譚偉 賀保平 樊啟程 巴根納

隨著“健康中國(guó)2030”的順利開(kāi)展和推進(jìn)，消費(fèi)者對(duì)于健康飲食和營(yíng)養(yǎng)攝入的關(guān)注度顯著提高。在過(guò)去的十年間，我國(guó)居民乳制品的平均攝入量從12.8g/d增長(zhǎng)到16.3g/d，與膳食推薦標(biāo)準(zhǔn)相比仍存在一定的差距。目前我國(guó)居民乳制品攝入多為純牛奶，占比高達(dá)60%。牛奶中含有豐富的蛋白酶，其中纖溶酶（Plasmin，PL）是一種內(nèi)源性的天然蛋白酶，作為牛奶中最重要并且受到最多研究的酶之一，其與胰蛋白酶的性能類似，屬于堿性絲氨酸蛋白酶，極大程度地影響著乳及其制品的品質(zhì)。本文主要從纖溶酶的性質(zhì)、活性測(cè)定及其對(duì)乳制品品質(zhì)的影響等方面展開(kāi)簡(jiǎn)要的論述。

一、纖溶酶和纖溶酶原

1.來(lái)源。纖溶酶是牛奶蛋白質(zhì)降解過(guò)程中最重要且天然含有的蛋白酶。純牛奶中的纖溶酶可以水解很多奶中天然存在的底物，并且對(duì)奶的保鮮、奶酪生產(chǎn)都具有一定的影響，甚至?xí)淖兣Ｄ痰慕M成。纖溶酶是一個(gè)極其龐大且復(fù)雜的體系，由以下幾部分共同構(gòu)成：纖溶酶原（Plasminogen，PG）、纖溶酶原激活劑（Plasminogen activators，PA）、纖溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen activator inhibitors，PAI）和纖溶酶抑制劑（Plasmin inhibitors，PI）。它們之間的關(guān)系復(fù)雜，PA激活PG轉(zhuǎn)化為PL，PI抑制PL活性，PAI抑制PG轉(zhuǎn)化為PL。PA也是一類絲氨酸堿性蛋白酶，可以水解纖溶酶原，生成有活性的纖溶酶。由于牛奶中的纖溶酶大多以酶原的形式存在，因而對(duì)奶中PA活力進(jìn)行研究，可以有效提高對(duì)纖溶酶和纖溶酶原系統(tǒng)的認(rèn)知水平。

純牛奶中的纖溶酶原和纖溶酶是天然存在于牛奶中的堿性絲氨酸蛋白酶，其中多半會(huì)與酪蛋白膠束相結(jié)合，這會(huì)使纖溶酶對(duì)酪蛋白底物產(chǎn)生直接作用。纖溶酶是雙鏈內(nèi)肽酶，其分子質(zhì)量為48kDa，能夠以各種形式存在，具有很強(qiáng)的酪蛋白水解作用，在中性pH條件下對(duì)蛋白質(zhì)中的精氨酸和賴氨酸鍵進(jìn)行水解，會(huì)在很大程度上影響酪蛋白水解，從而對(duì)奶酪成熟過(guò)程產(chǎn)生一定的影響，但是對(duì)乳清蛋白不會(huì)產(chǎn)生水解作用。它的水解活力最佳條件為：溫度為37℃、pH為7.4-7.5。

有學(xué)者對(duì)纖溶酶原的全部氨基酸序列進(jìn)行了剖析：純牛奶中纖溶酶原的一級(jí)結(jié)構(gòu)是含有790個(gè)氨基酸殘基的肽鏈，N末端是谷氨酸，具有熱穩(wěn)定性，在某些情況下其存在形式為無(wú)活性前酶，而在牛奶中由于其被活化劑水解，成為了活性纖溶酶，從而具備了對(duì)纖維蛋白、β酪蛋白的水解能力。

許多研究表明，PL主要隨血液通過(guò)乳腺細(xì)胞分泌到牛奶中，PL和PG在血液與牛奶中并存。雖然新鮮牛奶中幾乎沒(méi)有纖溶酶成分，但是隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，纖溶酶原會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為纖溶酶，從而導(dǎo)致纖溶酶的含量不斷提高。乳中的大部分PL、PG在賴氨酸的作用下會(huì)與酪蛋白結(jié)合，其余則較多存在于乳清、脂肪球膜中。纖溶酶原激活劑具有一定的耐熱性，因此可以與酪蛋白結(jié)合，而纖溶酶抑制劑則留存于乳清中。有研究顯示，從牛乳和血液中分別分離得到的PL具有相似的最適溫度、pH、熱穩(wěn)定性、蛋白水解特異性和抑制模式。纖維蛋白在血液中能被PL水解掉，激活劑和抑制劑共同來(lái)控制其活性，而在乳中PL有水解乳蛋白的作用。有研究顯示，高溫處理幾乎可以破壞90%的PG，使其喪失活性，但PL有極強(qiáng)的耐熱性，不易被破壞。

在牛奶中，纖溶酶中各個(gè)組分的耐熱性也有一定的差異，加熱條件不同，其效果也有一定的差異。經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后，PL仍然具有很高的活性，哪怕是經(jīng)過(guò)137℃、4s的超高溫?zé)崽幚?，仍?0%-40%的PL活性尚存，主要水解牛乳中的β-酪蛋白、as1-酪蛋白和as2-酪蛋白，而PI和PAI存在于乳清中，耐熱性極差。

除此之外，纖溶酶、纖溶酶原的重要來(lái)源也包括泌乳過(guò)程中進(jìn)入牛乳的體細(xì)胞。有研究成果證實(shí)，體細(xì)胞數(shù)量是影響其活性的重要因素。纖溶酶在鮮乳中主要以纖溶酶原的形式存在，濃度可以達(dá)到纖溶酶的20倍以上。由于酶原在完成對(duì)纖溶酶的轉(zhuǎn)化之后才具備水解蛋白的能力，因而幾乎不會(huì)存在于新鮮牛乳中，而在末乳中的含量卻明顯較高。

2.纖溶酶活性測(cè)定。國(guó)外學(xué)者Dulley等提出了通過(guò)測(cè)定溶于10% TCA中的酪氨酸和酪氨酸肽的含量來(lái)測(cè)定總酶（PL+PG）的活性，在一定程度上能夠反映出乳蛋白被水解的程度。也有研究采用ELISA對(duì)乳制品中的PL活性進(jìn)行專一性更強(qiáng)的檢測(cè)。為了評(píng)估纖溶酶的水解活性，可以運(yùn)用多種途徑測(cè)量蛋白質(zhì)水解的程度及其產(chǎn)生的水解產(chǎn)物，或者直接測(cè)定纖溶酶的活性。此外，研究中提到可以將2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）納入日常實(shí)驗(yàn)室操作中，作為檢測(cè)纖溶酶存在的一種慣用手段。

檢測(cè)纖溶酶原的方法與檢測(cè)纖溶酶的方式一致，首要步驟是測(cè)量樣本中的纖溶酶活性，然后向樣本中添加纖溶酶原激活劑，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的孵育后，再次測(cè)量纖溶酶的活性，兩次纖溶酶活性測(cè)定結(jié)果之間的差異就是纖溶酶原的激活程度。

不過(guò)，當(dāng)前有關(guān)纖溶酶的檢測(cè)方法尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，距離商業(yè)化應(yīng)用還有很長(zhǎng)一段路要走。

3.影響因素。奶中PL和PG的含量會(huì)受到多種因素的影響，如纖溶酶原初始濃度、比例、激活劑和抑制劑的比例等。從環(huán)境因素來(lái)看，季節(jié)因素會(huì)對(duì)PL、PG產(chǎn)生顯著影響，同時(shí)體細(xì)胞數(shù)量的變化、胎次的不同、泌乳階段的差異、產(chǎn)奶量的多少也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生相應(yīng)的影響。同時(shí)，不同品種、不同養(yǎng)殖模式下的純牛奶中PL和PG濃度的變動(dòng)范圍也是明顯不同的。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，PL的活性會(huì)受到奶牛品種的影響，如荷斯坦奶牛>水牛>娟姍牛，同時(shí)纖溶酶及纖溶酶原在不同品種的奶牛、綿羊之間也存在差異。在不同奶牛品種之間，纖溶酶含量的差異可能來(lái)源于酪蛋白。處于泌乳晚期、老齡的奶牛，患有乳房炎的奶牛，乳中纖溶酶活性都比較高。此外，纖溶酶活力還會(huì)受到日常擠奶次數(shù)的影響，同時(shí)也可能受到保存和加工過(guò)程的影響。有研究表明，頻繁地?cái)D奶和不規(guī)范的操作會(huì)對(duì)產(chǎn)乳量和乳成分產(chǎn)生一定的影響，對(duì)纖溶酶的活性影響顯著，并且隨著泌乳期的延遲，纖溶酶的活性會(huì)逐漸增強(qiáng)。另外，PL在牛乳和乳制品中的活性又受到貯藏條件、熱處理和pH等因素的影響。

二、纖溶酶對(duì)乳制品的影響

據(jù)資料所述，牛奶中含有多種功能性肽類，其中磷脂酶（PL）的活性對(duì)乳制品質(zhì)量具有重要影響，會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)水解、風(fēng)味改變、脂肪析出和凝膠形成等諸多問(wèn)題。在奶酪制作過(guò)程中，磷脂酶會(huì)在一定程度上促進(jìn)奶酪的成熟和風(fēng)味物質(zhì)的生成，對(duì)新鮮奶酪的產(chǎn)生具有積極作用。在奶酪成熟階段，纖溶酶通過(guò)水解酪蛋白，會(huì)改變酪蛋白原有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使奶酪變得柔軟，然而過(guò)度水解有時(shí)會(huì)造成苦味等不良風(fēng)味，所以需要控制適度的纖溶酶活性。在新鮮牛奶中，磷脂酶直接作用于牛奶蛋白，所以任何影響磷脂酶的因素都可能間接影響乳制品的質(zhì)量。研究人員發(fā)現(xiàn)，纖溶酶會(huì)降低凝結(jié)酶形成的凝塊硬度。纖溶酶能夠水解牛奶中的α-酪蛋白和β-酪蛋白，產(chǎn)生胨、?、γ-酪蛋白等水解產(chǎn)物，但對(duì)牛奶中k-酪蛋白的影響較小。盡管牛奶中的纖溶酶活性不高，但在牛奶保存與加工過(guò)程中，由纖溶酶原激活產(chǎn)生大量的纖溶酶，可能會(huì)顯著影響牛奶的成分和風(fēng)味。

三、纖溶酶的控制措施

一般情況下，纖溶酶和纖溶酶原在正常的巴氏殺菌條件下不會(huì)完全失活，而纖溶酶抑制劑和纖溶酶激活劑抑制劑已經(jīng)完全失活，所以相應(yīng)產(chǎn)品中纖溶酶活性處于更高水平。部分纖溶酶和纖溶酶原還可以在高溫短時(shí)殺菌和直接UHT等加熱條件下存活。研究發(fā)現(xiàn)：在直接UHT之前進(jìn)行預(yù)熱處理（90℃/60s或120s）或延長(zhǎng)UHT保溫時(shí)間（143℃/15s或30s），都可以使牛奶中的纖溶酶完全失活。因此，無(wú)論是使用新鮮牛奶，還是使用低熱乳粉還原生產(chǎn)直接UHT殺菌的牛奶，都需要進(jìn)行額外的預(yù)熱處理或者延長(zhǎng)UHT的保溫時(shí)間，以確保纖溶酶系統(tǒng)完全失活。此外，也可以選用高熱乳粉（乳清蛋白氮指數(shù)較低），因?yàn)樵诟邿崛榉墼谏a(chǎn)過(guò)程中使用的熱處理強(qiáng)度足以滅活纖溶酶系統(tǒng)的所有組分。

此外，將脫脂奶進(jìn)行微濾處理可以去除體細(xì)胞、細(xì)菌和芽孢以及相關(guān)的酶，進(jìn)而影響纖溶酶的活性，因?yàn)槿コw細(xì)胞的同時(shí)也去除了與它相關(guān)的纖溶酶系統(tǒng)激活劑。研究表明，在進(jìn)行UHT之前對(duì)牛奶實(shí)施微濾處理，可以使牛奶的保質(zhì)期延長(zhǎng)4個(gè)月。另外，P.DIncecco等研究發(fā)現(xiàn)：將微濾后的牛奶再用于間接UHT殺菌牛奶的生產(chǎn)，可以使用更柔和的UHT殺菌條件（137℃/3s），而無(wú)需使用傳統(tǒng)的UHT殺菌條件（147℃/5s），相應(yīng)產(chǎn)品中糠氨酸和乳果糖的含量也明顯低于使用傳統(tǒng)UHT殺菌條件下生產(chǎn)的牛奶，并且可以使全脂和低脂牛奶的貨架期延長(zhǎng)5個(gè)月，使脫脂牛奶的貨架期延長(zhǎng)2個(gè)月。

綜上所述，纖溶酶作為牛奶中重要的內(nèi)源蛋白酶，能夠?qū)δ讨破返漠a(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生直接的影響。而PL-PG作為乳中的蛋白水解酶體系，會(huì)對(duì)乳制品的品質(zhì)產(chǎn)生很多不利的影響。因此，了解牛奶中纖溶酶和纖溶酶原的來(lái)源以及相應(yīng)的控制措施，可以有效提高乳制品品質(zhì)，延長(zhǎng)乳制品的保質(zhì)期，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

作者簡(jiǎn)介：譚偉（1981-），男，漢族，山東鄆城人，碩士研究生，研究方向?yàn)槌亻L(zhǎng)貨架期乳制品開(kāi)發(fā)。