張倩

龜甲可作為保健食品原料使用，龜甲提取物也已成為天然保健品市場上的重要原料。本實(shí)驗(yàn)以龜甲提取物為研究對象，通過小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)探究龜甲提取物的安全性，為龜甲原料的開發(fā)和利用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.主要材料。樣品龜甲提取物是以水為溶劑提取制得的，成人（體重60kg）推薦劑量為1.0g/天，1.0g提取物相當(dāng)于10g龜甲原料。

2.實(shí)驗(yàn)動物。SPF級昆明種小鼠、SD大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，雌雄分籠飼養(yǎng)于溫度為20℃-24℃、濕度為40%-70%RH的SPF級實(shí)驗(yàn)室。

3.實(shí)驗(yàn)方法。參照GB 15193.1《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品安全性毒理學(xué)評價(jià)程序》、GB 15193.3《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》、GB 15193.13《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)》規(guī)定的方法，進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)及90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)。

（1）急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。取20只SPF級昆明種小鼠，試驗(yàn)開始前禁食5h，自由飲水。按照限量法，設(shè)置龜甲提取物灌胃劑量為15.0g/kg·bw，將龜甲提取物用水做溶劑配置成濃度為0.25g/mL的受試液，以20mL/kg灌胃容量灌胃三次，連續(xù)灌胃小鼠14天，觀察動物一般情況，記錄生存狀態(tài)及是否出現(xiàn)中毒表現(xiàn)、死亡情況等。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每只小鼠均處死大體解剖后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，并記錄觀察結(jié)果。

（2）90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)。取120只SPF級SD大鼠，實(shí)驗(yàn)設(shè)置龜甲提取物高、中、低（5.00g/kg·bw、3.33g/kg·bw、1.67g/kg·bw）三個劑量組，分別相當(dāng)于成人推薦劑量的300、200、100倍。另設(shè)陰性對照組，每組20只，雌雄各半。陰性對照組和高劑量組均設(shè)實(shí)驗(yàn)中期及實(shí)驗(yàn)恢復(fù)期衛(wèi)星組，每組10只，雌雄各半。采用灌胃給予的方式，灌胃體積為10mL/kg，各劑量組灌胃給予相應(yīng)受試物，陰性對照組、陰性對照衛(wèi)星組灌胃等體積蒸餾水，高劑量衛(wèi)星組給予5.00g/kg·bw劑量受試物。實(shí)驗(yàn)大鼠單籠飼養(yǎng)，不干涉進(jìn)食、飲水，連續(xù)灌胃90天，恢復(fù)期衛(wèi)星組繼續(xù)灌胃28天。在實(shí)驗(yàn)期間，每日觀察并詳細(xì)記錄大鼠生長情況，每周稱重，記錄攝食量，以此計(jì)算大鼠食物利用率。在實(shí)驗(yàn)前期及實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，對龜甲提取物高劑量組、陰性對照組進(jìn)行眼部檢查；在實(shí)驗(yàn)中期，取衛(wèi)星組大鼠進(jìn)行尿常規(guī)檢測，夜間禁食，采血進(jìn)行血液學(xué)和血液生化指標(biāo)檢測；進(jìn)入實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诩盎謴?fù)期，陰性對照組、各劑量組、恢復(fù)期衛(wèi)星組大鼠均進(jìn)行尿常規(guī)檢測、血液學(xué)和血液生化檢查，大鼠解剖后觀察各臟器的大體改變，摘取心、肝等臟器進(jìn)行稱重，計(jì)算臟/體比，取臟器、腺體并固定、切片后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

二、結(jié)果與分析

1.急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。以經(jīng)口灌胃劑量為15.0g/kg·bw的龜甲提取物，雌雄小鼠灌胃后未見明顯中毒癥狀，全部小鼠無一例死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠大體解剖結(jié)果未見任何異常，LD50>15.0g/kg·bw。根據(jù)GB 15193.3《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》中急性毒性（LD50）劑量分級，屬實(shí)際無毒級。

2.90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)。（1）龜甲提取物對大鼠體重、進(jìn)食量、食物利用率的影響。在90天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)期間及28天恢復(fù)期間，各劑量組大鼠生長情況正常，未見異樣，均未出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動物無死亡。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，龜甲提取物各劑量組雌雄大鼠體重、進(jìn)食量、食物利用率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說明龜甲提取物各劑量對雌雄大鼠體重、進(jìn)食量、食物利用率無影響。

（2）龜甲提取物對血液學(xué)指標(biāo)的影響。由表1-2可知，龜甲提取物各劑量組雌雄大鼠血液學(xué)指標(biāo)均在實(shí)驗(yàn)室歷史正常值范圍內(nèi)，且與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在實(shí)驗(yàn)中期及恢復(fù)期，高劑量衛(wèi)星組雌雄大鼠血液學(xué)指標(biāo)也均在實(shí)驗(yàn)室歷史正常值范圍內(nèi)，且與對照衛(wèi)星組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說明龜甲提取物各劑量對雌雄大鼠血常規(guī)指標(biāo)無影響。

（3）龜甲提取物對血生化指標(biāo)的影響。由表3-6可知，龜甲提取物各劑量組雌雄大鼠血生化指標(biāo)均在實(shí)驗(yàn)室歷史正常值范圍內(nèi)，且與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在實(shí)驗(yàn)中期及恢復(fù)期，高劑量衛(wèi)星組雌雄大鼠血生化指標(biāo)也均在實(shí)驗(yàn)室歷史正常值范圍內(nèi)，且與對照衛(wèi)星組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說明龜甲提取物各劑量對雌雄大鼠血生化指標(biāo)無影響。

（4）龜甲提取物對實(shí)驗(yàn)大鼠眼部、尿常規(guī)的影響。在實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，對龜甲提取物高劑量組、陰性對照組雌雄大鼠進(jìn)行眼部檢查，結(jié)果表明，晶狀體未見渾濁，眼部角膜、虹膜清晰，球結(jié)膜無水腫和充血，說明龜甲提取物對大鼠眼部無影響。在實(shí)驗(yàn)中期、實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诩盎謴?fù)期，分別檢測各組大鼠尿常規(guī)，結(jié)果表明，各組大鼠尿液外觀正常，潛血、葡萄糖、尿蛋白、尿液pH及密度均未見異常。

（5）龜甲提取物對大鼠臟器重量及臟/體比值的影響。各劑量組雌雄大鼠的腦、心臟、胸腺、腎上腺、肝臟、腎臟、脾臟、睪丸/卵巢、附睪/子宮重量及臟體比與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

（6）龜甲提取物對大鼠病理學(xué)的影響。處死動物后，肉眼觀察大鼠體表、外觀未見異常改變，被毛光滑，無脫落，肛門周圍無膿腫及分泌物，體內(nèi)未見出血、積液等，主要臟器位置均無異常，亦無明顯病變。通過系統(tǒng)解剖及鏡下觀察，劑量組雌雄大鼠部分臟器有輕微變化，但病變程度非常輕微，認(rèn)為是大鼠自發(fā)性組織病理學(xué)改變，劑量組與陰性對照組中的病變程度和情況相似，與龜甲提取物沒有相關(guān)性。28天恢復(fù)期結(jié)束，衛(wèi)星組大鼠大體解剖亦未見異常，結(jié)果認(rèn)為龜甲提取物不會引起大鼠臟器病理學(xué)改變和損傷。

三、結(jié)論

急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)以15.0g/kg·bw劑量龜甲提取物，14天觀察期內(nèi)未見異常，LD50＞15.0g/kg·bw，屬實(shí)際無毒級。

在90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)過程中，各組大鼠生存狀態(tài)良好，龜甲提取物對體重、進(jìn)食量、食物利用率無影響，對大鼠血液學(xué)、血生化指標(biāo)的變化沒有影響，眼部及尿常規(guī)檢查未發(fā)現(xiàn)異樣，通過肉眼觀察及大體解剖鏡下觀察，未見與受試龜甲提取物相關(guān)的病理學(xué)改變。長期服用龜甲提取物安全無毒，可長期食用。