程 剛,付平方,殷 莉,包江平,蘭 俊,匡穎文,吳云毅

(1. 十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,湖北 十堰 442000;2. 十堰市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所,湖北 十堰 442000;3. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,貴州 貴陽(yáng) 550001)

腦卒中系腦組織損傷的一組急性腦血管疾病,通常表現(xiàn)為出血性和缺血性兩大臨床分型,可導(dǎo)致肢體癱瘓、言語(yǔ)障礙、吞咽困難、認(rèn)知障礙和精神抑郁等,具有發(fā)病率高、致殘率高、病死率高、復(fù)發(fā)率高及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)高的“五高”特點(diǎn)[1]。缺血性腦卒中(即腦梗死)占所有卒中的75%以上,臨床上常針對(duì)性采用溶栓、抗血小板、抗凝、神經(jīng)保護(hù)以及控制血壓、血脂、血糖等非特異性治療[2]。目前快速恢復(fù)血管的血氧供應(yīng)是公認(rèn)獲益措施,但血管再通微環(huán)境的改變往往進(jìn)一步加重缺血組織結(jié)構(gòu)與功能的障礙,故修復(fù)降低腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損成為治療的重點(diǎn)。腦缺血再灌注損傷的發(fā)生常涉及能量代謝障礙、Ca2+超載、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧自由基損傷、興奮性氨基酸毒性等多環(huán)節(jié)[3-5],而Wnt信號(hào)通過(guò)調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化和突觸形成與腦缺血再灌注損傷病理機(jī)制密切相關(guān)[6]。微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)是神經(jīng)生長(zhǎng)和修復(fù)相關(guān)蛋白,對(duì)腦缺血非常敏感,是神經(jīng)元缺血損傷的分子指標(biāo),常為神經(jīng)可塑性研究的理想標(biāo)志物[7-8]。中藥復(fù)方通過(guò)辨證化裁防治腦卒中可發(fā)揮多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢(shì)和潛力。源于《鄂西藥物志》的天珠散由頭頂一顆珠和天麻組成,具補(bǔ)虛強(qiáng)體、鎮(zhèn)靜安神、祛風(fēng)散痰、補(bǔ)腦安神之效,對(duì)血管性癡呆及學(xué)習(xí)記憶障礙等有保護(hù)作用[9-11]。然其作為土家、苗族民間地域特色驗(yàn)方應(yīng)用并未普及,歷史文獻(xiàn)和現(xiàn)代藥理研究資料仍十分匱乏,均在不同程度限制了天珠散的開(kāi)發(fā)和推廣。本研究通過(guò)建立局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型,進(jìn)一步觀察了天珠散對(duì)腦缺血再灌注損傷及Wnt3a、MAP-2蛋白表達(dá)的影響,探討其抗腦缺血神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠90只,6～8周齡,體重(200±20)g,購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[許可證號(hào):SCXK(鄂)2020-0018],飼養(yǎng)于武漢大學(xué)附屬人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SYXK(鄂)2017-0065],室溫20～25 ℃,相對(duì)濕度50%～60%,自由進(jìn)食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(202003)。

1.2藥物 頭頂一顆珠(批號(hào):191210)、天麻(批號(hào):210801)均購(gòu)于十堰華源三江醫(yī)藥有限公司,經(jīng)湖北省中醫(yī)院嚴(yán)勁松主任藥師鑒定分別為百合科延齡草屬植物延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim.)的干燥根及根莖和蘭科天麻屬植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥塊莖;天珠散超微粉(300目)由十堰市宏康醫(yī)藥有限公司按藥材比1∶2制備;尼莫地平片(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,批號(hào):211211)。

1.3主要試劑與儀器 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,Sigma公司,批號(hào):T8877-25G);蘇木素(Sigma公司,批號(hào):H9627);伊紅(國(guó)藥集團(tuán),批號(hào):71014544);苯甲磺酰氟(100 mM PMSF,Beyotime公司,批號(hào):ST506);RIPA裂解液(強(qiáng))(Beyotime公司,批號(hào):P0013B);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Beyotime公司,批號(hào):P0010);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×,Beyotime公司,批號(hào):P0015);SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(Beyotime公司,批號(hào):P0012A);化學(xué)發(fā)光底物(ECL,Thermo Fisher公司,批號(hào):NCI5079);預(yù)染蛋白Marker(10-250KD,Thermo Fisher公司,批號(hào):26619-1);PVDF膜(Millipore公司,批號(hào):IPVH00010);Wnt3a單抗(proteintech公司,批號(hào):26744-1-AP)、GAPDH單抗(proteintech公司,批號(hào):60004-1-Ig)、羊抗兔IgG二抗(proteintech公司,批號(hào):SA00001-2)、羊抗鼠IgG二抗(proteintech公司,批號(hào):SA00001-1);MAP-2單抗(Abcam公司,批號(hào):ab96378);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。JJ124BC電子分析天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠),XR-6C小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀(上海欣軟信息科技有限公司),TOPO 220呼吸麻醉機(jī)(美國(guó)Kent公司),BioSpec 70/20USR小動(dòng)物磁共振成像儀(德國(guó)Bruker公司),RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司),JB-P5組織包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),JK-6生物組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),BX53生物顯微鏡(奧林巴斯株式會(huì)社),HI650臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司),DYCZ-40G轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠),ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司),EnSpire?多模式微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)PerkinElmer公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 取10只大鼠作為假手術(shù)組,其余大鼠參考改良的Longa線栓法[12]制備大腦中動(dòng)脈栓塞局灶性腦缺血再灌注模型。具體方法:術(shù)前12 h禁食不禁水,室溫環(huán)境下,大鼠經(jīng)10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥位固定,頸部備皮消毒后沿正中切開(kāi)約4 cm,逐層鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈的近心端,微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉遠(yuǎn)心端頸內(nèi)動(dòng)脈血流,用手術(shù)剪在頸外動(dòng)脈近頸總動(dòng)脈分叉1 cm處剪一斜細(xì)切口,移去頸內(nèi)動(dòng)脈動(dòng)脈夾,將帶有圓形尖端的6-0尼龍絲線經(jīng)頸外動(dòng)脈殘端向顱內(nèi)頸內(nèi)動(dòng)脈方向緩緩?fù)七M(jìn)18～20 mm,微感阻力即停止。此時(shí)提示栓線已穿過(guò)較細(xì)的大腦中動(dòng)脈起始部阻斷了血流,結(jié)扎切口固定線栓,消毒逐層縫合,待缺血2 h后緩慢拔出線栓恢復(fù)再灌注。大鼠手術(shù)蘇醒后出現(xiàn)明顯偏癱癥狀、身體傾斜、爬行旋轉(zhuǎn)等視為造模成功。假手術(shù)組僅動(dòng)脈分離,不進(jìn)行線栓處理,余操作同上。將造模成功后的SD大鼠隨機(jī)分為模型組、尼莫地平組、天珠散低劑量組、天珠散中劑量組、天珠散高劑量組,每組16只。于造模12 h后,按照文獻(xiàn)[13]計(jì)算給藥量,尼莫地平組給予尼莫地平(溶于蒸餾水中)20 mg/kg灌胃,天珠散低、中、高劑量組分別給予天珠散(溶于蒸餾水中)300 mg/kg、600 mg/kg、1 200 mg/kg灌胃,假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水灌胃,灌胃量均為10 mL/kg,均1次/d,連續(xù)10 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1神經(jīng)功能缺損程度 參照Longa評(píng)分法(評(píng)分范圍0～5分)[14]分別于灌胃第1天、第3天、第5天、第7天、第10天(當(dāng)天灌胃后2 h)對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評(píng)估。0分:活動(dòng)正常,無(wú)神經(jīng)缺損表現(xiàn);1分:損傷對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展;2分:損傷對(duì)側(cè)前肢呈蜷曲態(tài),輕度轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)向損傷對(duì)側(cè)傾倒;4分:無(wú)自發(fā)行走,意識(shí)模糊;5分:死亡。排除0分和5分的大鼠,評(píng)分越高代表神經(jīng)功能缺損越重。

1.5.2運(yùn)動(dòng)和共濟(jì)水平 采用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)(檢測(cè)嚙齒類動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的簡(jiǎn)便方法,正常大鼠可在旋轉(zhuǎn)加速的橫桿上不斷行走,而腦缺血大鼠因神經(jīng)功能缺損則會(huì)墜落[15])評(píng)估各組大鼠的運(yùn)動(dòng)和共濟(jì)水平。大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練3 d后進(jìn)行正式測(cè)試:各組隨機(jī)選取5只大鼠,分別于灌胃第1天、第3天、第5天、第7天、第10天(當(dāng)天灌胃后2 h)置于轉(zhuǎn)棒疲勞儀的旋轉(zhuǎn)桿上,5個(gè)隔室中同時(shí)各放1只,接通電源,設(shè)定轉(zhuǎn)速30 r/min,轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)間1 min,中途間隔休息10 s,連續(xù)測(cè)定5次,記錄大鼠從開(kāi)始轉(zhuǎn)動(dòng)至墜落時(shí)在轉(zhuǎn)棒桿上的停留時(shí)間。

1.5.3腦梗死體積 采用MRI掃描和TTC染色測(cè)定各組大鼠腦梗死體積。

1.5.3.1MRI掃描 末次灌胃2 h后,各組隨機(jī)取1只大鼠,吸入3%異氟烷麻醉后,仰臥位固定于掃描床,送入單通道大鼠線圈中心,利用7.0T動(dòng)物磁共振成像儀行T2加權(quán)成像(T2WI)動(dòng)態(tài)檢測(cè)腦缺血梗死損傷情況。實(shí)驗(yàn)中保持異氟烷接入大鼠呼吸面罩中,并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其呼吸頻率。參考文獻(xiàn)[16-17]設(shè)置T2WI掃描參數(shù):采用快速自旋回波序列,回波時(shí)間(TE)=12 ms,重復(fù)時(shí)間(TR)=2 000 ms,重復(fù)1次,反轉(zhuǎn)角(FA)=180°,矩陣(Matrix)=256×256,視野(FOV)=2 cm×2 cm,層厚1 mm,層數(shù)10。掃描完成將MRI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Para Vision 5.1工作站處理。

1.5.3.2TTC染色 末次灌胃2 h后,各組隨機(jī)取5只大鼠,予以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,立即斷頭取腦,置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min。切除嗅球、小腦及低位腦干,于視交叉冠狀面連續(xù)切分5張2 mm厚的腦片。將切片輕放入2%TTC染色液中,37 ℃避光孵育15 min,不時(shí)用鑷子翻動(dòng)使切片充分接觸染色均勻。再以4%多聚甲醛溶液固定24 h,取出濾紙吸干并拍照。正常腦組織線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶與TTC反應(yīng)呈鮮紅色,而腦缺血梗死部位因脫氫酶活性缺失不能反應(yīng)呈蒼白色。應(yīng)用Image J軟件測(cè)定每層切片腦梗死面積,計(jì)算各組大鼠腦梗死體積比。腦梗死體積比=(S1+S2+……+Sn)H/(S1’+S2’+……+Sn’)H×100%,Sn為每層梗死區(qū)面積,Sn’為每層腦片面積,H為層厚。

1.5.4腦組織HE染色病理形態(tài) 末次灌胃2 h后,各組隨機(jī)取3只大鼠,予以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,立即斷頭取腦,PBS緩沖液清洗2次,4%多聚甲醛溶液4 ℃下繼續(xù)固定24 h。固定后的腦組織經(jīng)梯度濃度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(厚4μm)及脫蠟后,即行HE染色(蘇木素染液5～7 min、伊紅染液2 min)。切片脫水透明,風(fēng)干后中性樹(shù)膠封片,置于顯微鏡下觀察。

1.5.5腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白表達(dá)情況采用 Western blot法檢測(cè):末次灌胃2 h后,各組隨機(jī)取5只大鼠,予以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,立即斷頭取腦置于液氮罐中速凍,-80 ℃冰箱備存。剪取約0.1 g腦組織樣品研磨,加入RIPA進(jìn)行冰上組織裂解及PMSF勻漿提取總蛋白,并于4 ℃下12 000 r/min離心5 min,BCA法對(duì)其上清進(jìn)行蛋白定量。將提取的蛋白上清與蛋白上樣緩沖液(5×)金屬浴5 min變性,取25 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入Wnt3a和MAP-2一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜(3×10 min),再將PVDF膜放入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000)中,室溫?fù)u床孵育1 h,同樣TBST洗膜(3×10 min),ELC化學(xué)發(fā)光液曝光顯影,凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。應(yīng)用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠Longa評(píng)分比較 假手術(shù)組大鼠均評(píng)0分;各造模組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷,各組間灌胃第1天、第3天的Longa評(píng)分比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),但隨時(shí)間的延長(zhǎng),各組Longa評(píng)分呈下降趨勢(shì);其中尼莫地平組灌胃第5天、第7天、第10天的Longa評(píng)分,天珠散高劑量組灌胃第7天、第10天的Longa評(píng)分和天珠散中劑量組灌胃第10天的Longa評(píng)分均明顯低于同期模型組(P均<0.05),而天珠散低劑量組各時(shí)間點(diǎn)的Longa評(píng)分與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);各給藥組間比較,僅天珠散低劑量組灌胃第10天的Longa評(píng)分明顯高于尼莫地平組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 腦缺血再灌注各組大鼠神經(jīng)功能Longa評(píng)分分)

2.2各組大鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間比較 模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間均明顯短于假手術(shù)組(P均<0.05);尼莫地平組和天珠散高劑量組大鼠灌胃第3天、第5天、第7天、第10天的轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間和天珠散中劑量組灌胃第5天、第7天、第10天的轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間均明顯長(zhǎng)于同期模型組(P均<0.05),天珠散低劑量組大鼠各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間與模型組比較呈上升趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);各給藥組間比較,僅天珠散低劑量組灌胃第3天的轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間明顯短于尼莫地平組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間比較

2.3各組大鼠腦梗死體積比較 MRI掃描顯示,假手術(shù)組大鼠T2WI成像無(wú)異常高信號(hào)影,余各組大鼠則呈現(xiàn)不同程度范圍的異常高信號(hào)影成像,見(jiàn)圖1。TTC染色顯示,假手術(shù)組大鼠無(wú)白色梗死組織;模型組大鼠見(jiàn)明顯白色梗死組織,腦梗死體積比為(25.24±4.07)%;尼莫地平組和天珠散低、中、高劑量組大鼠腦梗死體積比分別為(14.23±4.58)%、(24.13±3.29)%、(17.97±5.33)%、(14.13±5.79)%,除天珠散低劑量組,其余各給藥組的腦梗死體積比均明顯低于模型組(P均<0.05),尼莫地平組大鼠腦梗死體積比明顯低于天珠散低劑量組(P<0.05),與天珠散中、高劑量組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織MRI成像情況

圖2 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織TTC染色情況

2.4各組大鼠腦組織病理學(xué)形態(tài)比較 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊緊密,層次較多,皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)正常,胞核居中,核仁清晰,胞漿豐富,分布密集,未見(jiàn)明顯神經(jīng)細(xì)胞炎性浸潤(rùn)或壞死;模型組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列稀疏紊亂,皮質(zhì)出現(xiàn)水腫和壞死,神經(jīng)元腫脹或萎縮脫失,空泡樣改變,胞膜輪廓不清,胞體皺縮,胞核深染;各給藥組缺血側(cè)腦組織病理形態(tài)學(xué)變化較模型組有所減輕,神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則,空泡樣變和壞死數(shù)相對(duì)減少,核仁完整,其中尼莫地平組和天珠散高劑量組改善更明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.5各組大鼠腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白表達(dá)情況比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織中Wnt3a蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05),MAP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠腦組織中Wnt3a蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),MAP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);尼莫地平組大鼠腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量較天珠散低、中劑量組變化更明顯(P均<0.05),僅天珠散高劑量組大鼠腦組織中Wnt3a蛋白相對(duì)表達(dá)量與尼莫地平組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白表達(dá)情況

3 討 論

中醫(yī)學(xué)將腦卒中歸屬于“中風(fēng)”,認(rèn)為“風(fēng)、火、痰、瘀、虛”導(dǎo)致的本虛標(biāo)實(shí)是其主要病機(jī),肝腎陰虛、氣血衰少等“本虛”極易引起氣血津液運(yùn)行不暢,以致血瘀、痰毒等“標(biāo)實(shí)”互生,由此毒邪侵襲,腦絡(luò)受損累及神明[18-19]。傳統(tǒng)中藥防治腦卒中積累了豐富實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),20世紀(jì)80年代湖北恩施地區(qū)中藥資源普查發(fā)掘出散在民間的天珠散,《土家醫(yī)方劑學(xué)》謂之為“神衰癥風(fēng)痰型而設(shè)”,具有鮮明的地域性、民族性[20]。處方中的頭頂一顆珠被譽(yù)為“神農(nóng)架四大瑰寶”,極具道地性,乃治療頭痛眩暈之圣藥,具有鎮(zhèn)靜安神、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛和改善腦缺血等藥理作用[21-22];另一配伍天麻息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò),具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、改善記憶、神經(jīng)保護(hù)及增強(qiáng)免疫等藥理作用[23]。土家民族醫(yī)學(xué)對(duì)腦中風(fēng)“玍毒內(nèi)生,腦筋不用”病機(jī)的獨(dú)特理解與中醫(yī)經(jīng)典理論實(shí)則契合,天珠散通過(guò)祛風(fēng)散痰、解毒通絡(luò)達(dá)到腦府得養(yǎng)、神明自復(fù)的功效。

本研究借鑒經(jīng)典Longa線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,采用神經(jīng)功能缺失評(píng)分評(píng)估亞急性期(數(shù)小時(shí)至數(shù)天)神經(jīng)功能缺損程度,結(jié)果顯示造模后大鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能損傷,但隨時(shí)間的延長(zhǎng),各組大鼠Longa評(píng)分呈下降恢復(fù)趨勢(shì),說(shuō)明在動(dòng)物腦梗死后期有自發(fā)性好轉(zhuǎn)傾向,這可能由于嚙齒類動(dòng)物自身神經(jīng)再生修復(fù)性強(qiáng),部分皮質(zhì)區(qū)血液重新分配和代償,使處于缺血半暗帶的腦組織代謝和功能得到局部恢復(fù)[24]。另外天珠散高劑量組灌胃第7天、第10天的Longa評(píng)分和天珠散中劑量組灌胃第10天的Longa評(píng)分均明顯低于同期模型組,說(shuō)明一定劑量的天珠散能夠促進(jìn)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

運(yùn)動(dòng)障礙是腦卒中最常見(jiàn)的后遺癥之一,因此行為學(xué)測(cè)試中設(shè)置轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)和共濟(jì)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,天珠散能不同程度延長(zhǎng)腦缺血再灌注損傷大鼠的轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間,從宏觀行為學(xué)上表明天珠散具有保護(hù)神經(jīng)功能作用。

歐洲卒中組織(ESO)發(fā)布的《急性缺血性腦卒中靜脈溶栓指南(2021版)》中強(qiáng)調(diào)指出高級(jí)腦成像(顱腦MRI或CTP)為癥狀診斷發(fā)作或醒后卒中是否啟用阿替普酶靜脈溶栓治療的重要依據(jù)[25]。本研究結(jié)合高空間分辨率的MRI動(dòng)態(tài)影像和TTC染色結(jié)果顯示天珠散能有效降低腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積,客觀表明天珠散可抗腦缺血再灌注損傷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的灰質(zhì)主要由神經(jīng)元的胞體樹(shù)突組成,主導(dǎo)神經(jīng)中樞的高級(jí)功能如語(yǔ)言、思維、運(yùn)動(dòng)等;白質(zhì)由神經(jīng)元髓鞘包圍的軸突組成,負(fù)責(zé)大腦的神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng);海馬則是腦內(nèi)參與記憶貯存功能的重要部分,與認(rèn)知關(guān)系密切;肢體癱瘓、言語(yǔ)不清、認(rèn)知障礙等癥狀均與這些部位腦缺血損傷息息相關(guān)。本研究HE染色結(jié)果從微觀病理學(xué)上表明天珠散能減輕缺血腦組織的病理?yè)p傷。

Wnt信號(hào)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和成熟過(guò)程中重要的調(diào)控信號(hào)通路之一,腫瘤、心腦血管疾病、衰老等諸多疾病的病理生理機(jī)制都與此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式有經(jīng)典Wnt/β-catenin、平面細(xì)胞極性(PCP)和Wnt/Ca2+3種途徑,而神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖分化主要由經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑調(diào)控,其影響涉及神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)、神經(jīng)血管單元重塑和維持血腦屏障穩(wěn)態(tài)等過(guò)程[6]。通路啟動(dòng)因子Wnt蛋白包含Wnt1和Wnt5a兩個(gè)亞族,Wnt3a則是激活經(jīng)典途徑配體Wnt1家族重要成員[26]。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí),Wnt配體蛋白與跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled)及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP5/6)結(jié)合,通過(guò)募集胞質(zhì)中的散亂蛋白(Dishevelled)拮抗糖原合成酶激酶3β、APC和Axin蛋白形成降解復(fù)合物(GSK-3β/APC/Axin)以此阻斷β-catenin磷酸化降解,胞質(zhì)中聚集的游離β-catenin進(jìn)入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子家族(TCF/LEF)結(jié)合,特異性啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的調(diào)控[6,27]。MAP-2作為神經(jīng)細(xì)胞骨架成分,既是一種結(jié)構(gòu)蛋白又是功能蛋白,主要在神經(jīng)元胞體、樹(shù)突和突觸后致密區(qū)表達(dá),其在神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)樹(shù)突生長(zhǎng)和突觸可塑性等重要功能[28],決定著修復(fù)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)發(fā)生作用。目前研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)與骨形成蛋白在神經(jīng)分化過(guò)程中發(fā)揮重要協(xié)同作用,Wnt3a蛋白不同活性時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化則表現(xiàn)不同,當(dāng)Wnt3a活性下調(diào)時(shí),神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和血小板源生長(zhǎng)因子(PDGFR)標(biāo)記陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化被抑制,轉(zhuǎn)向MAP-2標(biāo)記陽(yáng)性的神經(jīng)元和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)標(biāo)記陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[29]?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞通過(guò)攝取谷氨酸、清除氧自由基和分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等方式保護(hù)神經(jīng)元[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Wnt信號(hào)在大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷刺激下介導(dǎo)Wnt3a蛋白應(yīng)激性高表達(dá),同時(shí)誘導(dǎo)缺損神經(jīng)元MAP-2蛋白表達(dá)降低,神經(jīng)元細(xì)胞骨架遭破壞,軸突條索斷裂,軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降;天珠散干預(yù)后Wnt3a蛋白表達(dá)降低而MAP-2蛋白表達(dá)增加,說(shuō)明其通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt3a與MAP-2蛋白表達(dá)影響Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),繼而調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化和突觸重構(gòu)。

綜上所述,天珠散能降低腦缺血再灌注大鼠Longa評(píng)分和腦梗死體積,延長(zhǎng)轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間,促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)并減輕缺血腦組織的病理?yè)p傷程度,整體發(fā)揮抗腦缺血再灌注神經(jīng)功能缺損的作用,其機(jī)制可能與調(diào)控Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵效應(yīng)分子Wnt3a及MAP-2蛋白的表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖分化,穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改善突觸功能重塑有關(guān)。但除Wnt/β-catenin信號(hào)通路外,諸如PI3K/Akt、AMPK、NF-κB、Notch/Nrf2等其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也參與調(diào)控腦缺血再灌注損傷病理生理過(guò)程中的能量代謝、細(xì)胞焦亡、信號(hào)傳遞及神經(jīng)炎性[31],天珠散促進(jìn)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)保護(hù)尚需多機(jī)制、多靶點(diǎn)切入研究。同時(shí),行為學(xué)測(cè)試僅根據(jù)評(píng)分量表和肢體運(yùn)動(dòng)的簡(jiǎn)單反射觀察,難以全面反映腦缺血大鼠在運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、情感等方面的缺失,建立基于中醫(yī)證候下模擬卒中因素的高血壓、糖尿病等品系動(dòng)物復(fù)合模型及綜合評(píng)價(jià)體系可能更具臨床指導(dǎo)性。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。