張自富,胡 靜,趙 瑜,秦清明,麻冰潔,趙 聘,陳思睿,趙云煥

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院,河南 信陽(yáng) 464000; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

近年來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白已經(jīng)取得了許多突破性進(jìn)展,開創(chuàng)出了誘人、廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。從發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看,在不久的將來(lái)必定會(huì)成為生物工程技術(shù)研究領(lǐng)域最活躍、最具有實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)。最初,哺乳動(dòng)物的乳腺反應(yīng)器被認(rèn)為是一個(gè)最有希望和前途的生物反應(yīng)器之一,可是家畜世代間隔長(zhǎng)、成本高,特別是乳汁中乳蛋白和乳脂肪的生化復(fù)雜性給重組蛋白的純化帶來(lái)許多意想不到的困難[3-4]。與哺乳動(dòng)物相比,禽類具有體格小、成本低、世代周期短、繁殖力高、卵中天然存在蛋白酶抑制劑、良好的無(wú)菌環(huán)境、好儲(chǔ)存、易提純等優(yōu)點(diǎn),特別是卵中表達(dá)的重組蛋白形成的三維結(jié)構(gòu)糖基化更接近于人類蛋白質(zhì)[5]。所以,禽類輸卵管生物反應(yīng)器將逐步成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和生物制藥研究領(lǐng)域中最具活力的熱點(diǎn),并很可能成為未來(lái)最具有競(jìng)爭(zhēng)力的新興高技術(shù)產(chǎn)業(yè)之一。

但是,由于禽類獨(dú)特的生殖、生理特點(diǎn)和胚胎發(fā)育的復(fù)雜性,致使在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)并不適用于禽類[6]。到目前為止,研究報(bào)道較多的是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法制備出了轉(zhuǎn)基因雞,尤其是屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科中的慢病毒,具有容納外源目的基因片段大、可感染非分裂期細(xì)胞、整合到細(xì)胞染色體上并能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)、不易發(fā)生基因沉默、免疫反應(yīng)弱、安全性高等優(yōu)點(diǎn),已逐漸成為轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用廣泛的載體工具之一,也被公認(rèn)為制備轉(zhuǎn)基因禽類最有效和最成功的方法之一[7-9]。近年來(lái),已有利用轉(zhuǎn)基因雞輸卵管生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的研究報(bào)道,包括β-內(nèi)酰胺酶[10]、人干擾素α-2b[11]、人單克隆抗體[12]、單鏈Fv-Fc融合蛋白[13]、治療性蛋白[14]、人溶菌酶[15]、人防御素4[16]等。但是,以上報(bào)道均是將慢病毒注射到發(fā)育第Ⅹ期的胚盤下腔,先生產(chǎn)出性系嵌合體,再生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因個(gè)體。制備轉(zhuǎn)基因家禽的整個(gè)技術(shù)流程繁雜,要求條件很高[17]。另外,也有報(bào)道通過(guò)分離早期雞胚血液或性腺中的原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞,但是PGCs的分離、培養(yǎng)、傳代等關(guān)鍵技術(shù)還一直未能獲得完全突破[18-20]。

艾塞那肽(exenatide)是從墨西哥巨蜥蜴毒液中分離出來(lái)的一種含有39個(gè)氨基酸的多肽序列,相對(duì)分子質(zhì)量4.186 kDa,分子式:C184H282N50O60S,等電點(diǎn)pH4.86。與胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide1,GLP-1)具有53%的同源性,與GLP-1同作用于G-蛋白偶聯(lián)受體,并具有更高的親和力[21]。艾塞那肽是首個(gè)獲準(zhǔn)上市的腸促胰島素類似物抗糖尿病藥物,也是目前為止公認(rèn)最好的治療型糖尿病的首選藥物。在治療Ⅱ型糖尿病方面,具有可促進(jìn)胰島素分泌,保護(hù)β細(xì)胞功能,改善外周胰島素敏感性,減輕體重,保護(hù)肝臟功能,半衰期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)[22]。2012年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市,商品名為百泌達(dá)(Byetta)。

本試驗(yàn)構(gòu)建了一個(gè)雞卵清蛋白基因特異性啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)艾塞那肽的慢病毒表達(dá)載體,包裝出高滴度的慢病毒,利用實(shí)驗(yàn)室早期建立的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞新技術(shù)平臺(tái)——血管顯微注射法[23],簡(jiǎn)便、高效的生產(chǎn)出輸卵管特異性表達(dá)艾塞那肽的轉(zhuǎn)基因雞。該新型技術(shù)平臺(tái)的成功建立,為利用雞輸卵管生物反應(yīng)器天然、高效合成并分泌蛋白的能力,在雞蛋中生產(chǎn)一些具有重要價(jià)值的藥用蛋白,具有廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1 材料與方法

1.1 材料三質(zhì)粒慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)pCSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus、pCAG-HIVgp和pVSV-G-Rsv-Rev為本實(shí)驗(yàn)室所有;人胚腎293T細(xì)胞,快速型人胚腎293T細(xì)胞,Ultra Rapid Lentiviral Titer Kit 購(gòu)自Invitrogen公司;血液及精液基因組提取試劑盒、RNase A酶購(gòu)自天根生物科技有限公司,DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ購(gòu)自羅氏公司;PCR引物合成上海英駿生物技術(shù)有限公司,限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、PstⅠ和HindⅢ購(gòu)自NEB公司。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備均為信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室所有。

1.2 載體構(gòu)建參照GenBank中墨西哥巨蜥蜴艾塞那肽基因的cDNA序列,進(jìn)行密碼子優(yōu)化后化學(xué)合成cDNA(117 bp)序列,連接入T載體;在白來(lái)航雞的基因組中,分別擴(kuò)增雌激素反應(yīng)元件(ERE,675 bp)和卵清蛋白基因(ovalbumin gene,OVA,ID:396058)啟動(dòng)子序列(包括啟動(dòng)子序列、第一外顯子序列、第一內(nèi)含子序列和第二外顯子一部分序列)(2 785 bp)兩種片段[14],連接入T載體中;依次酶切加入各種元件,構(gòu)建于表達(dá)載體pCSⅡ-EF-MCS中,將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒載體pCSⅡ-ERE-OV-EXE進(jìn)行酶切測(cè)序鑒定;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞,初步驗(yàn)證艾塞那肽基因轉(zhuǎn)錄激活功能。

圖1 慢病毒載體pCSⅡ-ERE-OV-EXE結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 慢病毒包裝、滴度測(cè)定將包裝質(zhì)粒pCAG-HIVgp、包膜蛋白質(zhì)粒pCMV-VSV-G-RSV-Rev和表達(dá)載體質(zhì)粒pCSⅡ-ERE-OV-EXE按1∶1∶2的比例應(yīng)用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染匯合率約為70%的293T細(xì)胞。在溫度37℃、3%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h,吸除細(xì)胞上清液,加入7.5 mL含有10 μmol/L Forskolin的完全培養(yǎng)基,在37℃、10%的CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h,收集上清液4℃保存。收集的上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾,濾液50 000 r/min,溫度20℃離心2 h,棄上清,沉淀中加入500 μL HBSS,充分溶解后轉(zhuǎn)移至0.5 mL的超濾管中,14 000 r/min離心30 min,用HBSS清洗2次后,分裝-70℃保存?zhèn)溆谩⒄誙ltra Rapid Lentiviral Titer Kit 試劑盒說(shuō)明測(cè)定病毒滴度。

1.4 血管顯微注射慢病毒將BJ-40細(xì)玻管,規(guī)格為外徑100 μm,內(nèi)徑80 μm,長(zhǎng)度10 cm,在拉針儀拉針后用斷針儀熔斷,外徑為20～30 μm,然后在磨針儀上30度角斜面,快速磨針;在顯微鏡400倍下觀察針尖的完整性;將合格的玻璃針浸泡在75%乙醇中,用抽吸裝置清洗內(nèi)壁5次,在無(wú)水乙醇中清洗5次,置于超凈臺(tái)中晾干紫外照射過(guò)夜待用。

新鮮白來(lái)航雞種蛋取回后,先用0.1%的新潔爾滅溶液清洗,除去表面污跡,然后用70%酒精噴灑消毒,待蛋殼表面晾干后,放進(jìn)孵化器里進(jìn)行孵化,孵化溫度為37.5℃,相對(duì)濕度為55%～65%,90°角,2 h間隔自動(dòng)翻蛋,大約孵化時(shí)間52～55 h,將發(fā)育至14～15期的雞胚取出,用酒精棉擦拭表面消毒,上下輕輕晃動(dòng)使胚胎脫離內(nèi)層殼膜;用牙科鉆在赤道附近打出個(gè)直徑4 mm左右的小孔,仔細(xì)剔除蛋殼膜,在體式顯微鏡30倍下用顯微注射儀將1 μL 1×109TU/mL慢病毒溶液緩慢注射到雞胚卵黃外周血管中,液體石蠟封堵注射口,用parafilm封閉蛋殼開口,標(biāo)記后繼續(xù)孵化至出雛。

圖2 雞胚卵黃外周靜脈血管顯微注射慢病毒試驗(yàn)操作演示圖

1.5 PCR檢測(cè)對(duì)發(fā)育至性成熟期G0代公雞精液基因組及G1后代血液基因組提取后PCR檢測(cè)。參照慢病毒載體pCSⅡ-ERE-OV-EXE中EXE序列信息,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物上游:5′-CATGCACATGAGAGGTGGATATAG-3′;引物下游:5′-GGTGTACATGATCAGCATGCTCTA-3′;擴(kuò)增長(zhǎng)度為465 bp的包含EXE基因片段。PCR擴(kuò)增體系25 μL,基因組DNA 2 μL,上游引物(10 μmol/L)1.5 μL,下游引物(10 μmol/L)1.5 μL,PCR預(yù)混液12.5 μL,ddH2O 7.5 μL。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s變性,62℃ 45 s 退火,72℃ 45 s延伸,共25個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為248 bp作為參照。

1.6 Southern blot分析對(duì)PCR檢測(cè)陽(yáng)性G1代個(gè)體及野生型個(gè)體,提取份血液DNA 10～20 μg,37℃水浴條件下,一份DNA用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切消化過(guò)夜,另一份HindⅢ酶單切消化過(guò)夜,分別用2%瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。根據(jù)質(zhì)粒載體pCSⅡ-ERE-OV-EXE序列,隨機(jī)引物法標(biāo)記探針,PCR擴(kuò)增出641 bp DNA 片段,作為Southern blot的探針。地高鋅核酸探針標(biāo)記Southern blot按羅氏公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.8 組織免疫化學(xué)檢測(cè)取G2代母雞輸卵管組織在PBS配制的4%多聚甲醛中固定2 h,然后用PBS洗滌20 min,4℃下30%蔗糖溶液中培養(yǎng)過(guò)夜。組織包埋于石蠟中,10 m厚度切片。將切片固定后封閉液中封閉2 h。小鼠抗體1∶100的比例稀釋,并在4℃下孵育過(guò)夜。免疫熒光二抗以1∶400稀釋并在室溫下孵育2 h。使用激光共聚焦顯微鏡拍照分析。野生型雞輸卵管組織切片作為陰性對(duì)照。

1.9 艾塞那肽蛋白提取及定量將來(lái)自G2代轉(zhuǎn)基因母雞和野生型各30枚蛋收集蛋清,與6倍體積冰凍的濃度為50 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH5.0)在4℃下混合2 h,去除大部分的卵黏蛋白。將所得混合物分裝后儲(chǔ)存在-20℃供進(jìn)一步分析。使用ELISA試劑盒測(cè)定蛋清中人艾塞那肽濃度,每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù),取2個(gè)重復(fù)均值作為1次測(cè)量值,每個(gè)樣品至少測(cè)定3次,然后根據(jù)吸光值、稀倍數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)樣品的艾塞那肽濃度,再計(jì)算濃度均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 G0代公雞精液、G1代血液DNA的PCR及Southern blot檢測(cè)驗(yàn)操作72枚白來(lái)航雞種蛋,雞胚發(fā)育至第14～15期(孵化52～55 h),于卵黃外周靜脈血管顯微注射1 μL病毒滴度為1×109TU/mL慢病毒,孵化出雛56只,孵化率77.8%(56/72)。至性成熟階段,采集到16只公雞精液提取DNA后進(jìn)行PCR檢測(cè),其中11只公雞陽(yáng)性,陽(yáng)性率68.7%(11/16)(圖3)。挑選5只陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)的公雞單籠飼養(yǎng),與3～5只野生型白來(lái)航母雞配種,收集種蛋,標(biāo)記后進(jìn)行孵化。對(duì)G1代進(jìn)行血液DNA檢測(cè),在60只G1代中檢測(cè)出5只陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因雞(編號(hào):66,78,209,288,289)(圖4A),轉(zhuǎn)基因效率為8.3%(5/60)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,對(duì)G1代5只陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行了Southern blot 檢測(cè),經(jīng)PstⅠ和EcoRⅠ雙酶切雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示均為轉(zhuǎn)基因雞后代(圖4 C),經(jīng)HindⅢ單酶切雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示外源基因單拷貝插入,且有不同的插入位點(diǎn),符合孟德爾遺傳(圖4 B)。對(duì)G1代轉(zhuǎn)基因雞擴(kuò)繁生產(chǎn)G2代。

1～11.陽(yáng)性個(gè)體;M.DL1000 DNA Marker;PC.陽(yáng)性對(duì)照;NC.陰性對(duì)照

A.PCR檢測(cè)(68,76,209,288,289.為G1代中的5只陽(yáng)性個(gè)體;GAPDH基因擴(kuò)增作為內(nèi)參;M.DL10 kb DNA Marker;PC.陽(yáng)性對(duì)照;NC.陰性對(duì)照);B.血液基因組DNA的Southern blot檢測(cè),血液基因組DNA(10～20 μg)經(jīng)HindⅢ單酶切后用引物做探針雜交;C.血液基因組DNA經(jīng)PstⅠ和EcoRⅠ雙酶切后雜交結(jié)果(PC,80 pg的pCSⅡ-ERE-OV-EXE質(zhì)粒;NC,未注射慢病毒雞血液基因組DNA)

2.2 G2代轉(zhuǎn)基因雞卵清蛋白中艾塞那肽的檢測(cè)為了進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)入外源基因是否出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象,本試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因雞后代蛋清中的艾塞那肽的含量進(jìn)行測(cè)定。本試驗(yàn)對(duì)G2代陽(yáng)性母雞(編號(hào):209,288,289),待發(fā)育至性成熟期產(chǎn)蛋后,連續(xù)收集30個(gè)雞蛋,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書,對(duì)蛋清中的艾塞那肽進(jìn)行測(cè)定,野生型白來(lái)航作對(duì)照。結(jié)果:只G2代轉(zhuǎn)基因母雞(編號(hào):209,288,289)蛋清中艾塞那肽含量為分別為:(39.19±1.32),(42.78±2.10),(53.61±2.54) mg/L,平均為45.19 mg/L,野生型白來(lái)航雞未檢測(cè)出(圖5)。

圖5 G2代轉(zhuǎn)基因雞蛋清中艾塞那肽質(zhì)量濃度測(cè)定

通過(guò)ELISA方法來(lái)測(cè)定3只G2代轉(zhuǎn)基因母雞和野生型母雞蛋清中艾塞那肽的表達(dá)量。試劑盒檢測(cè)范圍是0～1 000 ng/L。G2代轉(zhuǎn)基因母雞:G2-209,G2-288,G2-289;野生型白來(lái)航母雞未檢出。

2.3 G2代母雞輸卵管上皮免疫組織化學(xué)檢測(cè)為了進(jìn)一步驗(yàn)證外源基因(艾塞那肽)在卵清蛋白基因特異性啟動(dòng)子調(diào)控下僅在輸卵管上皮特異性表達(dá),對(duì)G2代轉(zhuǎn)基因母雞輸卵管組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè),野生型白來(lái)航雞作為對(duì)照。結(jié)果顯示,在G2代轉(zhuǎn)基因母雞輸卵管上皮組織中有較強(qiáng)的紅色抗體信號(hào),對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性信號(hào),進(jìn)一步證實(shí)我們不僅成功制備了表達(dá)艾塞那肽的轉(zhuǎn)基因雞,且外源基因(艾塞那肽)僅在輸卵管上皮組織表達(dá),具有組織表達(dá)特異性(圖6)。

3 討論

3.1 雞卵清蛋白特異性啟動(dòng)子的表達(dá)機(jī)制本試驗(yàn)構(gòu)建了一個(gè)基于復(fù)制缺陷型慢病毒載體,該載體由雞卵清蛋白基因特異性啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)外源基因(艾塞那肽),并在啟動(dòng)子上游添加元件來(lái)增強(qiáng)表達(dá)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室早期建立的雞胚血管顯微注射技術(shù)平臺(tái),擬期望簡(jiǎn)便、高效、穩(wěn)定獲得轉(zhuǎn)基因雞后代,并證明外源基因(艾塞那肽)僅在輸卵管上皮組織特異地表達(dá),既盡量減少對(duì)宿主的毒性作用,又能便于收集、分離和純化,還能保持外源蛋白的生物活性。

雞蛋蛋清是由輸卵管上皮細(xì)胞中的腺細(xì)胞分泌的,卵清蛋白基因編碼超過(guò)1/2以上的蛋清蛋白,其中卵清蛋白占54%,約為2.2 g,輸卵管上皮單個(gè)腺細(xì)胞中卵清蛋白mRNA拷貝數(shù)多達(dá)105個(gè)[24-25]。在試驗(yàn)中,在白來(lái)航雞基因組中擴(kuò)增卵清蛋白5′端啟動(dòng)子調(diào)控序列,主要包括類固醇激素依賴調(diào)控元件(steroid dependent regulatury element,SDRE)和NRE(negative regulatury element)兩個(gè)調(diào)控元件,SDRE位于基因上游-892～-780區(qū),可與雌激素和糖皮質(zhì)激素結(jié)合,產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng),促進(jìn)卵清蛋白基因的轉(zhuǎn)錄;NRE位于基因上游-308～-88,該元件具有雙重作用,在雌激素作用下會(huì)增強(qiáng)卵清蛋白基因的表達(dá),反之抑制卵清蛋白基因的表達(dá)[26];另外擴(kuò)增出包括OVA第1外顯子、第1內(nèi)含子和第2外顯子開始部分,長(zhǎng)度為2 785 bp雞卵清蛋白啟動(dòng)子調(diào)控序列,既能保證外源基因的表達(dá),又能保證表達(dá)的組織特異性[12,14]。為了進(jìn)一步增加外源基因的表達(dá),在OVA 啟動(dòng)子上游插入了一個(gè)雌激素應(yīng)答原件(ERE,675 bp)來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)目的基因的轉(zhuǎn)錄[14-16]。艾塞那肽是一種含有39個(gè)氨基酸的多肽序列, cDNA序列(117 bp),連接在OVA啟動(dòng)子上游5′端,總共長(zhǎng)度約3.6 kb,符合選擇的復(fù)制缺陷型慢病毒系統(tǒng)要求,未超出其有效載荷,成功包裝出高滴度的慢病毒。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因雞后代進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè),結(jié)果證明了艾塞那肽蛋白僅特異地在輸卵管上皮組織管狀腺細(xì)胞內(nèi)表達(dá),即卵清蛋白合成區(qū)域,其他上皮組織細(xì)胞未見,具有表達(dá)特異性,符合試驗(yàn)設(shè)計(jì)預(yù)期,也與其他研究者報(bào)道一致[14-16]。雖然本試驗(yàn)成功獲得表達(dá)外源目的基因的轉(zhuǎn)基因雞,但是從卵清蛋白中檢測(cè)的目的蛋白含量與其他研究報(bào)道相比,具有一定的差異性。在試驗(yàn)中測(cè)得G2代轉(zhuǎn)基因母雞蛋清中艾塞那肽含量平均為45.19 mg/L,與LILLICO等[14]和CAO等[15]報(bào)道結(jié)果接近,比LIU等[16]報(bào)道的高出多倍。構(gòu)建同樣的表達(dá)載體及元件,在轉(zhuǎn)基因雞后代中目的蛋白的表達(dá)卻出現(xiàn)較大差異,推測(cè)可能是慢病毒載體的隨機(jī)插入造成目的蛋白的表達(dá)差異[27],也可能是對(duì)轉(zhuǎn)基因后代中檢測(cè)數(shù)據(jù)方法不一致造成的,如有的檢測(cè)G1代,有的檢測(cè)G2代,對(duì)轉(zhuǎn)基因雞后代檢測(cè)統(tǒng)計(jì)數(shù)目偏小也可能造成人為誤差;另外也有可能是表達(dá)載體不同引起的,如EIAV相對(duì)于HIV,同屬于慢病毒,對(duì)宿主造成的毒性較小,且攜帶的外源基因序列更大[14]。

3.2 轉(zhuǎn)基因雞制備效率近年來(lái),利用轉(zhuǎn)基因雞輸卵管生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白已取得了很多可喜的成果,其中胚盤下腔顯微注射慢病毒法和PGCs體外轉(zhuǎn)染法是公認(rèn)比較成功的方法。ZHU等[12]利用構(gòu)建的卵清蛋白特異性啟動(dòng)子的慢病毒載體,通過(guò)胚盤下腔顯微注射慢病毒法首次制備出表達(dá)人源化融合性單克隆抗體的嵌合體雞,并且在蛋清中表達(dá)的單克隆抗體產(chǎn)量及生物活性都令人感到振奮,但未能獲得性系傳遞的轉(zhuǎn)基因后代。LILLICO等[14]將攜帶有卵清蛋白特異性啟動(dòng)子調(diào)控序列分別表達(dá)miR24和hINFβ1a兩種慢病毒載體(EIAV),通過(guò)同樣的方法成功制備出轉(zhuǎn)基因雞后代,而且兩者都能檢測(cè)到輸卵管組織特異性表達(dá)具有完全生物活性的藥用蛋白及人源化抗體,且能穩(wěn)定遺傳給后代。KWONT等[28]通過(guò)同樣的方法成功制備在卵清蛋白中特異性表達(dá)人干擾素的轉(zhuǎn)基因鵪鶉。BON KOO等[29]利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體胚盤下腔顯微注射成功制備了特異性表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)基因雞。在國(guó)內(nèi),有研究者通過(guò)同樣的方法成功制備在卵清蛋白中特異性表達(dá)重組人防御素4和人溶菌酶兩種藥用蛋白的轉(zhuǎn)基因雞[15-16]。以上報(bào)道是將病毒載體注射到發(fā)育第Ⅹ期的胚盤下腔,通過(guò)感染囊胚期40 000～60 000個(gè)細(xì)胞中的幾個(gè)PGCs,先生產(chǎn)出性系嵌合體。首先需要在雞胚孵化過(guò)程中進(jìn)行繁雜的倒三期培養(yǎng)體系[17];其次,必須包裝出高滴度的慢病毒;第三,要求特定的試驗(yàn)設(shè)備,同時(shí)要求顯微注射操作者必須精準(zhǔn)、熟練,且經(jīng)過(guò)嚴(yán)格訓(xùn)練。另外,利用PGCs體外轉(zhuǎn)染法制備轉(zhuǎn)基因雞被認(rèn)為是一種有效的方法[18-20],但是,由于家禽PGCs培養(yǎng)的特殊性(需要滋養(yǎng)層細(xì)胞,培養(yǎng)血清中需要添加多種特殊的抑制細(xì)胞分化因子),加上PGCs的分離、純化、培養(yǎng)、傳代、體外轉(zhuǎn)染、篩選等一系列技術(shù)環(huán)節(jié)周期長(zhǎng),繁瑣且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且還不能確保轉(zhuǎn)染后的PGCs注射到同期發(fā)育胚胎后,能否遷移至受體雞胚的生殖原基進(jìn)一步分化形成配子(精子或卵子),所以還一直未能做到真正的推廣應(yīng)用。

本試驗(yàn)構(gòu)建了一個(gè)雞卵清蛋白基因特異性啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)艾塞那肽的慢病毒載體,嘗試把顯微注射法、慢病毒載體法兩種轉(zhuǎn)基因技術(shù)與早期雞胚PGCs遷移規(guī)律的生殖生理特點(diǎn)結(jié)合起來(lái),選擇雞胚發(fā)育至14～15期,血液中PGCs向生殖原基遷移高峰期,將高滴度的慢病毒載體注入血管中,隨血液循環(huán)而感染其中的PGCs,最終獲得了可表達(dá)外源基因(艾塞那肽)的轉(zhuǎn)基因雞。與經(jīng)典的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家禽方法相比,不僅省去復(fù)雜的倒三期培養(yǎng)體系及PGCs的分離、純化、培養(yǎng)、建系、轉(zhuǎn)染、篩選后再注回同期受體胚胎等一系列繁雜程序操作,而且節(jié)約了大量的人力、物力、財(cái)力,轉(zhuǎn)基因雞的制備綜合效率(G0代孵化率,G1代陽(yáng)性率等)整整提高了上百倍。本研究組建立的簡(jiǎn)便、高效、穩(wěn)定生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞的創(chuàng)新技術(shù)體系,在卵清蛋白特異性啟動(dòng)子調(diào)控作用下,利用雞輸卵管天然、高效合成并分泌蛋白的能力,在雞蛋中生產(chǎn)一些具有重要價(jià)值的藥用蛋白,具有廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)發(fā)展?jié)摿Α?/p>