富,通過和 N-甲基-D-天冬氨酸受體,或其他靶結(jié)構(gòu)相結(jié)合補(bǔ)充到突觸后致密區(qū),增加了突觸部位α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸的錨定地點,從而增強(qiáng)了突觸傳遞;另外,在軸突的生長錐中有CaMK2A 蛋白的表達(dá),而CaMK2A具有 F-actin 的結(jié)合區(qū)域,CaMK2A可能通過調(diào)節(jié) F-actin 達(dá)到影響神經(jīng)突延伸、影響神經(jīng)突樹枝狀化及改變神經(jīng)突動力學(xué)的目的[24],因此本研究中成年牦牛CaMK2A高表達(dá)可能提示其突觸可塑性和突觸傳遞功能更完善。PLD1在成年牦牛大腦皮質(zhì)顯著上調(diào),研究表明它們在大腦發(fā)育中可以促進(jìn)突觸和髓鞘的形成,同時神經(jīng)遞質(zhì)中PLD促進(jìn)突觸囊泡融合以及參與囊泡運輸[25],說明成年牦牛神經(jīng)突形成及遞質(zhì)傳遞更完善。Toll樣受體是機(jī)體一線先天防御反應(yīng)的一部分,它構(gòu)成了一個早期預(yù)警系統(tǒng),刺激T淋巴細(xì)胞和抗體介導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng),神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)各種TLR,它們有助于大腦皮質(zhì)的的免疫保護(hù)[34],成年牦牛大腦皮質(zhì)TLR1、TLR4表達(dá)較高,可能提示其調(diào)節(jié)損傷和免疫防御的能力強(qiáng)于初生牦牛。HIF家族是重要的低氧適應(yīng)調(diào)控因子,HIF1α和HIF2α在缺氧時表達(dá)量會顯著上升,促進(jìn)多種生存途徑,包括神經(jīng)保護(hù)、血管生成和神經(jīng)營養(yǎng)素,減少細(xì)胞死亡[20,35],而本研究發(fā)現(xiàn)這兩個因子在成年牦牛大腦皮質(zhì)顯著下調(diào),說明成年牦牛腦組織可能已經(jīng)適應(yīng)了低氧。

4 結(jié) 論

綜上,本研究利用RNA-seq對初生及成年牦牛大腦皮質(zhì)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析,篩選到了13個與大腦皮質(zhì)發(fā)育相關(guān)的候選基因,其中Slit2、SEMA5A、BDNF、Rab3a、FGF18、NGF、PLD1、VEGFA、CaMK2A、TLR1、TLR4在成年牦牛大腦皮質(zhì)顯著上調(diào),可能提示成年牦牛軸突可塑性、突觸傳遞、免疫防御等生理活動更完善,另外與低氧適應(yīng)調(diào)控相關(guān)的HIF1α和HIF2α在成年牦牛顯著下調(diào),可能表明成年牦牛大腦皮質(zhì)對低氧適應(yīng)性更強(qiáng),以上結(jié)果為進(jìn)一步研究高原動物大腦發(fā)育的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。