潘藝亭,葉潤根,趙志輝,姜 平

(廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 湛江 524088)

中國是鴨飼養(yǎng)大國,飼養(yǎng)量約占世界總量的75%[1]。其中地方鴨種資源豐富,但地方品種的繁殖力較低[2],農(nóng)民養(yǎng)殖數(shù)量增加,但是產(chǎn)出效率卻在減少[3],因此減少地方品種資源流失是亟需解決的問題。雷州黑鴨是中國雷州半島廣泛分布的鴨品種,具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、產(chǎn)蛋高峰期長、蛋齡早、蛋中微量元素豐富、耐粗飼等特點(diǎn)[4]。作為一個(gè)優(yōu)質(zhì)的地方鴨品種,其遺傳多樣性是提高肉蛋性能和環(huán)境適應(yīng)性的優(yōu)良遺傳材料。然而,由于農(nóng)民普遍的自由放養(yǎng),商業(yè)鴨苗隨機(jī)生產(chǎn),缺乏規(guī)范的人工選育繁殖系統(tǒng),導(dǎo)致個(gè)體品種和羽毛顏色的差異較大。而不穩(wěn)定的遺傳和產(chǎn)蛋數(shù)量與質(zhì)量的下降使雷州黑鴨在市場競爭中處于不利地位。

依托泊苷誘導(dǎo)的2.4蛋白(etoposide-induced 2.4 protein,EI24),又稱p53 誘導(dǎo)基因(p53-induced gene 8,PIG8),編碼一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的六跨膜蛋白。有研究者發(fā)現(xiàn),EI24可抑制細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5],且EI24的缺失抑制DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[6]。DNA損傷時(shí),細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)多種反應(yīng)途徑,以激活DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯和凋亡[7],而DNA損傷反應(yīng)可導(dǎo)致基因突變和癌癥發(fā)展[8]。其中DNA損傷反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵角色是腫瘤抑制因子p53,在重度DNA損傷時(shí)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。而EI24表達(dá)受到腫瘤抑制蛋白p53的高度誘導(dǎo)[10],并且在各種癌癥中發(fā)現(xiàn)EI24經(jīng)常丟失或突變[11-12]。有研究[13]通過免疫共沉淀和其他體外和體內(nèi)EI24-Bcl-2的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合測定分析表明,EI24利用其N端區(qū)域結(jié)合Bcl-2中的BH3結(jié)構(gòu)域[14],進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。此外,免疫組織化學(xué)分析表明,EI24的缺失與乳腺腫瘤的侵襲性有關(guān)[14]。這些結(jié)果表明,EI24的誘導(dǎo)有助于細(xì)胞凋亡過程,目前主要被認(rèn)為是用于防止腫瘤擴(kuò)散[15],這與其一開始作為腫瘤抑制因子的作用一致,同時(shí)EI24的mRNA在高低產(chǎn)雷州黑鴨卵巢中的差異表達(dá),可能通過影響卵泡閉鎖過程,進(jìn)而影響雷州黑鴨的繁殖性狀。

本試驗(yàn)初步探討EI24基因的遺傳多態(tài)性與雷州黑鴨產(chǎn)蛋性能的關(guān)系,采用直接測序的方法驗(yàn)證EI24基因的相關(guān)分子標(biāo)記,為挖掘相關(guān)遺傳標(biāo)記在雷州黑鴨的標(biāo)記輔助選擇提供依據(jù),為進(jìn)一步構(gòu)建雷州黑鴨高產(chǎn)核心群奠定基礎(chǔ)。[11]

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物300日齡雷州黑鴨92只來自于湛江市坡頭區(qū)某養(yǎng)殖場的F4代基礎(chǔ)群。頸靜脈采血2 mL,用肝素抗凝管收集后,-20℃保存?zhèn)溆靡蕴崛⊙夯蚪MDNA。

1.2 主要試劑及儀器血液DNA提取試劑盒,購自廣州美基生物科技有限公司;瓊脂糖,購自博格林生物有限公司;Taq Master Mix,購自諾唯贊公司;凝膠成像系統(tǒng),購自上海天能科技有限公司;快速梯度PCR儀,購自美國ABI公司。

1.3 全基因組DNA提取采用美基DNA提取試劑盒提取血液DNA,步驟參照試劑盒說明書,使用濃度分析儀檢測DNA濃度和純度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA混池構(gòu)建隨機(jī)挑選50個(gè)DNA樣品進(jìn)行等量混合,制備成DNA混池樣品。

1.5 引物設(shè)計(jì)根據(jù)Ensemble數(shù)據(jù)庫提供的EI24基因組序列(ENSAPLG00030007779),使用Primer 5.0軟件進(jìn)行EI24基因的引物設(shè)計(jì),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成:上游引物:5′-GCCTTTGCTGTCGTGATAT-3′;下游引物:5′-ATGTTCCCGTCACCTACCT-3′;

1.6 目的基因PCR擴(kuò)增及驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系20 μL:DNA模板1 μL,Green Taq Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O 8 μL。

PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性15 s,50℃退火15 s,72℃延伸50 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。

進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 雷州黑鴨EI24基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證PCR擴(kuò)增雷州黑鴨EI24基因產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示,PCR產(chǎn)物擴(kuò)增特異性良好,條帶清晰,可直接用于測序鑒定(圖1)。

1～6.為隨機(jī)6個(gè)血樣DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M.DNA Marker

2.2 測序結(jié)果EI24基因PCR擴(kuò)增后,通過引物在內(nèi)含子5中發(fā)現(xiàn)了共7處SNP位點(diǎn),分別為I5-17 G>T、I5-59 G>A、I5-110 T>A、I5-159 G>A、I5-166 G>A、I5-256 C>A、I5-385 C>T。7個(gè)SNPs的每種基因型測序結(jié)果如圖2～8所示。

1～3.基因型分別為GG、GT、TT的個(gè)體

1～3.基因型分別為GG、GA、AA的個(gè)體

1～3.基因型分別為TT、TA、AA的個(gè)體

1～3.基因型分別為GG、GA、AA的個(gè)體

1～3.基因型分別為GG、GA、AA的個(gè)體

2.3 EI24基因7個(gè)SNP位點(diǎn)的群體遺傳特性EI24基因中的7個(gè)SNP位點(diǎn)的群體遺傳特性見表1。

表1 EI24基因7個(gè)SNPs的群體遺傳特性

2.4 EI24基因SNPs與雷州黑鴨產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性分析使用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析對(duì)EI24基因SNPs基因型進(jìn)行多重比較,結(jié)果如表2所示,在I5-17 G>T位點(diǎn)中,TT型的開產(chǎn)日齡顯著高于GT型(P<0.05);在I5-59 G>A和I5-159 G>A位點(diǎn)中,AA型的開產(chǎn)日齡均顯著高于GA型(P<0.05);在I5-110 T>A位點(diǎn)中,AA型的開產(chǎn)日齡顯著高于TA型(P<0.05);在I5-256 C>A位點(diǎn)中,AA型的開產(chǎn)日齡顯著高于CA型(P<0.05);在I5-166 G>A位點(diǎn)中,GG型的開產(chǎn)體質(zhì)量極顯著低于AA型(P<0.01),顯著低于GA型(P<0.05);在I5-385 C>T位點(diǎn)中,CC型的開產(chǎn)體質(zhì)量極顯著低于TT和TC型(P<0.01);7個(gè)SNPs均對(duì)開產(chǎn)蛋質(zhì)量和300 d產(chǎn)蛋量無顯著影響(P>0.05)。

表2 EI24基因7個(gè)SNPs與雷州黑鴨產(chǎn)蛋性能相關(guān)性分析

由以上結(jié)果可見,I5-17 G>T、I5-59 G>A、I5-110 T>A、I5-159 G>A和I5-256 C>A這5個(gè)位點(diǎn)均與雷州黑鴨開產(chǎn)日齡顯著相關(guān);I5-166 G>A和I5-385 C>T這2個(gè)位點(diǎn)均與雷州黑鴨開產(chǎn)體質(zhì)量極顯著相關(guān),說明這7個(gè)SNPs可能對(duì)提高雷州黑鴨的開產(chǎn)日齡和開產(chǎn)體質(zhì)量有重要參考價(jià)值。

2.5 EI24基因單倍型與雷州黑鴨產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)分析使用HaploView 4.2軟件對(duì)7個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析,如圖9和表3所示,結(jié)果顯示I5-17 G>T、I5-59 G>A、I5-110 T>A、I5-159 G>A、I5-166 G>A、I5-256 C>A和I5-385 C>T這7個(gè)位點(diǎn)都存在強(qiáng)連鎖遺傳,7個(gè)位點(diǎn)構(gòu)成了一個(gè)結(jié)構(gòu)域,共有10種不同的單倍型,其中只有7種單倍型有生物學(xué)統(tǒng)計(jì)意義(個(gè)體數(shù)大于3)分別為H1H1(GGGGTTGGAACCTT)、H1H2(GTGATAGA-AACATT)、H1H3(GGGGTTGGAGCCTC)、H1H4(GGGGTTGGAACCTC)、H2H2(TTAAAAAAAAAATT)和H2H3(GTGATAGAGACACT)、H3H3(GGGGTTGGGGCCCC)。

表3 EI24基因單倍型頻率

圖9 EI24基因7個(gè)SNPs位點(diǎn)連鎖反應(yīng)

使用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析對(duì)EI24基因SNPs單倍型進(jìn)行多重比較,結(jié)果如表4所示,H1H4單倍型的開產(chǎn)日齡顯著低于H1H1和H2H2單倍型(P<0.05);H3H3單倍型的開產(chǎn)體質(zhì)量顯著低于H1H2、H1H4和H2H2單倍型(P<0.05),并極顯著低于H1H1和H1H3單倍型(P<0.01);H1H4單倍型的300 d產(chǎn)蛋量顯著高于H1H2單倍型(P<0.05)。7個(gè)單倍型均對(duì)開產(chǎn)蛋質(zhì)量無顯著影響(P>0.05)。

表4 EI24基因單倍型與雷州黑鴨產(chǎn)蛋性能相關(guān)性分析

3 討論

3.1 雷州黑鴨EI24基因遺傳多態(tài)性近年來有越來越多的研究人員關(guān)注基因多態(tài)性對(duì)雷州黑鴨產(chǎn)蛋性能的影響,ASIAMAH等[16]采用直接測序法對(duì)雷州黑鴨ESR2基因的遺傳多態(tài)性及產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)g.56805646 T>C和exon 3-20 G>A位點(diǎn)與開產(chǎn)蛋質(zhì)量顯著相關(guān)。張少偉等[17]使用PCR-SSC方法檢測到雷州黑鴨FSHβ基因g.1103451A>T位點(diǎn)的TT型開產(chǎn)日齡均顯著低于AA和AT型,而開產(chǎn)體質(zhì)量和300日齡產(chǎn)蛋數(shù)則顯著高于AA型,提示該位點(diǎn)可能促進(jìn)早期產(chǎn)蛋和生長發(fā)育而提高雷州黑鴨的產(chǎn)蛋性能。因此,本試驗(yàn)以EI24基因?yàn)檠芯繉?duì)象,采用直接測序法對(duì)EI24基因的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測,并分析EI24基因SNPs或單倍型與雷州黑鴨繁殖性狀的相關(guān)性,在雷州黑鴨EI24基因的內(nèi)含子5中發(fā)現(xiàn)了7處突變位點(diǎn),并相互連鎖,形成強(qiáng)結(jié)構(gòu)域,通過群體遺傳多態(tài)性分析表明群體處于哈代溫伯格平衡。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷州黑鴨EI24基因內(nèi)含子5中的5個(gè)SNPs位點(diǎn)均與開產(chǎn)日齡顯著相關(guān),2個(gè)SNPs位點(diǎn)均與開產(chǎn)體質(zhì)量極顯著相關(guān),提示EI24基因可作為雷州黑鴨開產(chǎn)日齡與開產(chǎn)體質(zhì)量相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記。

3.2 雷州黑鴨EI24基因7個(gè)SNPs位點(diǎn)與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性蛋鴨的開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體質(zhì)量、開產(chǎn)蛋質(zhì)量和產(chǎn)蛋數(shù)是衡量產(chǎn)蛋性能的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)圍繞雷州黑鴨EI24基因,首次發(fā)現(xiàn)了該基因內(nèi)含子5中存在7個(gè)SNPs位點(diǎn),其中I4-17 G>T、I4-59 G>A>T、I4-110 T>A、I4-159 G>A和I4-256 C>A這5個(gè)位點(diǎn)均與雷州黑鴨開產(chǎn)日齡顯著相關(guān);I4-166 G>A和I4-385 C>T這2個(gè)位點(diǎn)均與雷州黑鴨開產(chǎn)體質(zhì)量極顯著相關(guān),說明這7個(gè)SNPs可能對(duì)提高開產(chǎn)日齡和開產(chǎn)體質(zhì)量有重要指導(dǎo)作用。

通過SPSS22.0進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn),開產(chǎn)日齡與開產(chǎn)蛋質(zhì)量之間存在極顯著正相關(guān),與產(chǎn)蛋數(shù)之間存在極顯著負(fù)相關(guān);開產(chǎn)蛋質(zhì)量與產(chǎn)蛋數(shù)之間存在極顯著負(fù)相關(guān);開產(chǎn)體質(zhì)量與開產(chǎn)蛋質(zhì)量之間存在顯著正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋數(shù)與開產(chǎn)體質(zhì)量呈遺傳負(fù)相關(guān)[15],與本次相關(guān)性分析結(jié)果相符,但H1H4單倍型兼具低開產(chǎn)日齡、高開產(chǎn)體質(zhì)量和高產(chǎn)蛋量,因此可以從這7個(gè)SNPs位點(diǎn)的優(yōu)勢基因型中篩選出低開產(chǎn)日齡、低開產(chǎn)體質(zhì)量和高產(chǎn)蛋量的個(gè)體,從而提高產(chǎn)蛋性能和經(jīng)濟(jì)效益。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷州黑鴨EI24基因中I5-17 G>T的GT型、I5-59 G>A與I5-159 G>A的GA型、I5-110 T>A的TA型和I5-256 C>A的CA型可作為低開產(chǎn)日齡的優(yōu)勢基因型;I5-166 G>A的GG型和I5-385 C>T的CC型可作為低開產(chǎn)體質(zhì)量的優(yōu)勢基因型,為雷州黑鴨分子標(biāo)記輔助育種及建立優(yōu)勢高產(chǎn)群體奠定了理論基礎(chǔ)。

3.3 雷州黑鴨EI24基因的單倍型與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性由于SNP分析只能發(fā)現(xiàn)保守和非保守分子功能有關(guān)的基因,而不能識(shí)別相互作用的等位基因連鎖遺傳,目前更多研究者通過群體結(jié)構(gòu)和個(gè)體間差異性關(guān)聯(lián)的連鎖不平衡(LD)選育[18]。因此,本試驗(yàn)使用HaploView4.2軟件對(duì)雷州黑鴨EI24基因的7個(gè)SNPs進(jìn)行了連鎖不平衡分析以及使用SPSS 22.0軟件對(duì)雷州黑鴨EI24基因的7個(gè)SNPs的單倍型進(jìn)行單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)H1H4單倍型可作為雷州黑鴨群體篩選低開產(chǎn)日齡、高開產(chǎn)體質(zhì)量和高產(chǎn)蛋量個(gè)體的綜合最優(yōu)單倍型,為雷州黑鴨分子標(biāo)記輔助育種及建立優(yōu)勢高產(chǎn)群體提供了依據(jù)。