古麗努爾·艾尼,劉春麗,王彥娥

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830054)

糖尿病腎損傷是糖尿病進(jìn)展過(guò)程中常見(jiàn)的并發(fā)癥,臨床以腎小球?yàn)V過(guò)率降低及蛋白尿?yàn)橹饕卣?隨著疾病進(jìn)展會(huì)發(fā)展成為腎衰竭,危及患者生命。目前研究認(rèn)為,糖尿病腎損傷的發(fā)生發(fā)展與糖代謝異常、腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變、腎組織氧化應(yīng)激損傷、腎臟中異位脂肪沉積等多種因素有關(guān)[1-3]。酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)/細(xì)胞因子信號(hào)抑制物1(SOCS-1)通路是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的與糖尿病腎損傷密切相關(guān)的信號(hào)通路[4],調(diào)節(jié)該通路及相關(guān)蛋白的異常表達(dá)能夠顯著修復(fù)糖尿病大鼠腎組織損傷[5]。復(fù)方降糖玉液是基于中醫(yī)理論由多種中藥材組成的中藥成方制劑,臨床用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療療效較好。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察了復(fù)方降糖玉液對(duì)糖尿病腎損傷的修復(fù)作用及對(duì)JAK2/STAT3/SOCS-1通路的影響,旨在明確其藥理作用,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠72只,6～8周齡,體重200～220 g,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(新)2018-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃,相對(duì)濕度40%～70%,晝夜交替12 h,自由飲食。

1.2設(shè)備與儀器 CKX41-F32FL熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);SpectraMax iD5酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司);S700石蠟切片機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);BK-280全自動(dòng)生化分析儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司);STX622電子天平(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司);Gel Doc EZ凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司);M16RS高速冷凍離心機(jī)(上海邁皋科學(xué)儀器有限公司)。

1.3藥品及試劑 復(fù)方降糖玉液(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑,由黃芪15 g、生曬參10 g、制首烏10 g、黃精15 g、生地20 g、三七10 g、天花粉15 g組成,批號(hào):11120021);厄貝沙坦(海正輝瑞制藥有限公司,批號(hào):CA161,規(guī)格:150 mg/片);高糖高脂飼料(北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):1012);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司,貨號(hào):P4812);白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(上海酶研生物科技有限公司,貨號(hào):EK-R36877);單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA試劑盒(上海繼和生物科技有限公司,貨號(hào):JH-H10542);JAK2(貨號(hào):ab108596)、p-JAK2(貨號(hào):ab32101)、STAT3(貨號(hào):ab68153)、p-STAT3(貨號(hào):ab267373)、SOCS-1(貨號(hào):ab280886)、GAPDH(貨號(hào):ab181602)兔單克隆抗體(艾博抗貿(mào)易有限公司),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(艾博抗貿(mào)易有限公司,貨號(hào):ab150077);二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒(貨號(hào):PC0020)、TUNEL試劑盒(貨號(hào):T2130)、HE染色試劑盒(貨號(hào):G1120)、磷酸鹽緩沖液(貨號(hào):P1031)(北京索萊寶科技有限公司);蛋白酶K(碧云天生物科技有限公司,貨號(hào):ST533);含DAPI抗熒光淬滅封片液(碧云天生物科技有限公司,貨號(hào):P0131)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)取12只大鼠作為空白組,其余60只大鼠參考文獻(xiàn)[6-7]方法建立糖尿病腎損傷模型:采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后,大鼠禁食12 h,一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg,大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)7 d,采尾靜脈血測(cè)定血糖(采血前大鼠禁食6 h),以血糖≥7 mmol/L視為糖尿病模型建立成功,繼續(xù)喂養(yǎng)4周并收集24 h尿液,測(cè)定尿蛋白量,以空腹血糖≥16.7 mmol/L同時(shí)24 h尿蛋白量≥30 mg/24 h視為糖尿病腎損傷造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦及復(fù)方降糖玉液低、中、高劑量組,每組12只。復(fù)方降糖玉液低、中、高劑量組按照成人給藥劑量的6.25倍計(jì)算,分別給予2.5 g/kg、5 g/kg、10 g/kg(以生藥含量計(jì))復(fù)方降糖玉液灌胃,厄貝沙坦組參考文獻(xiàn)[8-9]給予厄貝沙坦0.02 g/kg灌胃,空白組及模型組給予生理鹽水灌胃,均 1次/d,連續(xù)8周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.124 h尿蛋白定量及空腹血糖 末次灌胃后,收集各組大鼠24 h尿液,測(cè)定24 h尿蛋白定量。末次灌胃后24 h,禁食6 h,尾靜脈取血,血糖儀測(cè)定空腹血糖水平。

1.5.2糖化血紅蛋白及腎功能指標(biāo) 大鼠稱重后,采用10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血至干凈離心管,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定糖化血紅蛋白、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平。

1.5.3腎指數(shù)及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量 處死大鼠,取腎組織并稱重,計(jì)算腎指數(shù),腎指數(shù)=腎質(zhì)量(mg)/體重(g)×100%。取腎組織,研磨勻漿后離心取上清,使用相應(yīng)試劑盒測(cè)定TNF-α、IL-1β、MCP-1含量。

1.5.4腎組織病理形態(tài) 分離腎組織,制成5 μm石蠟切片,常規(guī)HE染色,置于顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.5.5腎組織細(xì)胞凋亡情況 取制備好的5 μm石蠟切片,使用二甲苯脫蠟后,梯度乙醇至水,滴加20 μg/mL的蛋白酶K抗原修復(fù)后,磷酸鹽緩沖液清洗3次,滴加50 μL的TUNEL染色液,37 ℃條件下避光孵育60 min,再次使用磷酸鹽緩沖液清洗3次,滴加含有DAPI的抗熒光淬滅劑,蓋上蓋玻片,置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。細(xì)胞凋亡率=TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.6腎組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及SOCS-1蛋白表達(dá)情況 取腎組織,研磨勻漿后離心取上清,試劑盒測(cè)定蛋白含量并取含有50 μg蛋白的上清液,經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜及脫脂牛奶封閉后,用GAPDH、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1兔抗體按照1∶1 000稀釋后4 ℃孵育過(guò)夜,TBST清洗并用山羊抗兔二抗在室溫下按照1∶2 000稀釋后孵育1 h,使用化學(xué)發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)拍照,以GAPDH為內(nèi)參,Image J 1.8.0計(jì)算JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析處理,計(jì)量資料呈正態(tài)分布,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較使用LSD檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血糖及腎功能指標(biāo)比較 模型組大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血紅蛋白、BUN、SCr水平均明顯高于空白組(P均<0.05);復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血紅蛋白、BUN、SCr水平均明顯低于模型組,且上述各指標(biāo)均隨復(fù)方降糖玉液劑量的增加而逐漸降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠血糖及腎功能指標(biāo)比較

2.2各組大鼠腎指數(shù)及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量比較 模型組大鼠腎指數(shù)及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量均明顯高于空白組(P均<0.05);復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎指數(shù)及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量均明顯低于模型組,且上述各指標(biāo)均隨復(fù)方降糖玉液劑量的增加而逐漸降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎指數(shù)及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量比較

2.3各組大鼠腎組織病理學(xué)形態(tài) 空白組大鼠腎組織病理形態(tài)正常;模型組大鼠腎組織有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞排列不整齊,腎小管擴(kuò)張;與模型組比較,復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎組織炎癥浸潤(rùn)減輕,細(xì)胞排列整齊,腎小管無(wú)明顯擴(kuò)張。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織病理學(xué)HE染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況比較 空白組大鼠腎組織細(xì)胞無(wú)明顯凋亡;模型組大鼠腎組織細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡,凋亡率明顯高于空白組(P<0.05);復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡減少,細(xì)胞凋亡率均明顯低于模型組,且細(xì)胞凋亡率隨著復(fù)方降糖玉液劑量的增加而逐漸降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖2及圖3。

圖2 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡染色情況(×200)

圖3 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率

2.5各組大鼠腎組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白表達(dá)情況 與空白組比較,模型組大鼠腎組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明顯升高(P均<0.05),腎組織中 SOCS-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎組織中p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明顯降低,腎組織中 SOCS-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高,且上述各指標(biāo)均隨復(fù)方降糖玉液劑量的增加變化更明顯,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白表達(dá)情況

3 討 論

糖尿病腎損傷是由于糖尿病患者長(zhǎng)期血糖控制不良引起的腎組織病變,目前以對(duì)癥治療為主,其中厄貝沙坦因具有降壓、調(diào)節(jié)腎臟血流及保護(hù)腎細(xì)胞作用而被廣泛用于高血壓合并2型糖尿病腎損傷的治療,所以本實(shí)驗(yàn)將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。但現(xiàn)有的治療手段均不能改變糖尿病腎損傷最終進(jìn)展為終末期腎病的結(jié)局[10],所以研發(fā)糖尿病腎損傷的治療藥物尤為迫切。

中醫(yī)理論認(rèn)為,糖尿病腎損傷主要是由于脾腎虧虛,濁毒內(nèi)蘊(yùn),進(jìn)而導(dǎo)致腎絡(luò)瘀結(jié),腎用失司,腎陰虧虛,津液不足,脈絡(luò)虧虛,澀滯成瘀,所以中醫(yī)認(rèn)為糖尿病腎損傷的治療應(yīng)以益氣活血、扶正化瘀為主[11-12]。復(fù)方降糖玉液方中以黃芪、生曬參、制首烏補(bǔ)肝腎,益精血,起到補(bǔ)氣固表之功效;以黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰,健脾益腎;生地清熱涼血、養(yǎng)陰生津;三七散瘀止血,消腫定痛;天花粉生津止渴;全方使陽(yáng)升而陰應(yīng),進(jìn)而起到益氣補(bǔ)血、滋陰補(bǔ)腎之功效。本實(shí)驗(yàn)研究表明,復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血紅蛋白、BUN、SCr、腎指數(shù)、腎組織細(xì)胞凋亡率均明顯低于模型組,腎組織炎癥浸潤(rùn)明顯減輕,且各項(xiàng)指標(biāo)隨著復(fù)方降糖玉液劑量的增加變化更明顯。提示復(fù)方降糖玉液可呈劑量依賴性地減輕蛋白尿,控制血糖水平,保護(hù)腎功能,減輕腎損傷,抑制腎組織細(xì)胞凋亡。

近年來(lái)研究表明,糖尿病腎損傷的發(fā)生及進(jìn)展與JAK2/STAT3通路激活及炎癥反應(yīng)有關(guān),TNF-α、IL-1β、MCP-1與腎組織的炎癥反應(yīng)有關(guān),JAK2/STAT3/SOCS-1通路活化會(huì)導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、MCP-1水平異常升高,進(jìn)而導(dǎo)致大鼠腎組織炎癥損傷的發(fā)生及進(jìn)展[13];而下調(diào)腎組織中p-JAK2、p-STAT3表達(dá),上調(diào)SOCS-1表達(dá)可減輕糖尿病腎損傷[13-15]。Porro等[16]研究證實(shí),升高SOCS-1水平能夠顯著降低JAK/STAT通路相關(guān)蛋白水平,進(jìn)而顯著抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)抗炎因子的釋放,進(jìn)而抑制組織損傷。Morelli 等[17]研究表明,升高SOCS-1水平則能夠通過(guò)抑制JAK/STAT通路的激活,進(jìn)而有效降低IFN-γ及IL-22等炎癥因子對(duì)組織器官的過(guò)度刺激作用,抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。由此可見(jiàn),調(diào)節(jié)JAK2/STAT3/SOCS-1通路及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平可能是治療糖尿病腎損傷的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/ STAT3比值均明顯升高,腎組織中 SOCS-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低;與模型組比較,復(fù)方降糖玉液各組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量和p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/ STAT3比值均明顯降低,腎組織中 SOCS-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高。提示復(fù)方降糖玉液能夠呈劑量依賴性地抑制JAK2/STAT3/SOCS-1通路激活,下調(diào)TNF-α、IL-1β、MCP-1水平,從而減輕腎組織炎癥損傷,保護(hù)腎組織細(xì)胞。

綜上所述,復(fù)方降糖玉液能夠明顯降低糖尿病腎損傷大鼠的尿蛋白和血糖,保護(hù)腎功能,抑制腎組織細(xì)胞凋亡,減輕腎組織損傷,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)JAK2/STAT3/SOCS-1通路,抑制TNF-α、IL-1β、MCP-1表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。