黃寶純 韓雪 王雷 劉宇凡 楊光勇 何光志

傳統(tǒng)啤酒是以小麥為原料經(jīng)發(fā)酵制作而成，營養(yǎng)豐富，深受大眾喜愛。隨著人們生活水平和保健意識的逐漸提高，各種加入了食藥物質(zhì)或中藥材提取物的保健型啤酒應(yīng)運而生，豐富了人們的選擇。

刺梨（Rosa Roxburghii Tratt.）被收錄于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版），是貴州省特色資源植物。刺梨作為藥食兩用植物，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，被譽(yù)為“水果之王”，富含維生素C和黃酮，超氧化物歧化酶（SOD）含量更是居所有水果之首。本研究以刺梨果提取物制備了一款刺梨啤酒，并采用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）方法分析其成分，以促進(jìn)刺梨產(chǎn)品的開發(fā)，豐富啤酒種類。

一、材料與儀器

1.主要材料。淡色小麥（德國），啤酒干酵母（煙臺曼森商貿(mào)有限公司），啤酒花（Hop Breeding Company），刺梨（貴州省黔南州）。

2.主要儀器設(shè)備。糖化鍋（WS-38，廣州偉納斯不銹鋼實業(yè)公司），發(fā)酵罐（35L，煙臺帝伯仕自釀有限公司），糖度計（1.0-1.1，煙臺帝伯仕自釀有限公司），高壓滅菌鍋（YA28X6T，寧波甬安醫(yī)療器械制造公司），離心機(jī)（Sorvall Legend Micro 21R，美國Thermo Fisher公司），生化培養(yǎng)箱（LRH-150-II，廣東醫(yī)療器械廠），電子分析天平（EL104，梅特勒-托列多儀器有限公司），電磁爐（WLK-T1，廣東半球?qū)崢I(yè)集團(tuán)公司），恒溫水浴鍋（HH-42 （0），蘇州威爾實驗用品有限公司），離心管（50mL，無錫耐思生物科技有限公司），pH試紙（1-14，杭州富陽特種紙業(yè)有限公司），冷凍離心機(jī)（H2050-R，湘儀），混勻儀（QL-86，其林貝爾），真空濃縮儀（5305，Eppendorf），濾膜（0.22pm PTFE，津騰），液相色譜儀（ultimate 3000，Thermo），質(zhì)譜儀（QExactive Focus，Thermo）。

二、實驗與方法

1.發(fā)酵液制備與前發(fā)酵。篩選后的小麥用濕法粉碎，與適量熱水（37℃為宜）一起加入糖化鍋中蛋白化30min，持續(xù)蛋白化升溫至65℃使淀粉糖化，時間控制在1h，升溫至78℃后保持10min結(jié)束糖化。將所得麥汁進(jìn)行過濾后，放入糖化桶中煮沸1h。第1次加入啤酒花總量的1/10，30min后加入啤酒花總量的1/5，沸騰50min后放入剩余啤酒花。煮沸結(jié)束后用冷卻管冷卻麥汁，使麥汁溫度降到20℃為最佳。

稱取適量刺梨干粉，加入10倍量68℃左右溫水浸泡15min以上，濾得刺梨汁，重復(fù)2次，將3次過濾所得刺梨汁匯總備用。干酵母用10倍量的20℃熱水進(jìn)行活化備用。先將刺梨汁和麥汁按0.08：1的比例放入發(fā)酵瓶中，邊攪拌邊添加活化好的酵母，充分混勻后保持通氧5min左右，蓋好發(fā)酵瓶。將發(fā)酵瓶放入生化培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為16℃，進(jìn)行前發(fā)酵，發(fā)酵時間為7-14d。

2.后發(fā)酵。將前發(fā)酵好的啤酒進(jìn)行離心，所得上清液裝入已消毒的空啤酒瓶中，封瓶后再次消毒，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行后發(fā)酵，發(fā)酵溫度為16℃，發(fā)酵時間為10-15d，最終得到成品刺梨啤酒。

3.理化指標(biāo)及感官檢測。理化指標(biāo)采用糖度計檢測原麥汁濃度、成品啤酒酒精度，pH試紙檢測酸堿度。感官檢測則采用人工品嘗方法，邀請20名學(xué)生，通過肉眼對啤酒外觀及泡沫性能進(jìn)行檢測，并品嘗啤酒的香氣和口味。

4.刺梨啤酒成分的檢測。刺梨啤酒成分檢測采用LC-MS聯(lián)用方法。（1）準(zhǔn)備檢測樣本。4℃條件下解凍實驗樣本，解凍后渦旋1min充分混勻。取樣本100?L于2mL離心管中，濃縮干燥后加入400?L甲醇溶液（-20℃保存），振蕩1min，混勻。在12000rpm、4℃下離心10min，取全部上清液至新的離心管中，真空濃縮干燥。加入150?L 80%甲醇溶液配置的2-氯-L-苯丙氨酸（4ppm）溶液（-20℃保存）復(fù)溶樣品，取上清液用0.22?m膜過濾，過濾液加入檢測瓶中，用于檢測。每個待測樣本各取20?L混合成QC樣本。

（2）上機(jī)檢測。①色譜條件。Thermo Vanquish（Thermo Fisher Scientific，USA）超高效液相系統(tǒng)，使用色譜柱為ACQUITY UPLC? HSS T3（2.1×150mm，1.8?m）（Waters，Milford，MA，USA），調(diào)節(jié)到0.25mL/min的流速、40℃的柱溫，進(jìn)樣量取2μL。正離子模式下，流動相為0.1%甲酸乙腈（C）和0.1%甲酸水（D），梯度洗脫程序為：0-1min，2%C；1-9min，2%-50%C；9-12min，50%-98%C；12-13.5min，98%C；13.5-14min，98%-2%C；14-20min，2%C。負(fù)離子模式下，流動相為乙腈（A）和5mM甲酸銨水（B），梯度洗脫程序為：0-1min，2%A；1-9min，2%-50%A；9-12min，50%-98%A；12-13.5min，98%A；13.5-14min，98%-2%A；14-17min，2%A。

②質(zhì)譜條件。Thermo Q Exactive Focus質(zhì)譜檢測器（Thermo Fisher Scientific，USA），電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子模式分別采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓3.50kV、負(fù)離子噴霧電壓-2.50kV，鞘氣30arb、輔助氣10arb。毛細(xì)管溫度325℃，以分辨率70000進(jìn)行一級全掃描，一級離子掃描范圍m/z 81-1000，并采用HCD進(jìn)行二級裂解，碰撞電壓30%、二級分辨率17500，采集信號前3離子進(jìn)行碎裂，同時采用動態(tài)排除法去除無必要的MS/MS信息。

（3）數(shù)據(jù)處理。通過Proteowizard軟件將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXmL格式（xcms輸入文件格式），再利用R的XCMS程序包進(jìn)行峰識別、峰過濾和峰對齊，得到包括質(zhì)荷比（m/z）、保留時間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣。正離子模式獲得15451個前體分子，負(fù)離子模式獲得11559個前體分子，導(dǎo)出數(shù)據(jù)至Excel進(jìn)行后續(xù)的分析。

三、結(jié)果與分析

1.麥芽汁制備與前發(fā)酵。糖化后的麥芽汁呈淡黃色，原麥芽汁濃度為11op，前發(fā)酵中，第1天開始出現(xiàn)少量泡沫，至第3天后達(dá)最大量，持續(xù)8d左右，發(fā)酵2周后稍變澄清。離心后得到澄清的淡黃色啤酒液，見圖1。

圖1：刺梨啤酒前發(fā)酵

2.后發(fā)酵。后發(fā)酵14d，輕晃啤酒有少許起泡，已達(dá)啤酒起泡要求，見圖2。

圖2：刺梨啤酒后發(fā)酵

3.理化指標(biāo)及感官檢測。經(jīng)檢測，刺梨啤酒原麥汁濃度為11op，酒精度為3.3% Vol，pH為5-6。感官品評得分見表1。

4.刺梨啤酒成分檢測。通過LC-MS方法鑒定出刺梨啤酒中含有543種代謝成分，部分鑒定成分見表2。

四、結(jié)論與討論

現(xiàn)代藥理研究表明，刺梨具有抗氧化、降脂、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)免疫、抗癌防癌、排毒、抗衰老、防治糖尿病、保護(hù)胃黏膜等作用。經(jīng)LC-MS方法檢測出刺梨啤酒中含有維生素C、槲皮素和山柰素等成分。維生素C是人體必需的水溶性維生素，可提高免疫功能、清除活性自由基、預(yù)防癌癥、改善脂代謝、緩解因PM2.5造成的肺部炎性損傷。槲皮素是一種類黃酮化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用。山柰素是一種最先從姜科植物山柰中分離得到的黃酮醇類化合物，山柰酚及其糖基化衍生物已被證明具有保護(hù)心臟和神經(jīng)、抗炎、抗糖尿病、抗氧化、抗菌等作用，并具有抗癌活性。

將刺梨汁與麥芽汁發(fā)酵制成低酒精度的刺梨啤酒，是對刺梨進(jìn)行深加工的一種新嘗試，可以豐富刺梨的用途，提升其價值。

本研究制備的刺梨啤酒是在傳統(tǒng)啤酒發(fā)酵的基礎(chǔ)上添加刺梨提取物，使其具有刺梨發(fā)酵風(fēng)味和發(fā)酵產(chǎn)物，同時也具有一定的保健功效。經(jīng)反復(fù)試驗，得出該款啤酒的最佳工藝為：刺梨提取液8%、干酵母0.1%、啤酒花1%，經(jīng)14℃-16℃前發(fā)酵7d，后發(fā)酵10d得到刺梨啤酒成品，泡沫細(xì)膩，掛杯持續(xù)3-4min，香氣輕微，殺口力強(qiáng)，具有獨特的刺梨風(fēng)味，感官要求及理化指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

基金項目：2020年貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥食兩用類中藥啤酒研究中心。

作者簡介：黃寶純（1999-），男，大學(xué)本科，研究方向為制藥工程。

*通信作者：何光志（1977-），男，教授、碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合。