石彩玲，田 俠，孫一鳴，劉慶

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 山東青島 266109）

甘薯【Ipomoea batatas（L.）Lam.】含有 豐富的淀粉、可溶性糖、維生素和礦質(zhì)元素等，是一種兼具營(yíng)養(yǎng)和保健功能的農(nóng)產(chǎn)品[1]，可加工成薯片、薯?xiàng)l或經(jīng)蒸、煮、烤后直接食用。甘薯中可溶性糖的組成及含量是影響其甜度、黏度、薯香味等食味指標(biāo)的重要因子[2-3]，常作為評(píng)價(jià)甘薯食味品質(zhì)和加工性能的重要指標(biāo)[4]。由于受測(cè)試方法所限，研究者僅對(duì)其中的葡萄糖、果糖、蔗糖等含量較高的糖分有較為詳細(xì)的分析，而對(duì)含量相對(duì)較低的其它單糖或低聚糖并未關(guān)注[5-6]，然而，這些糖組分對(duì)甘薯保健功能的發(fā)揮同樣具有重要作用[7-8]。

目前可溶性糖含量的測(cè)定方法主要有分光光度法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法等[9-14]。比色法測(cè)定樣品的可溶性總糖含量，無(wú)法對(duì)可溶性糖分的組成進(jìn)行測(cè)定[15]；毛細(xì)管電泳法則需要對(duì)糖類(lèi)進(jìn)行衍生后才能通過(guò)紫外吸收進(jìn)行測(cè)定，由于糖類(lèi)的紫外吸收一般較弱，因此該方法測(cè)定的精度沒(méi)有保證[16]；由于糖類(lèi)的揮發(fā)性差，利用氣相色譜法同樣需經(jīng)過(guò)衍生后才能實(shí)現(xiàn)色譜分離，操作步驟繁瑣且精度不高[17]；液相色譜法雖然不需衍生，但是常規(guī)的液相色譜一般選用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器或示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，檢出限高，對(duì)一些含量偏低的糖組分無(wú)法檢出[13]；離子色譜可利用其陰離子交換色譜柱對(duì)可溶性糖組分進(jìn)行分離，無(wú)需衍生，并且離子色譜法還搭配了脈沖安培檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，方法的靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)較低含量糖組分的定量檢測(cè)[18]。然而，對(duì)甘薯來(lái)講，由于其營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜，加之不同糖組分在提取液中的溶解性差別較大，導(dǎo)致測(cè)定過(guò)程中干擾較多，影響測(cè)試精度。

在總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)及存在問(wèn)題的基礎(chǔ)上，針對(duì)甘薯塊根中基質(zhì)組成的特點(diǎn)，本文采用80%乙醇水溶液超聲振蕩提取其中可溶性糖組分，通過(guò)活化的RP 柱去除疏水有機(jī)物雜質(zhì)，最后采用離子色譜-脈沖積分安培檢測(cè)法（IC-PAD）對(duì)提取液中10種可溶性糖組分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與材料

ICS-5000 離子色譜儀，美國(guó)Thermo Dionex公司；Carbo Pac PA20 色譜柱和保護(hù)柱，美國(guó)Thermo Dionex 公司；RP 前處理柱，美國(guó)Thermo Dionex 公司；Milli-Q 超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津萊玻特瑞公司；冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

10 種糖（葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、棉子糖和水蘇糖）標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma 公司。甘薯樣品取自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高科技示范園（膠州）試驗(yàn)基地。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱(chēng)取10 種糖標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg 于三角瓶中，加適量水溶解后無(wú)損轉(zhuǎn)移至100.0 mL 容量瓶并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用前根據(jù)需要用超純水稀釋配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3 儀器配置與色譜條件

Carbo Pac PA20（3 mm×150 mm）陰離子交換色譜柱和Carbo Pac PA20（3 mm×50 mm）保護(hù)柱，RP 前處理 柱。流動(dòng)相：18.2 MΩ 超純水、250 mmol/L NaOH、1.0 mol/L CH3COONa。樣品進(jìn)樣體積10 μL，柱溫30 ℃，ED5000 脈沖安培檢測(cè)器，AS-AP 自動(dòng)進(jìn)樣器，Au 工作電極，糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)四電位波形。色譜柱梯度淋洗分離程序如表1。混合標(biāo)準(zhǔn)液各可溶性糖組分譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 10 種糖組分混合標(biāo)準(zhǔn)液譜圖Fig.1 Spectrogram of mixed standard solution of 10 soluble sugar constituents

表1 離子色譜梯度淋洗分離程序Table 1 Gradient conditions of ion chromatography column

1.4 提取液制備

隨機(jī)選擇形狀類(lèi)似紡錘形、質(zhì)量為400 g 左右薯塊5 個(gè)，去皮切絲后，分別放入105 ℃鼓風(fēng)烘箱和冷凍干燥機(jī)干燥至恒重，磨細(xì)過(guò)篩后備用。取不同干燥方式的樣品各0.5 g（精確至0.0001 g），分別置于50 mL 離心管中，加入40 mL 80%的乙醇水溶液（乙醇∶水=8∶2），超聲萃取60 min 后（超聲時(shí)加自來(lái)水循環(huán)控制水溫不超過(guò)15 ℃），再放入振蕩器繼續(xù)振蕩提取2 h，放置澄清。取上清液2 mL 于冷凍離心機(jī)中10 000 r/min 冷凍離心5 min，取1 mL 上清液用超純水稀釋100 倍，取一定量的溶液過(guò)0.22 μm 濾膜及已活化的RP 柱，棄去前約0.5 mL 樣品，收集后續(xù)樣品上機(jī)測(cè)定其中葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖和水蘇糖等不同組分含量。每個(gè)樣品做3 次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制。利用DPS14.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan 法進(jìn)行平均數(shù)間的顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平取P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本試驗(yàn)中采用80%乙醇水溶液提取樣品中的可溶性糖組分，主要因?yàn)楦适碇械矸酆肯鄬?duì)較高，若單純用超純水提取，容易造成樣品中的其它基質(zhì)成分溶解過(guò)多對(duì)測(cè)定干擾過(guò)大[19]；同時(shí)，還可以減少提取過(guò)程中淀粉的水解。而采用超聲+振蕩提取則可提高提取效果，并且在超聲過(guò)程中控制水溫在15 ℃，主要是為防止超聲過(guò)程易使溫度升高，而溫度的升高會(huì)增加淀粉酶的活性，加速樣品中淀粉分解為可溶性糖[20]，給試驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)誤差。為此，本試驗(yàn)在超聲提取過(guò)程中，通過(guò)接入循環(huán)水以控制水溫，以降低淀粉酶活性，減少淀粉水解給試驗(yàn)帶來(lái)的誤差。采用超聲+振蕩方式進(jìn)行提取，確保對(duì)樣品中可溶性糖組分提取更加完全，增加測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 色譜柱選擇和淋洗條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱選擇 目前用于小分子可溶性糖分離的陰離子交換色譜柱有：CarboPac MA1、CarboPac PA1、CarboPac PA10 和CarboPac PA20。根據(jù)各色譜柱在分離不同糖組分時(shí)的特點(diǎn)，本試驗(yàn)選擇使用CarboPac PA20 色譜柱對(duì)各糖組分進(jìn)行分離。主要因?yàn)镃arboPac PA20 色譜柱延續(xù)了CarboPac 型色譜柱的特點(diǎn)，采用無(wú)孔基球附聚雙官能季銨功能基填料，柱容量較低，分離速度快，分離效果好[21]。而CarboPac MA1 色譜柱因柱容量偏大，對(duì)溶劑消耗量大，且各成分保留時(shí)間延長(zhǎng)，在對(duì)可溶性糖各組分分離時(shí)效率低，而更適合于弱電離的糖醇類(lèi)化合物的檢測(cè)[17]；CarboPac PA1色譜柱基質(zhì)粒徑較大，柱效低，且其在弱堿性條件下工作時(shí)，存在較為明顯的溶解氧負(fù)峰干擾，降低了各糖組分檢測(cè)的靈敏度[17]；CarboPac PA10 色譜柱雖然克服了CarboPac PA1 存在的問(wèn)題，在不同濃度的OH-1濃度下均具有較高的靈敏度，但其柱效仍低于CarboPac PA20[17]。

2.2.2 淋洗條件優(yōu)化 糖類(lèi)分子具有電化學(xué)活性，在OH－存在的條件下，它們會(huì)部分或全部以陰離子形式存在，可以在陰離子交換色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離[22]。此時(shí)，淋洗液中的OH－有兩個(gè)作用：一是作為淋洗離子，OH－濃度增大，糖在色譜柱上的保留時(shí)間縮短，二是提供糖解離所需的堿性環(huán)境，OH－濃度增大，糖分子的離子化程度提高，其在色譜柱上的保留時(shí)間延長(zhǎng)。因此，糖分在色譜柱中的保留時(shí)間是上述兩種作用共同影響的結(jié)果[23]。因此，本試驗(yàn)在對(duì)甘薯中10 種可溶性糖組分進(jìn)行分離時(shí)，選用NaOH 和NaOAc 組合淋洗液進(jìn)行梯度淋洗，在開(kāi)始的前30 min 采用逐漸增加NaOH 溶液濃度、30～35 min 采用氫氧化鈉和乙酸鈉組合溶液進(jìn)行梯度洗脫，不僅可以有效提高各糖組分的分離效果，同時(shí)可以提高響應(yīng)的靈敏度。

2.3 色譜柱柱溫和淋洗液流速

色譜柱溫度主要通過(guò)影響柱內(nèi)填料的活性，影響系統(tǒng)壓力從而影響色譜峰的分離效果[24]。由于多數(shù)單糖和低聚糖均為具有極性帶電物質(zhì)，它們與色譜柱的作用力主要是庫(kù)侖力[25]，因此，溫度對(duì)其分離效果影響不大。淋洗液流速主要通過(guò)改變各成分在分離柱中的保留時(shí)間，從而影響分離效果。流速越低保留時(shí)間越長(zhǎng)，流速越高分離度越差[26]。根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，選擇色譜柱溫30 ℃，淋洗液流速0.4 mL/min，既保證色譜峰峰形，又能保證較好的分離效果。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度與檢出限

配制了質(zhì)量濃度為100 mg/L 的10 種糖組分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別稀釋其濃度至0.02～20 mg/L 的10 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，利用以上選定的方法對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行離子色譜分析，并利用10種糖的峰面積（y）與其相應(yīng)的濃度（x）之間關(guān)系進(jìn)行線性擬合，得到10 種糖分濃度與峰面積之間的線性方程，其線性相關(guān)系數(shù)在0.9904～0.9987 之間。然后，取1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)液樣品，利用以上選定的方法重復(fù)測(cè)定5 次，計(jì)算出平行樣品間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.57%～1.89%之間。然后，根據(jù)3倍信噪比分別計(jì)算出10 種糖的檢出限為16.73～57.96 μg/L。以上所有測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。從以上試驗(yàn)結(jié)果可以看出，本方法測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好、精密度高，線性范圍和檢出限均滿足樣品檢測(cè)需求。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、檢出限Table 2 Linear range，limits of detection for every soluble sugar

2.5 回收率與實(shí)際樣品測(cè)定

選擇105 ℃下鼓風(fēng)烘干的甘薯樣品提取液，向待測(cè)液樣品中添加2.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，和待測(cè)樣品一起利用選定的方法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)甘薯樣品中各種可溶性糖組分的含量。并根據(jù)原樣品中各糖組分濃度、添加濃度和添加后的測(cè)定濃度計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3 可以看出，樣品中不同糖組分的回收率在94.5%～106.5%之間。

表3 回收率與樣品測(cè)試結(jié)果Table 3 Recovery and results of real samples

從實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果看，熱風(fēng)干燥處理的各可溶性糖組分及其總量均高于冷凍干燥處理，葡萄糖、果糖和蔗糖在兩種干燥方式樣品中含量均較高，而熱風(fēng)干燥樣品中麥芽糖含量為冷凍干燥樣品中的12.9 倍，說(shuō)明熱風(fēng)干燥過(guò)程使淀粉酶活性提高從而促進(jìn)淀粉分解成麥芽糖。另外，在熱風(fēng)干燥樣品中還檢測(cè)出冷凍干燥樣品未檢出的棉子糖和水蘇糖，說(shuō)明這兩種糖分可能并非在甘薯生產(chǎn)中形成，而是樣品干燥處理過(guò)程中由其它糖分轉(zhuǎn)化而來(lái)。

3 結(jié)論

本研究建立了低溫超聲振蕩提取、離子色譜-脈沖積分安培檢測(cè)（IC-PAD）同時(shí)測(cè)定甘薯中10種可溶性糖組分的方法。結(jié)果表明，樣品經(jīng)80%的乙醇水溶液低溫超聲振蕩提取，不僅提高了提取效率，還降低了雜質(zhì)溶出率。再經(jīng)濾膜過(guò)濾和RP柱凈化，極大的減少了色譜分離時(shí)的雜質(zhì)干擾。通過(guò)調(diào)節(jié)淋洗液組合濃度、柱溫和淋洗液流速，使不同糖組分實(shí)現(xiàn)良好分離，且可保證在35 min 內(nèi)完成10 種糖的分離測(cè)定。經(jīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線系列樣品的多次重復(fù)測(cè)定和加標(biāo)回收率計(jì)算，6 種單糖線性范圍為0.02～10 mg/L，其它4 種糖線性范圍為0.02～20 mg/L。10 種糖組分加標(biāo)回收率94.5%～106.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.57%～1.89%。本方法線性范圍廣、操作簡(jiǎn)單、分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于對(duì)甘薯提取液中多種可溶性糖組分的同時(shí)測(cè)定。

樣品測(cè)定結(jié)果表明，熱風(fēng)干燥處理可使甘薯樣品可溶性糖含量增加，尤其是麥芽糖增加最為明顯。另外，熱風(fēng)干燥還可以促進(jìn)棉子糖和水蘇糖的生成，由于這兩種功能性低聚糖在冷凍干燥樣品中并未檢出，因此推斷其并非在甘薯生長(zhǎng)過(guò)程中合成，而是在熱風(fēng)干燥過(guò)程中由其它糖分轉(zhuǎn)化而來(lái)。