鄭偉康,張靜苗,劉雅琦,周瑩珊,杜 靜,宋厚輝,董婉玉,王曉杜

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測(cè)技術(shù)浙江省工程研究中心/浙江省動(dòng)物醫(yī)學(xué)與健康管理國(guó)際科技合作基地/中澳動(dòng)物健康大數(shù)據(jù)分析聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 311300)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一種有囊膜單股正鏈RNA病毒,屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)的成員[1]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析,冠狀病毒又可分為α、β、γ和δ 4個(gè)亞群,PEDV屬于α亞群,是典型的α冠狀病毒[2]。PEDV的基因組全長(zhǎng)約為28 kb,5′端有帽子結(jié)構(gòu),3′端有poly(A)尾結(jié)構(gòu),病毒基因組全長(zhǎng)包含7個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF),分別編碼16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structure protein,Nsp),命名為Nsp1～16[3-4];4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,分別為刺突(spike,S)蛋白、囊膜(envelope,E)蛋白、膜(membrane,M)蛋白和核衣殼(nucleocapsid,N)蛋白;此外,還有一個(gè)由ORF3編碼的病毒復(fù)制過程中非必須的輔助因子[5]。

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)在世界各地呈地方性流行趨勢(shì),1971年首次暴發(fā)于英國(guó),此后蔓延至歐洲多個(gè)國(guó)家;隨后,亞洲多個(gè)國(guó)家也相繼出現(xiàn)該病的流行,2007年泰國(guó)出現(xiàn)PED的大流行,越南則是在2009年暴發(fā)[6-8]。我國(guó)在1973年首次出現(xiàn)PED的流行,從20世紀(jì)80年代至今,PED在我國(guó)一直呈散發(fā)或地方性流行[9-10]。當(dāng)前PEDV在我國(guó)豬病毒性腹瀉病中占主導(dǎo)地位,在我國(guó)豬群中PEDV的陽(yáng)性率高達(dá)69.2%,其感染率明顯高于豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和豬輪狀病毒(porcine rota virus,PoRV)[11-14]。同時(shí),PEDV病毒還在不斷進(jìn)化,有研究對(duì)2015—2018年分離的147份PEDV樣品與CV777毒株進(jìn)行同源性比較后發(fā)現(xiàn),這些樣品與CV777毒株核苷酸同源性為90.7%～91.8%,氨基酸同源性僅為89.3%～90.7%,并且氨基酸突變概率在2015—2018年之間持續(xù)增加[15]。

近年變異毒株的接連出現(xiàn)使PED的流行呈現(xiàn)上升趨勢(shì),并且發(fā)病情況也趨于復(fù)雜化,通常會(huì)出現(xiàn)不同毒株的交叉感染,這使得PEDV的防控未取得實(shí)質(zhì)性的成效[16]。反向遺傳學(xué)操作技術(shù)可在基因水平對(duì)病毒進(jìn)行改造,從而探究這些突變對(duì)病毒表型及性狀可能的影響,是研究病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能的重要工具。因此本研究利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)構(gòu)建了流行毒株P(guān)EDV YJH141的全長(zhǎng)感染性克隆,旨在為進(jìn)一步深入研究該病毒基因組結(jié)構(gòu)功能、復(fù)制及致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞系PEDV YJH毒株于2015年分離于浙江某豬場(chǎng)發(fā)病豬,體外連續(xù)傳代至141代,命名為YJH141(MT646162.1),保存于本實(shí)驗(yàn)室。非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero,C1008)及293T細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 載體與菌株大腸桿菌E.coliDH10B、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pBAC載體質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑及耗材反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)(TaKaRa)生物技術(shù)(北京)有限公司。PCR反應(yīng)擴(kuò)增酶KOD One PCR Master Mix-Blue、pMD18-T Vector試劑盒、DNA A-Tailing試劑盒購(gòu)自東洋紡(ToYoBo)生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購(gòu)自NEB生物技術(shù)(北京)有限公司。TRIZOL購(gòu)自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。本研究中所用抗PEDV-N蛋白抗體 -為實(shí)驗(yàn)室自制的鼠源抗體,熒光標(biāo)記二抗為驢抗鼠,購(gòu)自于英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。所需的引物合成及測(cè)序服務(wù)均由杭州擎科生物科技有限公司提供。

1.4 YJH141全長(zhǎng)cDNA克隆構(gòu)建提取YJH141病毒液的RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用PCR將PEDV基因組分為8個(gè)片段進(jìn)行分段擴(kuò)增(圖1)。擴(kuò)增片段分別克隆至T載體,然后將病毒不同片段克隆到pBAC載體,構(gòu)建含有病毒完整基因組pBAC質(zhì)粒。在引物設(shè)計(jì)過程中插入2個(gè)同義突變位點(diǎn),使其在ORF1a末端構(gòu)建1個(gè)SfiⅠ酶切位點(diǎn),以此作為重組病毒的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)區(qū)別于親本病毒,引物信息見表1。

表1 全長(zhǎng)感染性克隆構(gòu)建引物信息

圖1 全長(zhǎng)感染性克隆構(gòu)建策略

1.5 YJH141全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒的驗(yàn)證將上述獲得的酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板后選取單克隆于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。隨后設(shè)計(jì)針對(duì)片段連接處的引物對(duì)挑取的單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,引物信息見表2。將PCR鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定,正確的單克隆提取質(zhì)粒命名為pBAC-PEDV-YJH141。

表2 全長(zhǎng)感染性克隆驗(yàn)證引物

1.6 病毒拯救及鑒定將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞(根據(jù)試劑盒說明操作)。轉(zhuǎn)染24～36 h后凍融1次收取上清接種于單層Vero細(xì)胞上。盲傳3代以確定病毒能夠穩(wěn)定傳代。通過觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)、RT-PCR驗(yàn)證、遺傳標(biāo)記位點(diǎn)確認(rèn)及Western blot檢測(cè)等方法確認(rèn)重組病毒拯救情況,并將拯救成功的病毒命名為rYJH141。

1.7 空斑試驗(yàn)將Vero細(xì)胞鋪于6孔板,將待測(cè)病毒液用病毒維持液(胰酶終質(zhì)量濃度為5 mg/L的DMEM培養(yǎng)基)10倍濃度稀釋后感染Vero細(xì)胞,每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)。置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h,棄去培養(yǎng)上清,每孔加入2×DMEM(含10 mg/L胰酶)和2%低熔點(diǎn)瓊脂糖等體積混勻的培養(yǎng)基2 mL,室溫凝固后,置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48～72 h。隨后用4%多聚甲醛室溫固定2 h以上。棄去培養(yǎng)基,用結(jié)晶紫染液室溫染色30 min,清水輕柔洗去多余結(jié)晶紫染液,觀察空斑形成情況,分析其大小及形態(tài)差異。

1.8 間接免疫熒光檢測(cè)將待檢病毒以0.01 MOI感染Vero細(xì)胞,于18 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液。加入4%多聚甲醛固定30 min。棄去多聚甲醛加入0.5% TritonX-100室溫透化細(xì)胞10 min。轉(zhuǎn)入含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中37℃封閉1～1.5 h。以Mouse anti-PEDV-N(1∶800)為一抗,37℃孵育30 min,Donkey anti-mouse(1∶2 000)為二抗,37℃孵育45 min。最后利用DAPI復(fù)染劑(1∶1 000)室溫染核10 min。將細(xì)胞爬片取出滴加封片劑封片,利用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.9 病毒多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定Vero細(xì)胞鋪設(shè)于6孔板,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h,待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上后棄去培養(yǎng)基,PBS潤(rùn)洗2次。隨后以MOI為0.01待檢病毒感染6孔板中的Vero細(xì)胞,并分別于感染后6,12,18,24,36,48,60和72 h收取孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)上清,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔,按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50,繪制病毒的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 pBAC-PEDV-YJH141重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定提取YJH141株的病毒RNA,通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按方法1.4操作方法,得到pBAC-PEDV-YJH141。通過PCR方法對(duì)全長(zhǎng)質(zhì)粒的各片段連接處進(jìn)行鑒定,4對(duì)特異性引物均可擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶,表明各片段按照預(yù)期成功連接(圖 2A～D)。選取2個(gè)驗(yàn)證正確的單克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提并測(cè)序,結(jié)果表明正確構(gòu)建了PEDV YJH141全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒,將其命名為pBAC-PEDV-YJH141(圖 2E)。

2.2 重組病毒rYJH141的拯救將pBAC-PEDV-YJH141轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,收取293T培養(yǎng)上清接種于單層Vero細(xì)胞,同時(shí)以親本YJH141接毒組作為陽(yáng)性對(duì)照,未接毒組作為陰性對(duì)照。在接種后12 h,2個(gè)接毒組鏡下觀察到明顯的CPE,18 h后兩者均產(chǎn)生大量合胞體,細(xì)胞出現(xiàn)崩解脫落;陰性對(duì)照細(xì)胞正常(圖3 A)。將病毒盲傳3次后,收取病毒培養(yǎng)上清提取重組病毒RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用特異性引物可擴(kuò)增出N基因片段(圖3 B);同時(shí)收取細(xì)胞沉淀進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示重組病毒與親本YJH141均可檢測(cè)到N蛋白的表達(dá)(圖3 C)。通過PCR及測(cè)序驗(yàn)證重組病毒的遺傳標(biāo)記位點(diǎn),結(jié)果顯示重組病毒帶有區(qū)別于親本病毒的同義突變位點(diǎn)(圖3 D)。上述結(jié)果均表明重組病毒拯救成功。

2.3 YJH141與rYJH141的空斑形成情況將重組病毒接種Vero細(xì)胞,以親本YJH141接毒組為陽(yáng)性對(duì)照,未接毒組為陰性對(duì)照,于感染后48 h固定細(xì)胞并染色。結(jié)果顯示重組病毒與親本病毒形成的單個(gè)空斑面積相近,表明兩者在Vero細(xì)胞上產(chǎn)生細(xì)胞病變的能力接近(圖4)。

圖4 YJH141及rYJH141的空斑形成情況

2.4 YJH141與rYJH141的IFA檢測(cè)將重組病毒與親本YJH141病毒以0.01 MOI 分別感染Vero細(xì)胞,未接毒組為陰性對(duì)照,于18 h采用激光共聚焦試驗(yàn)鑒定拯救的病毒。結(jié)果顯示YJH141與rYJH141組在感染后18 h時(shí)出現(xiàn)相似的熒光強(qiáng)度(圖5 C、F),而陰性對(duì)照組的細(xì)胞未出現(xiàn)紅色熒光(圖5 I),表明YJH141與rYJH141感染Vero細(xì)胞的能力接近。

圖5 YJH141及rYJH141 N蛋白的IFA檢測(cè)

2.5 YJH141與rYJH141的生長(zhǎng)曲線繪制將重組病毒與親本YJH141病毒以0.01 MOI接種于Vero細(xì)胞分別繪制病毒的多步生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示,rYJH141在Vero細(xì)胞上的多步生長(zhǎng)曲線與親本YJH141相似,兩者無(wú)明顯差異(圖6)。表明YJH141與rYJH141呈現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征。

3 討論

PEDV野毒株感染新生仔豬可引發(fā)極高的發(fā)病率和病死率,給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的危害[17]。PEDV屬于冠狀病毒α亞群,是典型的α冠狀病毒[2]。反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)是研究大部分RNA病毒特性的重要工具。冠狀病毒的反向遺傳學(xué)技術(shù)主要有靶向RNA重組技術(shù)、基于BAC載體的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)以及基于體外連接的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)等[18]。靶向RNA重組技術(shù)最早被應(yīng)用于鼠肝炎病毒的拯救,該技術(shù)利用冠狀病毒在感染宿主細(xì)胞時(shí)RNA高效重組的特性,進(jìn)而在病毒基因組中插入外源基因片段[19]?；隗w外連接的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)是通過獲得病毒全長(zhǎng)cDNA,以全長(zhǎng)cDNA為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得用于翻譯病毒結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白的RNA片段,將其電轉(zhuǎn)至細(xì)胞內(nèi)翻譯包裝,從而獲得完整的病毒顆粒[18]。以上兩種方法都可以快速操作病毒基因組獲得重組病毒,但存在一定的局限性。靶向RNA重組技術(shù)只能對(duì)病毒基因組的一些特定片段進(jìn)行編輯,并且重組病毒需要經(jīng)過繁雜的純化過程,而基于體外連接的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)需要進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,可能會(huì)由于轉(zhuǎn)錄過程中引入其他突變而導(dǎo)致拯救失敗?；贐AC載體的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)可以有效彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)。BAC載體的低拷貝以及可容納大片段插入的特性,使PEDV全長(zhǎng)基因組可在BAC載體上穩(wěn)定保存,從而對(duì)病毒全長(zhǎng)基因組的任意區(qū)段進(jìn)行基因編輯,同時(shí)也避免了PEDV的復(fù)制酶基因片段不穩(wěn)定的問題[20]。

全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建是構(gòu)建病毒感染性克隆的關(guān)鍵,冠狀病毒是基因組最大的RNA病毒,長(zhǎng)片段擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致保真度降低,這給全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建造成了較大的困難。因此,我們將病毒基因組分成8個(gè)節(jié)段進(jìn)行擴(kuò)增,同時(shí)使用PfuⅡ高保真的DNA聚合酶,這樣可高效擴(kuò)增PEDV YJH片段且能夠有效避免突變的發(fā)生。此外,由于293T細(xì)胞擁有高效的轉(zhuǎn)染效率,我們采用先轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收取細(xì)胞培養(yǎng)上清再感染PEDV易感細(xì)胞Vero的策略拯救PEDV流行毒株YJH141,成功建立了流行毒株P(guān)EDV YJH的反向遺傳操作平臺(tái),獲得了感染性拯救病毒YJH141。通過IFA、空斑和生長(zhǎng)曲線測(cè)定驗(yàn)證了該拯救病毒與親本病毒在生物學(xué)特性方面保持一致。但由于全長(zhǎng)感染性克隆質(zhì)粒較大,在全長(zhǎng)基因組上進(jìn)行點(diǎn)突變或結(jié)構(gòu)區(qū)域的突變需要先在小片段上進(jìn)行編輯,然后所有片段進(jìn)行酶切和連接,操作較為繁瑣,因此我們可以通過向該體系內(nèi)引入CRISPR-Cas9系統(tǒng)高效編輯PEDV全長(zhǎng)基因組。通過向?qū)NA的設(shè)計(jì)可以使Cas9成為一種可編程的核酸內(nèi)切酶,CRISPR-Cas9系統(tǒng)可用于精準(zhǔn)的大片段基因敲除和插入,可于體外高效編輯全長(zhǎng)感染性克隆質(zhì)粒,有助于提高克隆效率[21-22]。

反向遺傳學(xué)技術(shù)是研究病毒分子遺傳學(xué)十分重要的技術(shù)平臺(tái)。通過反向遺傳學(xué)探究PEDV的生物學(xué)特性也是近年來的研究熱點(diǎn)。有研究將PEDV毒株FJzz1在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代200次后發(fā)現(xiàn),在其S1蛋白的N端發(fā)生了連續(xù)的氨基酸缺失,并且該毒株的毒力有明顯下降[23]。另外,SATO等[24]將PEDV毒株83P-5在Vero細(xì)胞傳代至100代時(shí)S蛋白發(fā)生的13個(gè)氨基酸突變與DR13細(xì)胞適應(yīng)株S蛋白的氨基酸突變基本相同。以上研究提示PEDV S蛋白中氨基酸的突變可能是導(dǎo)致PEDV適應(yīng)細(xì)胞及毒力變化的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。這些毒株在傳代過程中出現(xiàn)的相關(guān)位點(diǎn)突變是否直接決定了其毒力及細(xì)胞適應(yīng)性的變化需要通過反向遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述,本研究以BAC系統(tǒng)為基礎(chǔ),成功構(gòu)建了PEDV流行毒株YJH141的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng),為后續(xù)探究該病毒復(fù)制及致病機(jī)制的相關(guān)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ),也將為弱毒疫苗的研制提供平臺(tái)。