童家赟， 黃滿霖， 魏汝芯， 詹若挺，2

[1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州中醫(yī)藥大學(xué)），廣東廣州 510006]

中藥海金沙來(lái)源于蕨類植物海金沙科海金沙屬草本植物[，Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.]的干燥成熟孢子，具有清熱利濕、通淋止痛的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，海金沙提取物能夠促進(jìn)輸尿管的蠕動(dòng)，增加輸尿管上段壓力，從而有利于結(jié)石排出；還能降低腎臟中草酸和鈣離子含量，增加排尿量，抑制草酸鈣晶體從亞穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)態(tài)晶體，從而降低結(jié)石形成風(fēng)險(xiǎn)[2-6]。海金沙藥材為臨床常用中成藥尿石通丸、復(fù)方石淋通片、腎石通顆粒、三金排石湯、排石顆粒等的重要原料。其中尿石通丸、復(fù)方石淋通片是治療尿路結(jié)石的常用藥，為國(guó)家二級(jí)中藥保護(hù)品種，已列入基本藥物目錄[7]。據(jù)了解，僅東莞市亞洲制藥科技有限公司對(duì)海金沙孢子粉的年需求量就超過(guò)50 噸。然而，海金沙原植物常散生于自然環(huán)境中，一直以來(lái)只能通過(guò)人工采收，藥材采收效率極低。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人工成本的提高，藥農(nóng)采收野生海金沙藥材的積極性急劇降低，供不應(yīng)求導(dǎo)致近年來(lái)該藥材的價(jià)格較快上漲，相關(guān)中成藥的生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重制約。此外，同屬植物曲軸海 金 沙（L. flexuosum）和 小 葉 海 金 沙（L.microphyllum）與海金沙形態(tài)非常相似，地理分布亦有重疊，常有誤采和混用現(xiàn)象[8]。因此，海金沙這種較大宗的野生來(lái)源藥材的生產(chǎn)，急需開展集約化和規(guī)?；N植來(lái)保證產(chǎn)量和臨床用藥的質(zhì)量。以下對(duì)海金沙繁育和植物生長(zhǎng)條件相關(guān)的研究概況進(jìn)行綜述，以期在前人研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化其繁育方法和條件，為最終解決其藥材生產(chǎn)問題提供參考。

1 海金沙的繁殖特性及繁殖機(jī)制研究概況

1. 1 海金沙世代生活史中的組織形態(tài)的發(fā)生發(fā)育相較于種子植物從種子萌發(fā)到幼苗形成的速度，蕨類植物的幼苗形成則較緩慢和復(fù)雜。蕨類植物具有明顯的有性世代的配子體（單倍體）和無(wú)性世代的孢子體（二倍體）交替現(xiàn)象。早在1991年，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)海金沙（Lygodium japonicum）從孢子萌發(fā)到長(zhǎng)成幼孢子體苗的全過(guò)程進(jìn)行了較為仔細(xì)的觀察，研究表明整個(gè)過(guò)程總共約需半年時(shí)間[9]。海金沙孢子經(jīng)無(wú)菌播種6 d 后萌發(fā)，形成絲狀體，接著長(zhǎng)成心形的配子體，播種后約30 ～35 d 生成精子器，接著生成頸卵器；成熟的配子體授精后約半個(gè)月長(zhǎng)成幼孢子體，再經(jīng)過(guò)4個(gè)月可以長(zhǎng)成具3片葉的幼苗[9]。之后，日本的高橋尚子（Takahashi N）等[10]采用生物顯微鏡和金相顯微鏡觀察了海金沙孢子經(jīng)萌發(fā)后形成頂端細(xì)胞分生組織（apical-cellbased meristem）和多細(xì)胞分生組織（multicellular meristem）兩種分生組織，以及細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列平周和垂周分裂后而形成心形配子體的全過(guò)程。劉朝輝等[11]采用透射電鏡觀察了海金沙的精子細(xì)胞發(fā)育過(guò)程，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)發(fā)育與薄囊蕨亞綱的其他植物相似。郭嚴(yán)冬、Cao J G 等[12-13]采用樹脂包埋切片、透射電鏡和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察了海金沙配子體發(fā)育生成頸卵器和卵細(xì)胞的過(guò)程。邵文等[14]采用石蠟切片觀察了海金沙頸卵器中卵子受精后產(chǎn)生合子、合子進(jìn)行細(xì)胞分裂形成四分體、最后形成基足細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)器官（第一和第二葉）的整個(gè)過(guò)程。由以上研究可知，目前海金沙從孢子萌發(fā)到長(zhǎng)成幼孢子體的組織形態(tài)發(fā)生全過(guò)程已經(jīng)比較清楚，其示意圖見圖1。

圖1 海金沙生活史示意圖Figure 1 Schematic diagram of the life history of， Lygodium japonicum

1.2 海金沙配子體性別決定機(jī)制

1. 2. 1 遺傳因素和內(nèi)在激素調(diào)控雌雄配子體的生成 早在1960 年，Ulrich N[15]就證實(shí)了在無(wú)菌培養(yǎng)過(guò)程中，海金沙的成熟配子體提取物添加入培養(yǎng)基后能誘導(dǎo)其他年幼配子體提前產(chǎn)生精子器。1975 年，竹野清?。═akeno K）等[16-17]發(fā)現(xiàn)外源的赤霉素類（gibberellins，GAs）可誘導(dǎo)海金沙配子體的精子器形成；赤霉素類的活性強(qiáng)度由大到小排列為GA7＞GA4＞GA9＞GA3＞GA5＞GA1＞GA8；隨 后發(fā)現(xiàn)外源的赤霉素類會(huì)抑制頸卵器的生成，活性強(qiáng) 度 由 大 到 小 排 列 為GA4= GA9＞GA7＞GA3＞GA1=GA5=GA8。1979 年，竹野清俊等[18-19]驗(yàn)證了海金沙配子體提取物也會(huì)抑制頸卵器的分化；隨后在原葉體培養(yǎng)基中加入外源的成精子囊素（antheridiogen）如GA9等，發(fā)現(xiàn)GA9的抑制效應(yīng)與配子體提取物相當(dāng)，認(rèn)為其機(jī)制可能與由GA9轉(zhuǎn)化生成的GA9-甲酯發(fā)揮的效應(yīng)有關(guān)；但是其控制配子體在不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生性別分化的機(jī)制尚不明確。

竹野清俊等[20]基于以上研究之后，通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察提出了海金沙配子體性別分化時(shí)間序列模型：當(dāng)居群內(nèi)的原葉體（配子體）處于不同的發(fā)育階段時(shí)，最先達(dá)到1.5 mm 寬的原葉體形成頸卵器，這時(shí)只發(fā)育形成單性的雌性配子體。然后，原葉體開始生成控制生殖器官形成的天然物質(zhì)；但這些物質(zhì)并不影響那些較大的正在分化頸卵器的單性的雌性原葉體。而居群內(nèi)發(fā)育遲緩的原葉體對(duì)這些大的原葉體分泌的物質(zhì)非常敏感，使得頸卵器的形成受到抑制，從而產(chǎn)生精子器，也就是使這些更小的原葉體發(fā)育形成單性的雄性配子體。最終，雌性原葉體可以在不受外源成精子囊素的影響下產(chǎn)生精子器，從而產(chǎn)生雙性配子體。

2014 年，日本的田中君木（Tanaka J）等[21]克隆了海金沙赤霉素合成途徑中相關(guān)基因并作表達(dá)模式分析，并通過(guò)蛋白雙雜交和免疫印跡等一系列試驗(yàn)，闡明了蕨類植物赤霉素合成途徑及其信號(hào)傳導(dǎo)的時(shí)空分離是決定配子體性別的重要分子機(jī)制。田中君木等認(rèn)為，首先，早熟的配子體生成GA9，然后被甲酯化成GA9-甲酯， GA9-甲酯被分泌到環(huán)境中，從而被鄰近的晚熟配子體（絲狀體階段）攝取；GA9-甲酯被攝取之后，在晚熟的配子體細(xì)胞內(nèi)被脫甲酯重新生成GA9，之后GA9被GA3氧化酶（GA3ox）催化生成GA4，接著具有生物活性的GA4通過(guò)GA4→GID→DELLA 通路觸發(fā)了配子體上精子器的生成，但抑制了頸卵器的發(fā)生。

1.2.2 環(huán)境因素影響雌雄配子體的生成 蕨類植物的性別分化除了受到自身遺傳因素和內(nèi)在激素調(diào)控外，也受到培養(yǎng)密度、營(yíng)養(yǎng)條件、光照等環(huán)境因素的影響[22]。高曉雯等[23]的研究表明，水分對(duì)配子體形態(tài)發(fā)育的影響也較大。隨著水分的增加，海金沙孢子的萌發(fā)速率加快，絲狀體的長(zhǎng)度增加。在水分不足條件下，配子體易發(fā)育成雄性配子體，而在水分充足條件下，配子體易發(fā)育成兩性配子體或雌性配子體。次生假根的長(zhǎng)度也可隨著水分的增加而增加。但是該研究未對(duì)培養(yǎng)過(guò)程的基質(zhì)加水量進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)量。后續(xù)研究需要參照該報(bào)道的方法進(jìn)一步確定有利于分化生成兩性配子體或適當(dāng)比例的單性配子體及有利于授精產(chǎn)生合子的最適合水分量。

2 海金沙的育苗影響因素研究概況

2.1 影響孢子萌發(fā)因素的研究蕨類植物孢子萌發(fā)除了受到自身遺傳因素和內(nèi)在激素調(diào)控外，也受到培養(yǎng)密度、營(yíng)養(yǎng)條件、溫度、光照等環(huán)境因素的影響[24-25]。如紫萁（Osmunda japonica）孢子播種密度在100 ～3 000 個(gè)/cm2的區(qū)間時(shí)，隨著密度的升高，孢子的萌發(fā)率越高，密度為3 000 個(gè)/cm2時(shí)的萌發(fā)率可達(dá)95.4%；而當(dāng)密度達(dá)到5 000 個(gè)/cm2時(shí)，其萌發(fā)率反而降低[26]。目前，海金沙播種密度試驗(yàn)未見相關(guān)報(bào)道。無(wú)機(jī)鹽方面，郭治友等[27]的研究認(rèn)為，低鹽的Knop’s培養(yǎng)基和全量（高鹽）的MS培養(yǎng)基對(duì)海金沙孢子萌發(fā)影響不顯著。但也有研究顯示，Knop’s 培養(yǎng)基、1/8 的MS 培養(yǎng)基和1/4 的MS培養(yǎng)基上的孢子萌發(fā)率較MS培養(yǎng)基更高[28]。兩篇報(bào)道互相矛盾，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

有研究認(rèn)為，冷凍保存可顯著降低小葉海金沙（L.microphyllum）孢子萌發(fā)率，但是對(duì)海金沙孢子萌發(fā)無(wú)顯著影響[29]。海金沙孢子在低溫條件下保存多長(zhǎng)時(shí)間后而不會(huì)顯著降低萌發(fā)率，這也是值得探討的問題。

2.2 雌雄配子體交配和幼孢子體生成的研究竹野清?。═akeno K）等[30]開展的分離雙性配子體并與單性配子體進(jìn)行交配的試驗(yàn)顯示，只有約30%的雌性配子體生成幼孢子體，而單個(gè)的雙性配子體未能形成幼孢子體；并認(rèn)為該結(jié)果可能是由配子體內(nèi)自交產(chǎn)生的純合子不能發(fā)育導(dǎo)致的。但是，Lott M S 等[31]通過(guò)研究認(rèn)為，海金沙孢子萌發(fā)后，成熟配子體主要是雌雄同體型，同一配子體內(nèi)自交高于90%。以上二者的研究結(jié)論相去甚遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步證實(shí)。

Sakaushi S 等[32]在高速視頻顯微鏡、透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察發(fā)現(xiàn)，海金沙精子的鞭毛朝向同一方向，并且只能朝前方游動(dòng)，即使遇到障礙物也不會(huì)向后游動(dòng)；并認(rèn)為這個(gè)特點(diǎn)可能會(huì)影響雌雄配子體的授精。到底有多少個(gè)孢子形成配子體后能成功授精成為合子并生成幼孢子體，其最適合的環(huán)境因素有哪些，目前未見相關(guān)的報(bào)道。

2.3 幼苗繁育（植株再生）研究海金沙可采用分株繁殖的方式，操作上比較簡(jiǎn)單[33]，但分株繁殖方式的繁殖系數(shù)較低，滿足不了規(guī)模化種植對(duì)大量種苗的需求，而通過(guò)孢子萌發(fā)有可能實(shí)現(xiàn)種苗的大規(guī)模生產(chǎn)。由于蕨類植物生活史（世代交替史）的復(fù)雜性，要通過(guò)孢子萌發(fā)途徑進(jìn)行海金沙的繁殖和植株再生，相較一般的種子植物步驟更繁瑣，要解決的問題也更多。目前僅見Maeda M等[34-35]對(duì)海金沙幼孢子體葉片提取的原生質(zhì)體進(jìn)行了植株再生的初步研究；郭治友等[27]采用Knop’s 培養(yǎng)基、MS 培養(yǎng)基等進(jìn)行了孢子無(wú)菌萌發(fā)和植株再生的初步研究；另有將海金沙孢子播于泥炭土上進(jìn)行萌發(fā)和育苗的專利報(bào)道[36]。有關(guān)海金沙孢子萌發(fā)育苗方面的研究報(bào)道非常少，迄今也未見采用海金沙幼芽或嫩葉進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)擴(kuò)繁的研究。

3 海金沙植株生長(zhǎng)習(xí)性研究現(xiàn)狀

目前，對(duì)海金沙進(jìn)行規(guī)模化和集約化種植的研究尚未見報(bào)道，以下只是針對(duì)野生或少量盆栽植株生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。

3. 1 光照對(duì)海金沙植株生長(zhǎng)的影響一般認(rèn)為，蕨類植物大多是陰生植物，海金沙野生植株也常生長(zhǎng)在樹林下有遮蔭的環(huán)境中。張澤宏等[37]觀察了海金沙等5 種蕨類植物葉片解剖結(jié)構(gòu)，根據(jù)葉片薄、沒有海綿組織和柵欄組織的分化、氣室大等特征，認(rèn)為這些是蕨類適應(yīng)陰生環(huán)境的特征。但目前海金沙植株生長(zhǎng)最適合的光照強(qiáng)度或遮蔽度并未見報(bào)道。

3.2 溫度與濕度對(duì)海金沙生長(zhǎng)發(fā)育的影響溫度與濕度對(duì)海金沙植株的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)產(chǎn)生一定的影響，冬季低溫和干旱條件下可出現(xiàn)植株枯萎或枯葉[38]；對(duì)普通溫室內(nèi)培養(yǎng)的11 種蕨類植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行為期一年半的觀察，只有海金沙和鹿角蕨（Platycerium wallichii）兩種植物未生成孢子，推測(cè)可能是由于溫度與濕度不適合所致[38]。另有學(xué)者觀察發(fā)現(xiàn)，低海拔氣候溫暖地區(qū)的海金沙植株能正常產(chǎn)生孢子，而在高海拔冷涼地區(qū)則不能[39]。有研究表明，近緣物種小葉海金沙（L.microphyllum）在較高溫度環(huán)境中的群落長(zhǎng)勢(shì)明顯較好；室內(nèi)模擬環(huán)境下溫度與其光合速率呈顯著正相關(guān)[40]。但適合海金沙植株生長(zhǎng)的溫度和水分條件范圍至今尚不清楚。

3.3 海金沙的病蟲害值得注意的是，海金沙和小葉海金沙在美國(guó)東南部的佛羅里達(dá)州和澳大利亞等地被認(rèn)為是嚴(yán)重影響生態(tài)的入侵植物，多位學(xué)者從生物防治的角度研究了真菌感染和飛蛾對(duì)海金沙生長(zhǎng)的影響。如Rayachhetry M B 等[41-43]學(xué)者從染病植株上分離病菌后重新感染植株，發(fā)現(xiàn)假柄銹菌（Puccinia lygodii）或者二級(jí)霉（Bipolaris sacchari）感染可致海金沙和小葉海金沙葉片壞死。有學(xué)者通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，炭疽病菌（Glomerella cingulata）感染可使海金沙和小葉海金沙頂梢枯死，小羽葉邊緣褐變和萎蔫[44-45]。此外，還發(fā)現(xiàn)鱗翅目（Lepidoptera）草螟科（Crambidae）的兩種飛蛾，Neomusotima conspurcatalis和，Austromusotima camptozonale特 異 性地產(chǎn)卵在海金沙和小葉海金沙的植株上，且其幼蟲啃食能有效控制宿主植物的生長(zhǎng)[46-47]。在未來(lái)規(guī)?；N植生產(chǎn)過(guò)程中，以上真菌和飛蛾的防治應(yīng)當(dāng)引起重視。

4 小結(jié)和展望

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于蕨類植物的繁殖特性及繁殖技術(shù)研究主要集中于巢蕨等觀賞或?yàn)l危蕨類植物[48-50]，藥用蕨類植物相關(guān)研究則很少。海金沙從孢子萌發(fā)到生成配子體，再長(zhǎng)成幼孢子體的全過(guò)程，其組織形態(tài)發(fā)生業(yè)已清楚；配子體性別決定機(jī)制的遺傳因素和內(nèi)在激素調(diào)控也得到了闡明。但是，適合孢子萌發(fā)、配子體授精等繁殖過(guò)程中的環(huán)境因素有待進(jìn)一步優(yōu)化；迄今未見規(guī)?；挠绾鸵?guī)范化種植技術(shù)研究。

目前，至少還有以下問題需要進(jìn)一步探討：①篩選最適合海金沙孢子萌發(fā)的條件，包括培養(yǎng)密度、營(yíng)養(yǎng)量（包括無(wú)機(jī)鹽、蔗糖等）、溫度及光照等。②篩選適合孢子貯藏且有利于其在一段時(shí)間內(nèi)保持活力的溫度與濕度條件。③篩選孢子形成配子體及授精成為合子，并生成幼孢子的最適合環(huán)境條件，如影響配子體授精的溫度、水分、培養(yǎng)密度、光照等。④研究建立外殖體（幼芽或嫩葉）進(jìn)行無(wú)性繁殖的離體快繁體系。⑤進(jìn)行栽培技術(shù)研究：如探究適合植株生長(zhǎng)和孢子囊生成的光照、水肥、溫度等條件；研究田間管理方式，如搭設(shè)支架等對(duì)植株生長(zhǎng)和孢子囊生成的影響；探究適宜的采收期。建議今后應(yīng)通過(guò)對(duì)上述影響海金沙育苗和栽培的關(guān)鍵技術(shù)條件進(jìn)行系統(tǒng)的研究、探索和優(yōu)化，為海金沙藥材生產(chǎn)提供技術(shù)支撐，以維持其藥材的可持續(xù)發(fā)展及保障有關(guān)中成藥原料的供應(yīng)。

（我校中藥學(xué)院藥用植物教研室教師彭光天博士和童毅博士對(duì)本文進(jìn)行了審閱并提出意見和建議，特此致謝?。?/p>