劉 宇,張忠兵,徐曉楓,蒲云霞,王利平,吳瓊海,琚 波,希尼尼根*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古綜合疾病預(yù)防控制中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010080)

奶牛乳腺炎作為奶牛最常見的流行疾病之一,對動(dòng)物福利和奶業(yè)健康發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。該病的流行可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降、牛奶品質(zhì)下降、抗生素濫用等問題發(fā)生[1-3]。奶牛乳腺炎在我國發(fā)病仍較為頻繁,其中臨床型乳腺炎發(fā)病率為 9.7%～55.6%,隱性乳腺炎發(fā)病率為61.03%～79.62%[4],每年因奶牛乳腺炎所造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)30億元[5]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)作為引起奶牛乳腺炎的主要病原體之一,可在人與動(dòng)物之間交叉?zhèn)鞑ヒl(fā)疾病[6];同時(shí),S.aureus對機(jī)體的免疫逃避機(jī)制和對抗生素的耐藥性導(dǎo)致該病治療復(fù)雜化,致使公共衛(wèi)生和食品安全面臨巨大的挑戰(zhàn)[7-8]。因此及時(shí)準(zhǔn)確鑒定S.aureus對療奶牛乳腺炎預(yù)防、治療和控制具有重要意義。

目前,S.aureus的檢測主要包括傳統(tǒng)的生化鑒定、免疫學(xué)鑒定、分子生物學(xué)和量子點(diǎn)標(biāo)記等鑒定方法[9];傳統(tǒng)生化試驗(yàn)因?yàn)椴僮鬟^程繁雜、時(shí)間過長和結(jié)果偏差大等問題無法滿足微生物的快速鑒定。免疫學(xué)鑒定雖然縮短了檢測時(shí)間,但其工作原理為抗原抗體結(jié)合,易受其他代謝產(chǎn)物影響,假陽性率升高[10-11]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用為S.aureus的快速鑒定提供了幫助,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)作為近些年快速發(fā)展的檢測技術(shù),已經(jīng)廣泛用于微生物快速鑒定、分型和耐藥性檢測;該技術(shù)將表型分析與分子分析有機(jī)結(jié)合起來,通過采集目標(biāo)菌核糖體蛋白質(zhì)獲取特異性的指紋圖譜,將獲取的特異性指紋譜圖與數(shù)據(jù)庫中已有圖譜進(jìn)行比對分析,實(shí)現(xiàn)待測菌株在屬、種水平的鑒定[12-15]。該方法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、高通量和成本低等優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)通過MALDI-TOF MS技術(shù)對乳腺炎奶樣中分離菌株進(jìn)行快速鑒定,同時(shí)選用熒光定量PCR和nuc基因的PCR擴(kuò)增等方法進(jìn)行方法比較,分析MALDI-TOF MS方法在鑒定S.aureus的準(zhǔn)確程度,同時(shí)對鑒定菌株進(jìn)行聚類分型及分析,為奶牛乳房炎的防控和可能污染源的追溯提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源本試驗(yàn)中45株疑似菌株均由奶牛臨床型乳房炎奶樣中分離獲得,3株標(biāo)準(zhǔn)菌株S.aureusATCC29213、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)ATCC35984和大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922均由內(nèi)蒙古疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 主要儀器MALDI-TOF MS 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,購自鄭州安圖生物科技工程公司;PCR擴(kuò)增儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)均購自伯樂公司;熒光定量PCR儀、全自動(dòng)核酸提取儀購自碩世生物科技有限公司。

1.3 主要試劑營養(yǎng)瓊脂(NA)、S.aureus選擇性培養(yǎng)基(BP)和血平板均購自北京路橋技術(shù)股份有限公司;甲酸(FA)、乙腈(ACN)、無水乙醇和三氟乙酸(TFA)由賽默飛世爾公司提供;α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)和細(xì)菌試驗(yàn)校準(zhǔn)品(BTS)由鄭州安圖生物科技工程公司提供;Premix由日本TAKARA公司提供;熒光定量PCR引物和探針、耐熱核酸酶(nuc)擴(kuò)增引物(表1)[16-17]、SDS、Tris均購于上海生工生物工程有限公司;DNA提取試劑盒由碩世生物科技有限公司提供。

表1 引物名稱及序列

1.4 葡萄球菌的分離將呼和浩特地區(qū)13家牧場采集的257份臨床型乳房炎奶樣搖勻后吸取25 mL分別加到225 mL氯化鈉營養(yǎng)肉湯的勻質(zhì)袋中,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中增菌培養(yǎng)18～24 h;將增菌液分別劃線接種到Baird-Parker平板37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h;挑取特征菌落接種到血平板,再次置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。挑取特征菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢后,將獲得的45株葡萄球菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 MALDI-TOF MS 鑒定方法

1.5.1提取法處理 取300 μL去離子水或超純水加入到1.5 mL離心管中,用接種環(huán)刮取待測菌落5～10 mg至離心管中并混勻;向離心管中加入900 μL無水乙醇混勻;14 000 r/min離心4 min,棄上清液后再次離心2 min。用移液槍將殘留液體吸凈,此過程不能接觸沉淀;室溫干燥1～2 min后加入50 μL 70%甲酸,充分混勻;再加50 μL乙腈進(jìn)行混勻;14 000 r/min離心2 min后將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中備用。分別取1 μL待測提取液和細(xì)菌校準(zhǔn)液(BTS)置于MALDI靶板上,室溫晾干后滴加1 μL HCCA基質(zhì)液,待充分晾干后進(jìn)行檢測。

1.5.2MALDI-TOF MS檢測 儀器參數(shù)設(shè)置:線性模式為正離子P采集模式;檢測器2.65 kV,推遲極20 kV,引出極1.9 kV,聚焦極1.00 kV,激光頻率330 Hz,相對分子質(zhì)量范圍2 000～20 000 Da。將載有待測液和校準(zhǔn)液的靶板送入質(zhì)譜儀內(nèi),用采集軟件進(jìn)行特征指紋譜圖的采集,試驗(yàn)開始時(shí)先用校準(zhǔn)液對儀器進(jìn)行校準(zhǔn),校準(zhǔn)通過后開始對待測樣本進(jìn)行采集。將采集的蛋白質(zhì)指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株指紋圖譜比對分析,通過比對質(zhì)核比(m/z)和特征峰得到鑒定結(jié)果;并將采集的指紋圖譜使用分析軟件進(jìn)行聚類分析[18-19]。

1.5.3結(jié)果判定 數(shù)據(jù)庫給出與鑒定菌株最為匹配的10株菌株,并給出相應(yīng)分值及種屬。鑒定分?jǐn)?shù)在9.500～10.000區(qū)間內(nèi),表明該匹配結(jié)果種水平置信及可能的亞種[20];分值在9.000～9.500區(qū)間內(nèi),表明該匹配結(jié)果種水平置信;分值在6.000～9.000區(qū)間內(nèi),表明該匹配結(jié)果屬水平置信;分值在6.000以下,表明該匹配結(jié)果不可置信。

1.6S.aureusnuc基因鑒定按照全自動(dòng)核酸提取儀操作要求,分別提取各待測菌株基因組DNA;對待測菌株進(jìn)行nuc基因PCR擴(kuò)增試驗(yàn),同時(shí)以大腸桿菌(ATCC25922)、S.aureus(ATCC29213)和表葡菌(ATCC35984)做實(shí)驗(yàn)對照。50 μLnuc基因PCR擴(kuò)增體系:Premix(包括緩沖液、氯化鎂、dNTP、聚合酶等)25 μL、DNA模板2 μL、引物nuc-F和nuc-R各2 μL、ddH2O 19 μL;PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min、95℃變性1 min、49℃褪火30 s、72℃延伸20 s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán),72℃總延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行電泳試驗(yàn),陽性產(chǎn)物送至上海進(jìn)行基因測序,將nuc基因序列利用NCBI軟件BLAST進(jìn)行比對。

1.7 熒光定量PCR鑒定將提取好的S.aureus基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系:qPCR SuperMix(包括緩沖液、氯化鎂、dNTP、聚合酶等)10 μL、上、下游引物及探針各0.5 μL、DNA模板2 μL,補(bǔ)雙蒸水至20 μL;反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃ 3 min;95℃ 5 s、55℃ 60 s,再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。Ct值≤36則判定為陽性。

2 結(jié)果

2.1 MALDI-TOF MS 檢測結(jié)果及分析通過采集軟件對45株疑似菌株進(jìn)行圖譜分析,其中43株報(bào)告為S.aureus(表2),檢出率為95.6%(43/45)。其中C2、E1等28株匹配分值大于9.500,表明該匹配結(jié)果種水平置信及可能的亞種;C3、E9等15株匹配分值大于9.000,表明該匹配結(jié)果種水平置信;其余2株L11和F4分析鑒定為產(chǎn)色葡萄球菌。對43株S.aureus的主要離子峰進(jìn)行綜合分析,其主要集中在2 000～10 000 Da區(qū)間內(nèi)。在質(zhì)荷比為(m/z)2 763,3 445,4 816,5 528,6 892,9 633等12處存在特征峰,各菌株特征峰基線平穩(wěn)、重復(fù)性好、響應(yīng)值高,圖譜質(zhì)量較高,如圖1所示。同時(shí)將各菌株特征峰與數(shù)據(jù)庫內(nèi)S.aureus特征峰進(jìn)行比對分析,0軸以上為待鑒定菌株主要特征峰圖譜,0軸以下為數(shù)據(jù)庫S.aureus特征峰圖譜,兩者成鏡像關(guān)系的比率越大,則鑒定為同種菌株的可能性則越大,分值則越高。以R121菌株、ATCC29213為例,比對后得到分值分別為9.554和9.509,說明R121與數(shù)據(jù)庫中S.aureus鏡像比率更高,差異程度更低(圖2)。

A.43株S.aureus特征峰重復(fù)性譜圖;B上.R121菌株質(zhì)譜圖;B下.ATCC29213標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)譜圖

A.R121;B.ATCC29213

M.DL1200 DNA Marker;P.ATCC29213 S.aureus參照菌株;1～13.為表2中1～13號菌株;B.ATCC35984表葡菌參照菌株;N.ATCC25922大腸桿菌參照菌株

2.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果通過熒光定量PCR對45株疑似菌株進(jìn)行檢測,43株檢測結(jié)果為陽性,2株呈陰性,與MALDI-TOF MS和nuc基因PCR擴(kuò)增鑒定一致,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

2.3nuc基因PCR擴(kuò)增及序列分析將45株疑似菌株進(jìn)行nuc基因PCR擴(kuò)增,以S.aureusATCC29213、表皮葡萄球菌ATCC35984、大腸桿菌ATCC25922作為試驗(yàn)對照。43株S.aureus和S.aureusATCC29213均擴(kuò)增出264 bpnuc基因條帶(圖3),與上述2種方法鑒定結(jié)果一致(表2)。表皮葡萄球菌ATCC35984、大腸桿菌ATCC25922、L11和F3未擴(kuò)增出基因條帶。并對L11和F3的菌株進(jìn)行16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增和測序,鑒定為產(chǎn)色葡萄球菌。對擴(kuò)增nuc條帶進(jìn)行BLAST在線比對,親緣關(guān)系均為S.aureusnuc片段,且同源關(guān)系為98.5%～100%。

2.4 MALDI-TOF MS 聚類分析結(jié)果及分析通過對43株S.aureus指紋圖譜進(jìn)行聚類分析,按照特征峰相似性得到樹狀圖,以距離表示同源性關(guān)系,差異程度為0～1 000,數(shù)值越大表明同源性越低。如圖4所示。圖中將43株菌株歸為同一類,這與MALDI-TOF MS鑒定的結(jié)果一致,同時(shí)圖4直觀的體現(xiàn)了43株S.aureus的相關(guān)性及同源性。在差異度800時(shí),可分為2個(gè)型,說明兩型間菌株分子水平差異較大,同源關(guān)系較遠(yuǎn);在差異度500時(shí),主要可分為5個(gè)型,且各型內(nèi)菌株大多數(shù)來源于各自牧場中,說明同一牧場內(nèi)多數(shù)菌株在分子水平差異較小,存在一定程度的同源關(guān)系,為牧場進(jìn)一步對污染源的追溯及防控提供支持。

圖4 43株S.aureus MALDI-TOF MS 聚類分析圖

3 討論

MALDI-TOF MS作為近期發(fā)展的一種微生物快速鑒定的方法,是對傳統(tǒng)和分子鑒定方法的補(bǔ)充,其原理是通過獲取細(xì)菌特異性蛋白圖譜與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜進(jìn)行分析比較,獲得更為準(zhǔn)確和直接的結(jié)果[21]。它具有處理方法簡便、鑒定結(jié)果快速、準(zhǔn)確性高、靈敏度高、高通量和成本低等優(yōu)點(diǎn),使得被廣泛用于醫(yī)療、環(huán)境和食品領(lǐng)域中,但設(shè)備價(jià)格及維護(hù)費(fèi)用高昂致使一些實(shí)驗(yàn)室無法承擔(dān)。其次菌株的培養(yǎng)、基質(zhì)的選擇以及數(shù)據(jù)庫等因素也會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果[22-23]。

本試驗(yàn)中采用MALDI-TOF MS對45株疑似葡萄球菌株進(jìn)行鑒定分析,43株鑒定為S.aureus,均能被鑒定到種水平。其中28株S.aureus匹配分值為大于9.500,占比為65.1%(28/43);15株S.aureus匹配分值大于9.000,占比為34.9%(15/43);與熒光定量PCR和nuc基因PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了MALDI-TOF MS鑒定的可靠性。但基于鑒定時(shí)間和通量而言,熒光定量PCR檢測96個(gè)樣本需要約4h,細(xì)菌保守片段擴(kuò)增測序需要約8-10小時(shí),MALDI-TOF MS約需2 h,且1次最多可以檢測384個(gè)樣本,MALDI-TOF MS鑒定方法效率更高。就鑒定結(jié)果和準(zhǔn)確性而言,3種方法均可以將S.aureus鑒定到種屬,且準(zhǔn)確率為100%。同時(shí),MALDI-TOF MS通過獲得指紋譜圖進(jìn)行聚類分析,根據(jù)菌株之間差異水平進(jìn)行分型,分析各菌株間的親緣關(guān)系,實(shí)現(xiàn)對不同來源的污染菌株進(jìn)行追溯。

綜上,MALDI-TOF MS適用于對S.aureus分離株的快速鑒定,可用于臨床上快速診斷;同時(shí)對S.aureus進(jìn)行快速聚類分析,對于預(yù)防和控制S.aureus引起的奶牛乳腺炎提供了技術(shù)支持。