翁美華,鄧麗金,胡靜溫,3,周紅娟,陳錦秀,陳焰南

(1. 福建中醫(yī)藥大學,福建 福州 350122;2. 廈門大學附屬中山醫(yī)院,福建 廈門 361000;3. 四川大學華西醫(yī)院,四川 成都 610000)

化療致胃腸道黏膜炎(Chemotherapy-induced Gastrointestinal Mucositis,CIGIM)又稱化療致胃腸道黏膜損傷,是許多化療藥物的劑量限制性不良反應之一,病理學上以胃腸上皮細胞凋亡為特征[1-2]。據(jù)報道,在接受標準劑量化療后,大約40%的患者和100%接受骨髓或干細胞移植高劑量化療的患者會出現(xiàn)CIGIM[3-4]。CIGIM及其相關(guān)并發(fā)癥可導致化療劑量減少,影響癌癥患者總體生存率,增加了患者醫(yī)療負擔,降低患者生活質(zhì)量。中醫(yī)學認為脾胃氣虛、脾失健運是CIGIM的基本病機,糾正脾胃氣虛以健運脾胃,恢復脾主運化功能是CIGIM防治的重要途徑。脾主運化是指脾將飲食水谷消化成精微物質(zhì)與糟粕,并將精微物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)輸?shù)饺砀髋K腑的生理功能,包括運化水谷和運化水液兩個方面。芪藥雞金粥具有益氣健脾功效,臨床應用發(fā)現(xiàn)可減輕化療后胃腸道反應[5]。動物實驗研究證實,芪藥雞金粥可上調(diào)腸道緊密連接蛋白表達,保護腸道機械屏障的結(jié)構(gòu)與功能,從而改善CIGIM,其作用機制可能與活化細胞外信號調(diào)控激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、抑制脊髓 Toll 樣受體 4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信號通路下游的關(guān)鍵蛋白IκBα降解有關(guān),但未找到芪藥雞金粥經(jīng)TLR4通路抑制IκBα降解的證據(jù)[6-7]。既往研究表明,磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/NF-κB信號通路是調(diào)控腸黏膜炎癥的關(guān)鍵通路,是健運脾胃的重要作用靶點[8-9]。因此,本研究以“脾主運化”作為理論基礎(chǔ),以CIGIM脾氣虛大鼠為研究對象,基于PI3K/Akt/NF-κB信號通路探討了芪藥雞金粥調(diào)控CIGIM腸道緊密連接蛋白表達的機制,以進一步明確芪藥雞金粥的作用機制,為其臨床防治CIGIM提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康SPF級雄性Wistar大鼠48只,8周齡,體重(200±20)g,購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,實驗動物合格證號:SCXK (滬) 2018-0006。大鼠飼料為福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心統(tǒng)一配制,單籠喂養(yǎng),自由飲食,環(huán)境溫度20～26 ℃,相對濕度40%～70%,每天人工光源12 h明暗交替。

1.2藥膳及藥品 芪藥雞金粥(黃芪20 g、淮山20 g、萊菔子10 g、雞內(nèi)金10 g、粳米50 g),其中黃芪產(chǎn)自山西,淮山產(chǎn)自河南,雞內(nèi)金、萊菔子和粳米產(chǎn)地不限,所有藥膳原材料均購自福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂中藥房。氟尿嘧啶注射液(5-FU,上海旭東海普藥業(yè)有限公司,國藥準字H31020593)。

1.3主要試劑 封閉蛋白-1(Claudin-1)兔多克隆抗體、閉鎖蛋白(Occludin)兔多克隆抗體、閉鎖小帶蛋白(ZO-1)兔多克隆抗體、結(jié)合黏附分子-1(JAM-1)兔多克隆抗體(福州沃森生物公司,貨號分別為28674-1-AP、27260-1-AP、21773-1-AP、ET1610-90),Anti PI3K p85鼠單克隆抗體、Akt鼠單克隆抗體、NF-κB 兔多克隆抗體、Phospho-PI3K p85多克隆抗體、Akt-phospho-S473鼠單克隆抗體(福州沃森生物公司,貨號分別為60225-1-Ig、60203-2-Ig、14220-1-AP、PA5-104853、66444-1-Ig),動物細胞總蛋白抽提試劑(碧云天,P0013B),BCA蛋白定量試劑盒(碧云天,P0012A),ECL增強型化學發(fā)光底物檢測試劑盒(Santacrzu,SC-2048),SDS-PAGE上樣緩沖液(碧云天,B1007)。

1.4主要儀器 溫控搖床(New Brunswich USA),電子天平BS124S(德國賽多利斯公司),恒溫水槽DKB-501A型(上海精宏設備有限公司),-80 ℃超低溫冰箱(美國 Thermo Fisher Scientific 公司),移液槍(Eppendorf公司,法國),微量加樣吸頭(Rainin,美國),4 ℃低溫冰箱(青島海爾),制冰機(AF10 SCOTSMAN,美國),去離子水儀(PALL, Purelab Plus,美國),PVDF膜(Millipore,美國),超高靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)、電泳儀、凝膠玻璃板、固定夾、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽(美國 Bio-Rad 公司),通用顯影粉、酸性定影粉(天津天陸海感光材料廠),轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司),高速離心機、低溫離心機(Eppendorf,德國)。

1.5藥膳及白粥制作方法 依據(jù)《中國藥膳制作及從業(yè)資質(zhì)基本要求》標準(編號ZGYS/T001-2010),參照《中醫(yī)藥膳學》[10]制作。芪藥雞金粥制作方法:放入藥材后加水600 mL,浸泡30 min,武火煎煮10 min,取汁,加入粳米,煮熟后濾液、濃縮(每毫升藥液含生藥1.25 g),4 ℃儲存。白粥制作方法:淘洗過的粳米50 g加水600 mL,武火煎煮10 min,改用文火熬至湯汁濃稠,煮熟后濾液、濃縮,4 ℃儲存。

1.6實驗方法 大鼠常規(guī)適應性喂養(yǎng)7 d后,采用隨機數(shù)字表法完全隨機分為空白組、模型組、藥膳組,每組16只,采用5%苦味酸及0.5%中性品紅溶液標記動物。 藥膳組于實驗第1天9:00—10:00開始給予芪藥雞金粥灌胃(復溫至37 ℃),模型組及空白組給予白粥灌胃,均1次/d,每次10 mL/(kg·d)(參照人鼠體表面積換算灌胃劑量,人按照60 kg計算[11]),連續(xù)14 d。灌胃方法:將大鼠固定于左手,頭頸保持平直,右手持裝有藥膳或白粥濾液的注射器,將針頭沿大鼠左側(cè)口角,徐緩經(jīng)口腔插入約5 cm,將藥液徐徐推注進胃內(nèi)。實驗第7天,各組灌胃30 min后,藥膳組和模型組大鼠給予5-FU 150 mg/kg一次性腹腔注射[12],空白組給予等量生理鹽水注射。實驗第8天(化療后第1天),3組各隨機抽取8只大鼠,禁食24 h后處死,其余大鼠繼續(xù)灌胃。實驗第15天(化療后第8天),剩余大鼠經(jīng)禁食24 h后處死。

1.7檢測指標及方法

1.7.1回腸組織病理形態(tài) 大鼠禁食禁水24 h后,脫頸椎法處死,打開腹腔,解剖取出小腸,使用生理鹽水將小腸內(nèi)容物沖洗干凈后,于距回盲部約5 cm處剪取回腸3 cm,生理鹽水沖洗干凈后,立即置于4%多聚甲醛固定24 h,常規(guī)制備石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察。

1.7.2回腸組織中緊密連接相關(guān)蛋白和PI3K/Akt/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達情況 采用Western blot法檢測:取-80 ℃凍存的回腸組織,用等量的蛋白樣本(50 μg)進行SDS-PAGE凝膠電泳,濕法轉(zhuǎn)膜,在5%脫脂奶粉封閉液中封閉(4 ℃,過夜),棄去封閉液。加入封閉液稀釋好的Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1、PI3K、Akt、IκBα、p-Akt、p-PI3K蛋白抗體及GAPDH抗體(1∶1 000),TBST漂洗濾膜4次,每次10 min。將膜與辣根過氧化酶標記的二抗(1∶5 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h,然后用TBST充分洗膜,漂洗4次,每次10 min。顯影液置膜上,凝膠成像儀成像,測定各條帶的灰度值, 目的蛋白的灰度值與β-actin的比值代表目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠回腸組織病理形態(tài) 實驗第15天,空白組大鼠回腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)完整,未出現(xiàn)充血、水腫、剝脫和炎性細胞浸潤現(xiàn)象,上皮細胞連接緊密,腺體形狀規(guī)則;模型組大鼠回腸黏膜絨毛變性、萎縮,部分絨毛脫落,完整性受破壞,有大量炎性細胞浸潤,腺體被破壞;藥膳組與模型組相比,回腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)相對完整,絨毛脫落現(xiàn)象有所恢復,炎性細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 空白組和化療各組大鼠實驗第15天回腸組織病理形態(tài)(HE染色)

2.2各組大鼠回腸組織中緊密連接蛋白表達情況實驗第8天和第15天,模型組和藥膳組大鼠回腸組織中Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白相對表達量均明顯低于同期空白組(P均<0.05),但藥膳組Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白相對表達量均明顯高于同期模型組(P均<0.05)。見圖2、圖3及表1。

表1 空白組和化療各組大鼠回腸組織中緊密連接蛋白相對表達量比較

圖2 空白組和化療各組大鼠實驗第8天回腸組織中緊密連接蛋白表達情況

圖3 空白組和化療各組大鼠實驗第15天回腸組織中緊密連接蛋白表達情況

2.3各組大鼠回腸組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達情況 實驗第8天和第15天,模型組和藥膳組大鼠回腸組織中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα蛋白相對表達量均明顯低于同期空白組(P均<0.05),但藥膳組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα蛋白相對表達量均明顯高于同期模型組(P均<0.05)。見圖4、圖5及表2、表3。

表2 空白組和化療各組大鼠實驗第8天回腸組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關(guān)蛋白相對表達量比較

表3 空白組和化療各組大鼠實驗第15天回腸組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關(guān)蛋白相對表達量比較

圖4 空白組和化療各組大鼠實驗第8天回腸組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達情況

圖5 空白組和化療各組大鼠實驗第15天回腸組織中PI3K/Akt/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達情況

3 討 論

化療藥物屬熱毒之邪,在對抗癌瘤的同時,容易耗傷人體氣血、灼津耗液,使機體氣血俱損,傷及脾胃,從而導致脾胃氣虛失之健運。本研究所用芪藥雞金粥是益氣健脾經(jīng)典藥膳,記載于唐代醫(yī)家昝殷《食醫(yī)心鑒》,其組成中黃芪為補氣諸藥之最,性微溫味甘,入脾、肺經(jīng),有益氣健中、補養(yǎng)脾胃之氣功效,可增強機體免疫功能;淮山性味甘平,入脾、肺、腎經(jīng),具有健脾益胃、滋腎益精等作用,輔助黃芪以補脾胃之氣;雞內(nèi)金、萊菔子助脾胃之健運,防黃芪、淮山之壅滯,共奏益氣健脾、消食導滯之效,使藥膳補而不滯,補中寓通;粳米性平、味甘淡,具有健脾胃、補中氣之效。芪藥雞金粥切中CIGIM的病因以及脾胃氣虛失之健運的病機。

腸道屏障由機械、免疫、生物和化學四大屏障構(gòu)成,其中機械屏障為腸道屏障最重要的組成部分,主要由腸黏膜上皮細胞、上皮細胞間緊密連接和菌膜三部分組成[13]。機械屏障完整可以有效阻止細菌及內(nèi)毒素等有害物質(zhì)透過腸黏膜進入組織。當腸黏膜受到化療藥物的刺激時,其緊密連接結(jié)構(gòu)會被破壞,損傷腸道屏障功能,導致腸道內(nèi)各種抗原激活黏膜固有層的免疫系統(tǒng),啟動過度持續(xù)的免疫炎癥反應,造成腸黏膜損傷[9]。緊密連接蛋白是腸道屏障功能的重要組成部分,PI3K/Akt/NF-κB通路在調(diào)控緊密連接蛋白合成過程中發(fā)揮重要作用[14]。在PI3K/Akt/NF-κB信號通路中,PI3K參與緊密連接的形成過程,促進骨架蛋白重排,p-PI3K可與ZO-1和Occludin的C端結(jié)合,影響緊密連接的閉合;活化的NF-κB啟動基因轉(zhuǎn)錄與炎癥反應,使緊密連接蛋白分布異常和表達下降,增加腸道的通透性,破壞腸道黏膜屏障,進而加重腸道損傷[15-16]。本實驗結(jié)果顯示,實驗第15天模型組大鼠回腸黏膜絨毛變性、萎縮,部分絨毛脫落,完整性受破壞,有大量炎性細胞浸潤,腺體被破壞;藥膳組回腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)相對完整,絨毛脫落現(xiàn)象有所恢復,炎性細胞浸潤減少。實驗第8天和實驗第15天模型組回腸組織中緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、JAM-1、ZO-1蛋白相對表達量均明顯低于空白組,藥膳組各蛋白相對表達量也降低,但下降程度明顯輕于模型組。 這說明化療藥物5-FU能顯著影響大鼠腸黏膜緊密連接蛋白的表達,破壞腸道機械屏障防護功能,芪藥雞金粥可在一定程度上通過上調(diào)腸道機械屏障緊密連接蛋白的表達而緩解回腸黏膜損傷。

研究顯示,PI3K/Akt/NF-κB信號通路參與了胃腸黏膜損傷的發(fā)生發(fā)展,對其進行調(diào)控是修復胃腸黏膜的關(guān)鍵[14-15]。PI3K是一系列胞內(nèi)傳導酶家族,Akt則是一種與蛋白激酶C相關(guān)的絲氨酸或蘇氨酸激酶,是PI3K下游的直接作用靶點。當所有位點被磷酸化,細胞膜上的Akt就被完全激活,被激活的Akt從細胞膜釋放進入細胞漿或細胞核中進行信號的傳輸,執(zhí)行其生物學功能。因此,Akt的磷酸化可被作為判斷PI3K活性的指標。NF-κB由活化的PI3K/Akt激活,能夠起到多向性的調(diào)節(jié)作用,可調(diào)節(jié)免疫炎癥相關(guān)的多種細胞的基因表達。研究顯示,在正常狀態(tài)下,NF-κB與其抑制分子IκBα結(jié)合存在于細胞質(zhì)中,當細胞受到外界信號(如化療藥物、脂多糖等)刺激時,通路上的Akt被活化,p-Akt可促使下游IκBα發(fā)生磷酸化而與NF-κB解離,此時NF-κB被激活而移位進入細胞核內(nèi),與DNA上相應位點結(jié)合發(fā)揮生物學效應,加重炎癥反應[17-18]。本實驗結(jié)果顯示,實驗第8天和第15天模型組和藥膳組大鼠回腸組織中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα蛋白相對表達量均低于空白組,但藥膳組各通路蛋白下降的程度輕于模型組。這說明當腸黏膜受到化療藥物刺激時,PI3K/Akt/NF-κB信號通路被激活,使通路蛋白PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、IκBα表達降低,而益氣健脾芪藥雞金粥能夠一定程度上抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路的激活,減輕炎癥反應,從而減輕腸道黏膜損傷。

綜上所述,芪藥雞金粥可以調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白表達,減輕化療后胃腸黏膜損傷,其機制可能與抑制PI3K/Akt信號傳導阻斷NF-κB信號級聯(lián)激活,抑制炎癥細胞因子介導有關(guān)。但藥膳復方成分復雜,可能作用于疾病相關(guān)的不同靶點,是否對PI3K/Akt/NF-κB 信號通路具有特異性抑制作用尚不完全確定,有待進一步研究,從而為益氣健脾藥膳改善化療后胃腸黏膜損傷提供更系統(tǒng)、明確的分子理論依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。