王世平,王金圓,李昕蔓,唐 婷,楊國宇,潘佳佳

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生化與營養(yǎng)重點實驗室 河南省動物生長發(fā)育調(diào)控重點實驗室,河南 鄭州450002)

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一種急性傳染病,多種家畜和野生動物均可感染,以豬感染最為普遍。該病在我國也廣泛存在,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。PRV屬于皰疹病毒科、豬皰疹病毒屬,為有囊膜的線性雙鏈DNA病毒,經(jīng)常被用于皰疹病毒的分子生物學(xué)特征以及皰疹病毒性疾病的研究[2]。PRV能在多種組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖,其中以豬腎和兔腎細(xì)胞最為敏感,可以引起明顯的細(xì)胞病變。PRV編碼11種糖蛋白,分別是gE、gI、gD、gG、gL、gM、gH、gC、gB、gN和gK,其中g(shù)B糖蛋白是病毒囊膜的主要成分之一,在PRV感染宿主的過程中有著重要的作用[2-3]。gB蛋白對PRV復(fù)制至關(guān)重要,它不僅參與病毒吸附和進入宿主細(xì)胞,也是PRV重要的中和抗原,能夠刺激機體產(chǎn)生病毒特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng);此外,gB基因與病毒的毒力有關(guān),gB基因缺失的PRV由于喪失穿透能力而失去感染性[4]。因此,gB基因和蛋白的表達量變化能夠反映PRV的增殖情況。

真核細(xì)胞的細(xì)胞骨架主要包括微絲、微管和中間絲。微絲是由肌動蛋白單體(G-actin)形成的多聚體,也稱為纖維性肌動蛋白(F-actin)。除參與調(diào)控生物學(xué)過程外,肌動蛋白及其結(jié)合蛋白在病毒吸附、進入、組裝、釋放等生命活動中也發(fā)揮重要作用[5-6]。在病毒與宿主細(xì)胞相互作用的研究中發(fā)現(xiàn),多種病毒如皰疹病毒、腺病毒、黃熱病毒、痘病毒、流感病毒及狂犬病毒等利用微絲及其結(jié)合蛋白入侵宿主細(xì)胞并完成其增殖過程[7-12]。發(fā)育調(diào)節(jié)腦蛋白(developmentally regulated brain protein,Drebrin)是一種微絲結(jié)合蛋白[13-14]。Drebrin 蛋白包含5個結(jié)構(gòu)域,分別是N 端肌動蛋白解聚因子同源結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋域(coiled-coil,CC)、螺旋域(helical domain,Hel)、脯氨酸富集區(qū)域和C末端[15]。Drebrin蛋白通過2個螺旋域協(xié)同結(jié)合F-actin[13,15-16]。研究發(fā)現(xiàn),Drebrin蛋白可通過與病毒蛋白相互作用、重排微絲細(xì)胞骨架,從而調(diào)控病毒的感染過程。輪狀病毒的VP4蛋白可與Drebrin結(jié)合,抑制輪狀病毒進入宿主細(xì)胞。利用化學(xué)抑制劑、siRNA 沉默、CRISPR 敲除技術(shù)阻斷Drebrin蛋白的功能,增強輪狀病毒感染,而且Drebrin是通過調(diào)控發(fā)動蛋白依賴的內(nèi)吞過程從而參與輪狀病毒的入胞過程[17]。另外,在HIV病毒感染宿主細(xì)胞時,Drebrin蛋白被募集到病毒囊膜糖蛋白中,并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架微絲的動態(tài)重組和其結(jié)合蛋白Profilin的表達從而調(diào)控病毒的感染[18]。宿主細(xì)胞骨架微絲存在于PRV病毒粒子中,推測微絲可能參與PRV的生活周期[19],但是微絲結(jié)合蛋白Drebrin是否參與PRV的感染過程及其分子機制并不清楚,本研究主要采用Drebrin抑制劑BTP-2阻斷其功能,檢測豬腎上皮細(xì)胞PK-15內(nèi)PRV感染量變化情況,以初步判定Drebrin蛋白是否參與PRV增殖,為進一步研究PRV 感染的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒毒株豬腎上皮細(xì)胞PK-15、PRV-HN1201、PRV-GFP由本實驗室保存。

1.2 主要試劑DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(10566-016)、胎牛血清 FBS(10099-141C)、雙抗PS(15140122)購自 Gibco 公司; BTP-2 (HY-100831)購自 MCE公司;PRV病毒豬源gB單克隆抗體由本實驗室制備;Drebrin抗體(67589-1-Ig)、GAPDH抗體(60004-1-Ig)購自Proteintech公司;CCK-8(40203ES60)購自YEASEN公司;熒光定量試劑SYBR Green(7E503H1)購自Vazyme公司;RNAiso Plus購自寶日生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 藥物配制及細(xì)胞活力檢測BTP-2用DMSO溶解為 10 mmol/L,-80℃凍存。將PK-15細(xì)胞以104/孔鋪至96孔板中,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h 后,將藥物用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋后以0,20,60,200,600 nmol/L 的濃度梯度加入細(xì)胞,37℃孵育培養(yǎng) 24 h,加入 10 μL的CCK-8,37℃條件下培養(yǎng) 4 h,450 nm波長測吸光度值。數(shù)據(jù)采用以下公式計算:

細(xì)胞活力=(D加藥-D空白)/(D0加藥-D空白) ×100%;

D加藥:具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度值;

D空白:具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度值;

D0加藥:具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度值;

細(xì)胞活力:細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力。

1.4 熒光觀察及流式細(xì)胞術(shù)24孔板中以2.5×105/孔接種PK-15細(xì)胞,待細(xì)胞匯合度達40%左右時,將藥物用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋后以0,20,60,200,600 nmol/L的濃度梯度加入細(xì)胞,37℃孵育培養(yǎng) 4 h。棄去原培養(yǎng)基,PBS清洗2遍,以感染復(fù)數(shù)MOI=0.01感染PRV-GFP株,37℃孵育1 h,棄去原培養(yǎng)基,PBS清洗2遍,加入維持培養(yǎng)基稀釋后的藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)以及熒光情況并拍照。與此同時,收集細(xì)胞并進行流式檢測。

1.5 實時熒光定量PCR6孔板中以1×106/孔接種PK-15細(xì)胞,待細(xì)胞匯合度達50%左右時,將藥物用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋后以0,20,60,200,600 nmol/L的濃度梯度加入細(xì)胞,37℃孵育培養(yǎng) 4 h。棄去原培養(yǎng)基,PBS清洗2遍,以感染復(fù)數(shù)MOI=0.01接種PRV-HN1201株,37℃孵育1 h,棄上清,PBS清洗2遍,加入維持培養(yǎng)基稀釋的藥物繼續(xù)培養(yǎng)24/36 h,收集細(xì)胞,利用TRIzol提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,利用熒光定量PCR引物進行擴增。試驗所使用PRV-gB、Drebrin以及內(nèi)參基因 GAPDH 上、下游引物如下:PRV-gB-F:5′-GGCATCGCCAACTTCTTCC-3′,PRV-gB-R:5′-CCTCGTCCACGTCGTCCTC-3′。Drebrin-F:5′-TTGCCCAGCGACCTGATAAC-3′,Drebrin-R:5′-TATGAAAGGGCAGTACGGACG-3′。GAPDH-F:5′-GAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3′,GAPDH-R:5′-CATGGGTAGAATCA-TACTGGAACA-3′。PCR 反應(yīng)體系(10 μL):SYBR Green Mix 5 μL,上、下游引物各0.4 μL(終濃度0.8 μmol /L),模板 cDNA 1.5 μL,ddH2O 2.7 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性15 s;60℃退火20 s;72℃延伸20 s,40個循環(huán)。將得到的Ct 值采用 2-ΔΔCt進行計算分析。

1.6 Western blot將PK-15細(xì)胞以1×106/孔鋪至6孔板中,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后,將BTP-2用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋后以0,20,60,200,600 nmol/L的濃度梯度處理細(xì)胞,37℃孵育4 h,接毒 MOI=0.1的PRV-HN1201,置37℃吸附1 h,用PBS溶液清洗3次,加入維持培養(yǎng)基稀釋的藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h,RIPA 裂解液裂解,收集細(xì)胞總蛋白,制樣進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗Anti-PRV-gB 4℃過夜,二抗室溫孵育1 h,然后進行ECL,以GAPDH作為內(nèi)參。

1.7 病毒PFU檢測將PK-15細(xì)胞以 1.5×105/孔鋪至 12 孔板中,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后,將BTP-2用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋后以0,20,60,200,600 nmol/L的濃度梯度處理細(xì)胞,37℃下孵育4 h,接毒 MOI=0.1的PRV- HN1201,置37℃吸附1 h,用PBS溶液清洗3次,加入維持培養(yǎng)基稀釋的藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h,反復(fù)凍融3次收集病毒懸液并做10倍倍比系列稀釋,共稀釋4次,然后接種于24孔板的單層PK-15細(xì)胞上(每孔細(xì)胞數(shù)量為3×105個),37℃吸附1 h,棄病毒液加入500 μL 1%FBS DMEM繼續(xù)培養(yǎng)4 d。后棄上清,加入4%PFA室溫固定細(xì)胞30 min,利用1%結(jié)晶紫染色30 min,流水浸洗30 min后可觀察到噬斑及未脫落的細(xì)胞,倒扣晾干后顯微鏡下數(shù)噬斑數(shù)并統(tǒng)計。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析所有試驗均重復(fù)3次,利用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖和統(tǒng)計學(xué)分析,免疫印跡信號強度采用Image J軟件進行灰度分析,數(shù)據(jù)均用ˉx±s表示,利用t檢驗進行顯著性分析,**表示P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 BTP-2處理對PK-15細(xì)胞活力的影響小分子藥物BTP-2通過抑制Drebrin和F-actin結(jié)合,從而阻斷Drebrin蛋白功能[17,20-21]。為了研究Drebrin蛋白對PRV增殖的影響,利用BTP-2處理豬腎上皮細(xì)胞PK-15,利用CCK-8法檢測BTP-2對PK-15細(xì)胞活力的影響。結(jié)果如圖1所示,處理組藥物濃度在20～600 nmol/L之間時,吸光度與對照組無顯著差異(P>0.05)。故本研究選擇20～600 nmol/L作為BTP-2最適藥物作用濃度范圍。

圖1 BTP-2對PK-15細(xì)胞活力的影響

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測PRV-GFP的感染率不同濃度梯度的BTP-2處理PK-15細(xì)胞并接種MOI=0.01的PRV-GFP,通過熒光倒置顯微鏡(40×)觀察各組細(xì)胞的GFP熒光情況并拍照。結(jié)果如圖2A所示,與對照相比,GFP陽性細(xì)胞明顯減少,隨著濃度的升高,熒光強度逐次降低。與此同時,收集細(xì)胞并利用流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性細(xì)胞數(shù)量,結(jié)果如圖2A,B所示,BTP-2藥物處理后PRV-GFP病毒感染率顯著降低(P<0.01),并隨著藥物濃度的升高而降低,呈藥物濃度依賴性變化。

A.熒光顯微鏡(40×)和流式細(xì)胞術(shù)檢測PRV—GFP增殖情況;B.A圖的流式統(tǒng)計結(jié)果;**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 實時熒光定量PCR檢測基因水平PRV感染量在細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪適宜濃度的PK-15細(xì)胞,37℃過夜培養(yǎng)后棄掉上清液,加入不同濃度梯度的BTP-2,37℃處理4 h,接毒MOI=0.01的PRV-HN1201 37℃吸附1 h,棄掉上清,加入含有相應(yīng)藥物的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞并提取總RNA,以實時熒光定量PCR方法檢測PRV-gB和Drebrin基因表達量,結(jié)果如圖3所示,相比對照組,BTP-2處理細(xì)胞后PRV-gB和Drebrin基因表達量顯著降低(P<0.01),并呈劑量依賴性。

1.PRV-gB基因的表達情況;B.Drebrin基因的表達情況

2.4 Western blot檢測蛋白水平PRV感染量在細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪適宜細(xì)胞數(shù)量PK-15細(xì)胞,37℃過夜培養(yǎng)后棄掉上清液,加入不同濃度梯度的BTP-2 37℃處理4 h,接毒MOI=0.1的PRV-HN1201 37℃吸附1 h,棄掉上清,加入含有相應(yīng)藥物的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞總蛋白,以Western blot方法檢測PRV-gB和Drebrin蛋白表達情況,結(jié)果如圖4所示,與對照組相比,BTP-2處理細(xì)胞后PRV-gB和Drebrin蛋白表達量顯著降低(P<0.01),檢測結(jié)果與基因水平一致,結(jié)果表明BTP-2處理抑制了PRV增殖。

A.Western blot檢測PRV-gB、Drebrin和GAPDH蛋白的表達; B,C.為Image J軟件對圖A進行灰度值分析;1～5.BTP-2濃度梯度

2.5 PFU法檢測子代病毒滴度PK-15細(xì)胞加入不同濃度梯度的BTP-2 37℃處理4 h,接毒MOI=0.1的PRV- HN1201 37℃吸附1 h,棄掉上清,加入含有相應(yīng)藥物的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,反復(fù)凍融收集子代病毒,利用噬斑法進行病毒滴度測定。結(jié)果表明,BTP-2處理細(xì)胞后PRV子代病毒滴度顯著降低(P<0.01),表明BTP-2抑制子代病毒的產(chǎn)生(圖5)。

圖5 PFU法檢測PRV- HN1201子代病毒滴度

3 討論

豬偽狂犬病是由PRV引起神經(jīng)系統(tǒng)障礙的一種傳染病,目前研究主要集中在其致病性及檢測方法,但PRV增殖過程的分子機制研究仍不夠充分。因此,研究PRV與宿主細(xì)胞相互作用的分子機制,有助于了解PRV的感染過程,進而為PRV感染的防控提供理論依據(jù)。本研究通過化學(xué)藥物處理PK-15細(xì)胞,研究宿主細(xì)胞骨架微絲結(jié)合蛋白Drebrin的抑制劑BTP2對PRV增殖的影響。

細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)狀體系,主要包括微絲、微管、中間絲。病毒是專性細(xì)胞內(nèi)病原體,其生活周期主要包括病毒識別并吸附宿主細(xì)胞、病毒穿入與脫衣殼、基因組復(fù)制和核衣殼裝配、囊膜形成、病毒顆粒成熟及釋放等,這一過程涉及到的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞吞作用、免疫逃逸、胞內(nèi)運輸?shù)冗^程直接或間接依賴于細(xì)胞骨架[5-6,22-23]。肌動蛋白是真核細(xì)胞中最豐富的細(xì)胞骨架蛋白,在細(xì)胞中肌動蛋白的聚合和解聚以及形成功能更高的網(wǎng)絡(luò)組織都受到大量微絲結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)[24]。作為肌動蛋白結(jié)合蛋白之一,早期研究發(fā)現(xiàn)Drebrin蛋白主要在腦組織表達,通過調(diào)控微絲重組從而參與神經(jīng)細(xì)胞的分化、發(fā)育和功能[25-27]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),Drebrin蛋白在其他組織表達并參與免疫調(diào)節(jié)、精子生成、腫瘤生成等多種生物學(xué)功能[28-33]。近10年的研究證明,Drebrin蛋白可通過與病毒蛋白相互作用誘導(dǎo)宿主細(xì)胞骨架重排從而調(diào)控病毒的感染過程[17-18]。在 HIV 病毒感染期間,Drebrin蛋白被招募到病毒包膜糖蛋白中,通過調(diào)控細(xì)胞骨架微絲重排和微絲結(jié)合蛋白Profilin的積累從而參與HIV感染[18]。另外,Drebrin抑制dynamin介導(dǎo)的胞吞作用從而限制輪狀病毒進入宿主細(xì)胞[17]。本研究利用Drebrin抑制劑BTP2處理細(xì)胞后,PRV子代病毒滴度降低;通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)PRV感染的細(xì)胞數(shù)量明顯減少;PRV-gB基因和蛋白表達量也明顯降低,并呈劑量依賴性,說明BTP-2處理抑制PRV增殖。以上結(jié)果表明,Drebrin蛋白參與PRV的感染過程,但是病毒增殖包括吸附、進入、復(fù)制及釋放等過程,Drebrin在PRV感染的哪個階段發(fā)揮功能及其參與PRV感染的分子機制仍需進一步探究,以期為PRV疫苗研發(fā)和抗病毒藥物研制提供理論支持。

綜上,本研究利用化學(xué)藥物處理,通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、實時熒光定量PCR、Western blot等方法分別從細(xì)胞水平、基因水平和蛋白水平,確證BTP-2處理抑制了PRV增殖,表明微絲結(jié)合蛋白Drebrin 參與PRV增殖。