常攀峰,張 輝,潘陽陽,張莉敏,王斌峰,董雨君

(1. 甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅 平?jīng)?744000;2. 甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心,甘肅 蘭州 730046;3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;4. 甘肅省涇川縣畜牧獸醫(yī)中心,甘肅 涇川 744300;5. 甘肅省莊浪縣畜牧獸醫(yī)中心,甘肅 莊浪 744699)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)亞家族成員中具有多功能的細(xì)胞因子[1]。BMP7作為BMP亞族的核心成分,廣泛分布于動物機(jī)體的各個組織細(xì)胞中,參與多種生理病理代謝[2-4]。在雌性動物的生殖系統(tǒng)中,BMP7不僅維持著卵巢、輸卵管、子宮等正常功能,對HPG軸(下丘腦-垂體-卵巢)也具有一定的調(diào)節(jié)作用[5-7]。在卵巢中,BMP7作為多功能細(xì)胞因子,旁分泌作用于膜細(xì)胞的同時控制著各類顆粒細(xì)胞的發(fā)育,即BMP7作用于PCNA和Caspase3等基因,進(jìn)而調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡[8-9];此外,BMP7還可作用于類固醇類激素的生成和分泌[8],刺激卵泡和黃體的生成。Bahire[10]發(fā)現(xiàn),在生殖力相對較弱的個體和品種的卵巢中存在著大量的BMP7。另外,全基因組亞硫酸氫鹽測序結(jié)果表明,卵巢中BMP7基因的DNA甲基化水平與羊的繁殖能力相關(guān)[11]。在豬中,BMP7是與排卵率和產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的潛在基因[12],據(jù)報道,BMP7基因啟動子中的g.581771886變異與初胎窩仔數(shù)和總窩仔數(shù)有關(guān)[12],且其多態(tài)性影響著動物的生殖性狀[11-12]。

牦牛生活在海拔3 000 m以上的青藏高原,因自身特點能在氣候寒冷多變的惡劣環(huán)境中負(fù)重馳騁而被譽(yù)為“雪山之驕”。該物種是典型的季節(jié)性發(fā)情動物。就雌性牦牛來講,一般2～2.5歲達(dá)到性成熟,夏季發(fā)情,發(fā)情周期約20 d,孕期約260 d,一年產(chǎn)一胎或兩年一胎[13],繁殖力極低。與其他哺乳動物相似,牦牛發(fā)情也嚴(yán)格受神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)。研究表明,發(fā)情期牦牛的FSH、LH和E2等生殖激素血清濃度顯著高于未發(fā)情牦牛,卵泡數(shù)量也更多[13-14]。Chen等[15]通過對發(fā)/乏情期和妊娠期牦牛的卵巢轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)的對比測序發(fā)現(xiàn),BMP15,BHLHE40和SF1IX1等基因[14]是調(diào)控牦牛發(fā)情的關(guān)鍵基因。牦牛卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟與TGF-β1、BMP2等基因有關(guān)。此外,上述轉(zhuǎn)化生長因子基因還廣泛表達(dá)于牦牛的卵巢、子宮、輸卵管等生殖器官[16-17]。然而,就目前研究報道,尚未有BMP7基因在牦牛卵巢、子宮上作用的研究報道。因此,本研究通過提取發(fā)情期牦牛卵巢、子宮組織中蛋白和RNA,對反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板進(jìn)行克隆,并測序。運用NCBI等生物學(xué)網(wǎng)站對測序結(jié)果加以分析。通過qRT-PCR和Western Blot試驗對BMP7的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,探究其在卵巢、子宮中的調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步研究牦牛的生殖生理提供理論參考和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在青海省西寧市大通牦牛養(yǎng)殖基地,選取3頭3～4歲處于發(fā)情期的健康母牦牛。宰后取其子宮、卵巢于生理鹽水中漂洗3次,并去除其周圍的結(jié)締組織和脂肪,無菌手術(shù)剪分離后放置凍存管、液氮內(nèi)保存?；貙嶒炇曳胖?80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 試驗方法

取出凍存的子宮、卵巢組織進(jìn)行無菌研磨,同時加入液氮研磨成粉,分別放置兩個離心管中,用于提取RNA和蛋白。

參照RNA提取試劑盒(ER501-01,全式金,北京)說明書,提取子宮和卵巢的RNA,測定RNA的濃度和OD值。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AH411-02,全式金,北京)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,測定相應(yīng)的OD值,并稀釋濃度至300 mg/mL,凍存至-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

使用全蛋白提取試劑盒(BC3710,索萊寶,北京)提取子宮、卵巢的全蛋白;用BCA蛋白濃度測定試劑盒(PC0020,索萊寶,北京)測定蛋白濃度,凍存至-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 以牦牛BMP7基因(NCBI序列號NW_005392954.1)為參照,使用Primer Premier v5.0軟件(Premier Biosoft, Palo Alto, CA, USA)設(shè)計引物,如表1所示;β-actin為內(nèi)參。所用引物由西安擎科生物有限公司合成。

表1 BMP7基因克隆引物Table 1 The primer of BMP7 gene cloning

1.2.2BMP7基因的克隆 以cDNA為模板,對BMP7基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL:TaqPCR Master Mix 10 μL,ddH2O 7 μL,cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL;擴(kuò)增條件:預(yù)變性95 ℃,5 min;變性95 ℃,30 s;退火溫度如表1所示;72 ℃延伸,10s;35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴(kuò)增的cDNA純化后,送至上海生物工程有限公司測序。

1.2.3 牦牛BMP7基因生物信息學(xué)分析 對牦牛BMP7測序結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)分析,具體分析網(wǎng)站和軟件見表2所示。

表2 生信分析網(wǎng)站Table 2 The website of bio-information

1.2.4 qRT-PCR 熒光定量PCR均在LightCycler 96 R系統(tǒng)(羅氏,巴塞爾,瑞士)上進(jìn)行。GAPDH基因(秦科,中國西安)序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為25 μL,包含0.5 μL cDNA,1 μL上下游引物,12.5 μL SYBR premix EX TaqTM II (2×)(索萊寶,北京)和0.5 μL ROX Reference Dye II (50×)(索萊寶,北京)。qRT-PCR的反應(yīng)條件,即:95 ℃30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 延伸10 s,冷卻40 ℃ 10 s。

1.2.5 Western Blot 將上述2.2提取的全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離;所需的目標(biāo)片段轉(zhuǎn)移至PVDF膜(YA1701,索萊寶,北京),脫脂牛奶(D8340,索萊寶,北京)37℃封閉2 h,一抗BMP7(1∶1000),β-actin(1∶2500,Abcam,USA)4 ℃孵育12 h,TBST洗滌1 h,二抗(兔抗鼠IgG,1∶5000,Abcam,USA)孵育2 h,洗滌1.5 h,ECL檢測,Image J檢測表達(dá)蛋白的灰度值;β-actin為內(nèi)參,所有試驗三次重復(fù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 Image J測定BMP7和β-actin的灰度值,計算二者比值。以GAPDH為內(nèi)參,依據(jù)2-ΔΔCT法計算基因相對表達(dá)量。通過GraphPad Prism 7.0的t-test檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛BMP7基因的克隆

從圖1可見,卵巢、子宮組織在428 bp和102 bp處均有特異性條帶;通過Blast對比發(fā)現(xiàn)。與參考基因(NW_005392954.1)相似性可達(dá)100%,擴(kuò)增基因可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析和載體構(gòu)建等。

圖1 牦牛BMP基因克隆結(jié)果M. Marker;1.卵巢(PCR引物);2.子宮(PCR引物);3.卵巢(qRT-PCR引物);4.子宮(qRT-PCR引物)Fig. 1 The results of cloning BMP gene in yakM. Marker; 1. Ovary (PCR primer); 2.Uterus (PCR primer); 3. Ovary (qRT-PCR primer); 4. Uterus (qRT-PCR primer)

2.2 牦牛BMP7擴(kuò)增基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 牦牛BMP7蛋白理化性質(zhì)分析 本研究中擴(kuò)增出的基因片段為428 bp,編碼142個氨基酸(如圖2所示),化學(xué)式: C718H1101N205O200S8,分子量:16061.37,原子總數(shù):2232個,理論等電位點(pI): 6.70;其中,在142個氨基酸中:Leu (L) 所占比例最大,共計18個,占比12.7%;而沒有Pyl (O)、Sec (U) 和Cys(C)三種氨基酸;帶負(fù)電氨基酸(Asp+Glu)14個,帶正電氨基酸(Arg+Lys)13個;消光系數(shù)(M-1cm-1,在水溶液中在280 nm處測量)為15 470。該蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)(II)計算為64.50,為不穩(wěn)定蛋白。

圖2 擴(kuò)增牦牛BMP7基因和氨基酸序列Fig. 2 The amplification BMP7 gene of yak and translation of amino acid sequence

2.2.2 牦牛BMP7系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 對牦牛BMP7基因和其他物種(人、家鼠、馬、猞猁、豹貓、野駱駝、羊駝、雙峰駝、奶牛、水牛、野山羊、野豬和野犬)進(jìn)行比對,結(jié)果如圖3所示:與人的遺傳距離為(Homosapiens,AAH08584.1)97.18%;家鼠(Musmusculus,ED106610.l)97.16%;馬(Equuscaballus,ADK93983.1)95.07%;猞猁(Lynxcanadensis,XP 030165198.l)97.18%;豹貓(Prionailurusbenga,XP 043409554.1)96.48%;野駱駝(Camelusferus, XP 006186220.2)97.89%;羊駝(Vicugnapacos,XP 006214049.2)97.89%;雙峰駝(Camlelusbactrianus,XP 010956884.1)97.89%;奶牛(Bostaurus,DAA23024.1)98.59%;水牛(Bubalusbubalis,XP 006049070.l 98.59%);野豬(Susscorfa,XP020932979.1)97.89%;野山羊(Caprahirus, XP 017913119.1)98.59%;野犬(Canislupusdingo,XP 030165198.l)97.18%。

圖3 牦牛BMP7基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of BMP7 gene

2.2.3 牦牛BMP7蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過phyre對預(yù)測的蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,如圖4A所示:置信度線評估區(qū)域預(yù)測的可信度,紅色表示高置信度,藍(lán)色為低置信度;其中高度置信區(qū)間有9個;二級結(jié)構(gòu)中,α螺旋最多,共62個,所占比例為54.67%;其次無規(guī)則卷曲40個,占比35.40%;TM螺旋11個,占比9.73%,而無β鏈的結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)特點,利用Swissmodel對BMP7的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果如圖4B所示。

圖4 牦牛BMP7基因的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測A.二級結(jié)構(gòu);B.三級結(jié)構(gòu)Fig. 4 Prediction of the secondary and tertiary structure of BMP protein in yakA. Secondary structure; B.Tertiary structure

2.2.4 牦牛BMP7蛋白親/疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽預(yù)測分析 通過protscale對牦牛BMP7擴(kuò)增片段進(jìn)行蛋白親疏水性分析,以親/疏水得分為縱坐標(biāo),編碼的氨基酸位數(shù)為橫坐標(biāo),結(jié)果如圖5A所示,在142個氨基酸中,第19位氨基酸,親水性值最大,為2.209;第53位氨基酸疏水性最大,為-3.215。牦牛BMP7蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析,結(jié)果如圖5B和5C所示:0～30位氨基酸為信號肽,在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間進(jìn)行信號傳遞;30～142位氨基酸均在細(xì)胞膜外;且0～28位氨基酸是由Sec轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)運,并由信號肽酶 I (Lep) 切割的“標(biāo)準(zhǔn)”分泌信號肽,切割位置是第29位氨基酸。

圖5 牦牛BMP7蛋白親/疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽預(yù)測分析A. 親疏水性;B.跨膜結(jié)構(gòu);C.信號肽預(yù)測Fig. 5 Prediction of BMP7 protein hydrophilicity, transmembrane structure and signal peptide in yakA.Hydrophilicity; B.Transmembrane; C.Signal peptide

2.2.5 牦牛BMP7蛋白磷酸化位點預(yù)測分析 通過NetPhos對牦牛BMP7蛋白磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果如圖6所示。BMP7蛋白磷酸化位點共19個,其中Ser14個,Thr 2個,Tyr 3個。

圖6 牦牛BMP7蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig. 6 Prediction of BMP7 protein phosphorylation site in yak

2.3 發(fā)情期牦牛卵巢和子宮BMP7蛋白表達(dá)量

Western Blot如圖7結(jié)果顯示:BMP7蛋白在卵巢和子宮中均表達(dá),且在卵巢中的表達(dá)水平顯著高于子宮(P<0.05)。

圖7 發(fā)情期牦牛卵巢和子宮BMP7蛋白表達(dá)量檢測A. western blot檢測;B. BMP7相對表達(dá)量Fig. 7 Expression of BMP7 protein in ovary and uterus of yak during estrusA. Western Blot; B.Relative expression of BMP7 protein

2.4 發(fā)情期牦牛卵巢和子宮BMP7 mRNA含量

通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)BMP7 mRNA含量與其蛋白表達(dá)量趨勢一致,即發(fā)情期卵巢中BMP7 mRNA顯著高于子宮(P<0.05)(如圖8所示)。

圖8 BMP7 mRNA的相對表達(dá)量Fig. 8 The relative expression of BMP7 mRNA

3 討 論

本研究成功克隆了牦牛BMP7基因,其片段大小為428 bp,與參考基因(NW_005392954.1)相似性可達(dá)100%。在NW_005392954.1給出的BMP7基因中,CDS區(qū)僅有22～439,32911～33103,57015～57163,75269～75466,80804～80880,82732～82842,84561～847107段。其中22～439 bp所涉及基因片段最長。因此,本研究以此段基因為靶點進(jìn)行擴(kuò)增,通過翻譯預(yù)測,得到了142個氨基酸序列。通過親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽分析可知0～30號氨基酸是該結(jié)構(gòu)蛋白中的信號肽,且0～28位氨基酸是由Sec轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)運,并由信號肽酶 I (Lep) 切割的“標(biāo)準(zhǔn)”分泌信號肽,切割位點為第29～30位氨基酸。表明BMP7是標(biāo)準(zhǔn)的分泌蛋白,具有多細(xì)胞因子的作用[20]。與已知物種的BMP7對比發(fā)現(xiàn),該基因具有較高的保守性,序列相似性均>95%,其中與反芻動物的同源性更高,說明該基因在動物體內(nèi)具有相似的生理功能[21-22]。值得注意的是,相較于其他物種的氨基酸序列,牦牛BMP7第140位氨基酸均為纈氨酸(Val),而其他物種的是甘氨酸(Gly)。除此氨基酸外,其他序列與奶牛、水牛的相似性可達(dá)100%。

BMP7是BMP/SMAD信號通路的重要配體[9,11],是影響動物繁殖能力的潛在因素。本研究通過BMP7在發(fā)情期牦牛的卵巢和子宮的高表達(dá)發(fā)現(xiàn)該基因也影響著牦牛的繁殖性能。研究表明,BMP7不僅高度表達(dá)于卵巢內(nèi)的各種細(xì)胞,如顆粒細(xì)胞(GCs)和卵泡膜細(xì)胞(TCs),還對生殖激素具有一定的作用。張文靜等[24]發(fā)現(xiàn),BMP7(-/-)可抑制牛卵巢TCs分泌睪酮等雄激素,而BMP7(+/+)則可使水牛卵巢GCs[9]釋放E2等激素,抑制黃體細(xì)胞(CL)[23]釋放孕酮(P4)。BMP7還可促進(jìn)GCs存活和增殖[9,24]。Lee等[25]將BMP7注射至大鼠卵巢中發(fā)現(xiàn)各個時期的卵泡數(shù)量均有增加,而排卵率和血清P4濃度均有降低[25],說明BMP7可刺激卵泡的發(fā)育和成熟。此外,大量文獻(xiàn)證明卵巢BMP7水平和BMP7多態(tài)性與家畜的生育能力有密切的關(guān)系[26-27]。在綿羊中,高繁殖力母羊[28]的卵泡中FecB-BMP7蛋白顯著高于其他母羊;豬BMP7基因3'-UTR多態(tài)性直接影響了母豬的產(chǎn)仔性能[12]。本研究通過BMP7在發(fā)情期牦牛卵巢、子宮的mRNA和蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),BMP7在卵巢表達(dá)量顯著高于子宮(P<0.05),與es-BMP7最高表達(dá)于中華絨螯蟹睪丸組織相似[29],這可能是由于BMPs在生殖干細(xì)胞(GSCs)更新和維持卵子發(fā)生中具有重要作用。卵巢作為雌性生殖系統(tǒng)的核心器官,BMP7不僅參與了成熟卵子形成,還對卵母細(xì)胞成功受精具有一定的調(diào)控作用[30]。此外,BMP7在水牛妊娠期,可通過旁分泌作用胎盤血管的生成,刺激胎盤雌激素的產(chǎn)生[30]。綜上,推測BMP7對牦牛繁殖生理具有重要作用,可作為一個新的研究方向,探究其相關(guān)功能作用。

4 結(jié) 論

本研究表明,牦牛BMP7基因及蛋白序列與奶牛、水牛、野山羊等家畜同源性最高,親緣關(guān)系最近;牦牛BMP7蛋白屬于信號肽,具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能;牦牛BMP7蛋白可能促進(jìn)卵泡等細(xì)胞的發(fā)育,對牦牛的生殖生理具有一定的作用。