曹一鳴,溫小慶,付世新

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

圍產(chǎn)期由于能量攝入和輸出的不平衡導(dǎo)致機(jī)體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)。能量負(fù)平衡會導(dǎo)致奶牛機(jī)體脂肪大量動員,引發(fā)高游離脂肪酸(nonestesterified fatty acid,NEFA)血癥,而高NEFA具有脂毒性,能造成圍產(chǎn)期奶牛代謝紊亂、免疫抑制和繁殖障礙等,其中奶牛胎衣不下(retained fetal membranes,RFM)是與其密切相關(guān)的繁殖障礙疾病,高NEFA血癥可增加奶牛患胎衣不下的風(fēng)險[1-2]。

NEFA是由油酸、棕櫚酸(palmitic acid,PA)、硬脂酸及少量花生四烯酸組成的混酸。PA是NEFA中含量最高的飽和脂肪酸,約占NEFA的34%[3],可對Saos-2細(xì)胞、BV2小膠質(zhì)細(xì)胞等的增殖和凋亡造成影響,而且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬也參與了PA導(dǎo)致的Saos-2細(xì)胞的凋亡,具有廣泛的生物學(xué)功能。

奶牛胎衣不下的發(fā)生與細(xì)胞凋亡及機(jī)體抗氧化狀態(tài)密切相關(guān)[4]。氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)通常是由于外界不良刺激的影響下,機(jī)體先天的抗氧化防御機(jī)制被破壞,造成活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增多,從而導(dǎo)致細(xì)胞、組織和器官的抗氧化能力下降,出現(xiàn)生理和病理變化[5]。研究表明PA能夠?qū)粑溤斐善茐?從而導(dǎo)致生物學(xué)功能紊亂引起氧化損傷,而NEFA可以使SOD、GSH-PX等抗氧化酶受到抑制,進(jìn)而導(dǎo)致奶牛OS[6-7]。研究表明PA具有脂毒性,可以破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài),使細(xì)胞內(nèi)的功能發(fā)生紊亂,當(dāng)細(xì)胞長時間處于應(yīng)激狀態(tài)時,就會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。本試驗(yàn)通過研究ROS對PA誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的影響,探討PA在胎衣不下發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料胎牛血清購自杭州四季青公司;青鏈霉素、胰酶、Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、CCK-8試劑盒、ROS檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;RPMI Medium 1640培養(yǎng)基購自Gibco; PA、抗氧化劑(NAC)購自Sigma;超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 奶牛原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)所用的奶牛原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是使用貼壁法培養(yǎng)得到的,經(jīng)純化后,該細(xì)胞的純度可達(dá)90%以上,完全滿足試驗(yàn)所需。原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞傳代至3～8代時活力最佳,所有細(xì)胞試驗(yàn)所用細(xì)胞都在此范圍內(nèi)。

1.3 PA及抗氧化劑(NAC)的制備取3 g牛血清白蛋白(BSA)粉末,加入10 mL超純水后,充分混勻得到30%的BSA儲備液10 mL,將其置于55℃水浴鍋中30 min后備用;將0.035 g氫氧化鉀(KOH)加入到50 mL的超純水中,充分混勻,加入0.16 g的PA,在水浴鍋中加熱到70℃,配制成12.5 mmol/L的PA;在12.5 mmol/L的PA中加入800 μL的30% BSA、1 200 μL的0.05 mmol/L HCl,充分混勻,定容為10 mmol/L PA待用。將2 g NAC粉末加入到24 mL的PBS中配制成500 mmol/L的NAC儲備液待用。

1.4 PA最適添加濃度和時間的篩選添加不同濃度的PA(0,0.2,0.4,0.6,0.8和1 mmol/L)分別刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞6,12 和24 h后檢測細(xì)胞存活率,具體步驟參考CCK-8試劑盒說明。

1.5 細(xì)胞處理將培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞以2×106接種到6孔板,添加正常培養(yǎng)基生長24 h,當(dāng)細(xì)胞生長到80%～90 %時,用新的無血清培養(yǎng)基取代此培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h。對照組:用新的無血清培養(yǎng)基取代原先的細(xì)胞培養(yǎng)基,培養(yǎng)12 h;PA組:將原先的細(xì)胞培養(yǎng)基棄掉后,添加0.6 mmol/L的PA,培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞;PA+NAC組:試驗(yàn)前2 h將原先的細(xì)胞培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基,加入10 mmol/L的NAC儲備液處理2 h,然后添加0.6 mmol/L的PA,培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞;NAC組:將原先的細(xì)胞培養(yǎng)基棄掉后加入10 mmol/L的NAC儲備液,培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞。

1.6 添加PA及NAC后上皮細(xì)胞氧化及抗氧化指標(biāo)的檢測收集各組細(xì)胞,利用SOD測定試劑盒、MDA檢測試劑盒、GSH檢測試劑盒檢測氧化及抗氧化指標(biāo),具體步驟參考說明書。

1.7 添加PA后上皮細(xì)胞ROS含量及細(xì)胞凋亡率的檢測收集細(xì)胞,PBS清洗2次后棄上清,每個樣品添加200 μL 的DCFH重懸,37℃避光孵育20 min后,用無血清培養(yǎng)基清洗2次后上機(jī)檢測ROS含量。收集細(xì)胞,PBS清洗2次后棄上清,每個樣品添加198 μL 1×Binging Buffer 重懸細(xì)胞并添加1 μL的Annexin V-FITC和1 μL的PI,設(shè)單染對照組FITC組(只標(biāo)記FITC)、PI組(只標(biāo)記PI)和空白組(不標(biāo)記),室溫避光孵育15 min后每個樣添加300 μL PBS混勻,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PA對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞存活率的影響分別添加不同濃度的 PA(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L)刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞不同時間(6,12,24 h),比較了PA對細(xì)胞活力的影響。如圖1所示,隨著作用時間的增加,不同濃度的PA組間差異逐漸顯著,并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力與PA的濃度間呈濃度依賴性。當(dāng)作用12 h時組間差異開始明顯,結(jié)合每組細(xì)胞活力下降的顯著性,我們選取12 h作為后續(xù)試驗(yàn)的作用時間。當(dāng)作用時間為12 h時,PA濃度為0.2 mmol/L時細(xì)胞活力下降不明顯,當(dāng)PA濃度為0.4 mmol/L時細(xì)胞活力下降顯著(P<0.05),當(dāng)PA濃度為0.6 mmol/L時細(xì)胞活力極顯著下降(P<0.01)。所以選用0.2,0.4,0.6 mmol/L這3個具有代表性的濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

與對照組比較,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 PA對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ROS含量的影響分別添加不同濃度的 PA(0.2,0.4,0.6 mmol/L)刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞12 h后,如圖2所示,當(dāng)PA濃度為0.4 mmol/L時與對照組相比ROS含量顯著增加(P<0.05),當(dāng)PA濃度為0.6 mmol/L時與對照組相比ROS含量極顯著增加(P<0.01)。

圖2 不同濃度PA對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ROS含量的影響

2.3 PA對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的影響分別添加不同濃度的 PA(0.2,0.4,0.6 mmol/L)刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞12 h后,如圖3所示,當(dāng)PA濃度為0.4 mmol/L時與對照組相比細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05),當(dāng)PA濃度為0.6 mmol/L時與對照組相比細(xì)胞凋亡率極顯著增加(P<0.01)。

圖3 不同濃度PA對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的影響

2.4 抗氧化劑NAC對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞OS的影響如圖4 A所示,與對照組相比,PA組的ROS含量極顯著增加(P<0.01),與PA組相比PA+NAC組ROS含量顯著降低(P<0.05)。如圖4 B、C所示,與對照組相比PA組的SOD活力及GSH含量極顯著下降(P<0.01),與PA組相比PA+NAC組SOD活力及GSH含量極顯著增加(P<0.01)。如圖4D所示,與對照組相比PA組的MDA含量極顯著增加(P<0.01),與PA組相比PA+NAC組MDA含量顯著下降(P<0.05)。

與PA組比較,#表示差異顯著(P<0.05),##表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.5 抗氧化劑NAC對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的影響如圖5所示,與對照組相比PA組的凋亡率極顯著增加(P<0.01),與PA組相比PA+NAC組凋亡率極顯著降低(P<0.01)。

圖5 添加NAC對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

研究證明,體內(nèi)高水平的NEFA會對動物的卵巢和子宮都具有不同程度的損傷,高濃度的NEFA可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生OS,并且通過激活線粒體途徑介導(dǎo)活化半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase-3)從而造成肝細(xì)胞凋亡, NEFA中的PA可以通過激活NF-κB信號通路來誘導(dǎo)IL-8等炎性因子的表達(dá)和釋放,由此可見PA在NEFA中是至關(guān)重要的,由此我們推測PA也可以通過OS對細(xì)胞造成損傷,細(xì)胞凋亡是一種基因控制的細(xì)胞的自主性程序性死亡方式,為了證實(shí)PA誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡,本試驗(yàn)通過CCK-8法檢測了不同濃度PA刺激不同時間的奶牛子宮內(nèi)膜上皮,檢測其存活率并篩選最適濃度,同時采用Annexin V-FITC/PI雙染法證明,當(dāng)PA濃度為0.4 mmol/L時與對照組相比細(xì)胞凋亡率顯著增加,當(dāng)PA濃度為0.6 mmol/L時與對照組相比細(xì)胞凋亡率極顯著增加,結(jié)果表明隨著PA濃度的升高,細(xì)胞的凋亡率逐漸增高,呈明顯的濃度依賴關(guān)系,由此可以說明PA對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞存在一定程度的危害。

介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑有很多種,OS是其中非常重要的一種,奶牛在分娩前期胎盤的成熟至關(guān)重要,盡管成熟的胎盤能夠啟動有利的類固醇生成和花生四烯酸級聯(lián)反應(yīng),但此時抗氧化防御機(jī)制的改變會干擾細(xì)胞的類固醇生成。ROS大量積聚在胎盤,可阻止胎膜的及時分離。體內(nèi)過量的ROS如果未被清除,會導(dǎo)致嚴(yán)重的OS反應(yīng),ROS在RFM中是非常重要的影響因素,所以本試驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了ROS的含量是否會隨著PA濃度的變化而變化,當(dāng)PA濃度為0.4 mmol/L時與對照組相比ROS含量顯著增加,當(dāng)PA濃度為0.6 mmol/L時與對照組相比ROS含量極顯著增加。并且通過試劑盒檢測了SOD、MDA、GSH等氧化抗氧化指標(biāo),結(jié)果表明PA可造成細(xì)胞的OS,并導(dǎo)致ROS的含量升高,對細(xì)胞造成損傷。為了驗(yàn)證ROS的產(chǎn)生是否在PA造成的細(xì)胞凋亡中起主要作用,本試驗(yàn)添加了抗氧化劑NAC,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測了ROS含量和細(xì)胞凋亡程度,結(jié)果表明添加了NAC后,細(xì)胞凋亡程度和ROS含量的上升明顯受到緩解,表明ROS對PA造成的細(xì)胞凋亡起重要的作用,由于ROS的升高會造成炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬等細(xì)胞通路的激活,具體ROS是通過何種途徑導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡尚不清楚。綜上所述,本試驗(yàn)表明PA是NEFA中一種非常重要的酸,對細(xì)胞具有廣泛的作用,因此限制細(xì)胞內(nèi)PA的水平可為酮病及胎衣不下等疾病的治療和預(yù)防提供參考。