穆紅，羅瑞明，李亞蕾

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院 銀川 750021）

骨骼是家畜酮體的重要組成部分，年產(chǎn)量巨大，營養(yǎng)物質(zhì)非常豐富，新鮮的畜骨含有11%～15%的蛋白質(zhì)，酶解可將畜骨水解為小分子肽和氨基酸[1]。牛骨酶解液經(jīng)過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生牛肉風(fēng)味，美拉德反應(yīng)是氨基、羰基化合物通過3 個(gè)階段的反應(yīng)最終形成肉香味物質(zhì)的過程[2]。

美拉德反應(yīng)過程十分復(fù)雜，產(chǎn)生的風(fēng)味與氨基酸種類、還原糖種類、溫度、時(shí)間、pH 值等多個(gè)因素有關(guān)[3]，其中溫度和時(shí)間對滋味及風(fēng)味有較大影響。潘曉倩等[4]研究發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物種類與烘焙溫度和時(shí)間成正比。Jiang等[5]研究發(fā)現(xiàn)半乳糖-牛酪蛋白肽美拉德反應(yīng)的游離氨基含量隨溫度的升高而增加。章銀良等[6]研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在不同溫度條件下得到的抗氧化物質(zhì)主要是醛類、酮類、酚類、烯烴和雜環(huán)類物質(zhì)。

本研究將牛骨酶解液與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（HSSPME-GC/MS）等方法分析不同熱處理溫度、時(shí)間對EBBH-MRP 呈味特性及風(fēng)味品質(zhì)的影響，旨在為牛骨呈味基料的制備提供技術(shù)參考，提高牛的副產(chǎn)物綜合利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮秦川牛骨購于寧夏尚農(nóng)生物科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司。

中性蛋白酶（酶活力5×104U）、風(fēng)味蛋白酶（酶活力1×105U），北京索萊寶科技有限公司；D-木糖、葡萄糖、維生素B1、L-Cys 等其它分析純試劑（食品級），浙江一諾生物科技有限公司；色譜純試劑正構(gòu)系列烷烴（C7～C30）、1，2-二氯苯，美國Sigma 公司；色譜純有機(jī)試劑，美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LA8080 氨基酸自動分析儀，日本株式會社日立高新技術(shù)科學(xué)有限公司；1260 高效液相色譜儀，美國AgiLent 公司；集熱式磁力攪拌器DF-101S（分體款），上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨酶解液的制備 牛骨經(jīng)破碎后，去除可見的殘余肉和骨髓，然后用去離子水清洗，于0.1 MPa 條件下，高壓蒸煮2.5 h，然后50 ℃烘干6 h。粉碎后過100 目篩得牛骨粉，取適量牛骨粉于100 mL 錐形瓶中，同時(shí)添加中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，加一定量的去離子水，攪拌均勻后，放入恒溫振蕩儀中進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后滅酶（90 ℃，10 min），冷卻然后離心（4 000 r/min，10 min），取上清液。

1.3.2 EBH-MRP 的制備 將牛骨酶解液20 mL、L-Cys 0.6 g、D-木糖0.4 g、葡萄糖0.4 g、維生素B10.04 g，混勻后放入油浴鍋中，分別在（110，115，120，125，130 ℃）條件下反應(yīng)40 min；115 ℃條件下反應(yīng)25，40，55，70，85 min，得到EBBHMRP，于4 ℃冷藏24 h 后進(jìn)行下一步分析。

1.3.3 氨基酸含量的測定 對樣品中的16 種游離氨基 酸（Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Cys、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys）進(jìn)行定量分析。色譜柱型號為Zorbax Eclipse-AAA（150 mm×4.6 mm，5 μm），高效液相色譜法按照錢敏等[7]的方法進(jìn)行。

1.3.4 呈味核苷酸含量的測定 將1 mL 酶解液放入50 mL 離心管中，加入25 mL 去離子水，離心（10 000 r/min，4 ℃，20 min），將上清液放入50 mL離心管中，定容，用0.22 μm 濾膜過濾，待測。

高效液相色譜條件：色譜柱：TSK-gel ODS－80 TM（4.6 mm×250 mm），柱溫：30 ℃，紫外檢測波長：254 nm，進(jìn)樣量：10 μL，流速：0.8 mL/min。流動相：洗脫液A 為0.05 mol/L 甲醇，洗脫液B 為0.05 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖液（pH 5.4）；流動相用0.45 μm 濾膜過濾，室溫下超聲脫氣30 min。采用二元流動相進(jìn)行梯度洗脫分離，檢測時(shí)間：23 min；磷酸二氫鉀隨時(shí)間配比為：0 min：0～100%；11 min：10%～90%；18 min：0～100%；23 min：0～100%。

1.3.5 HS-SPME-GC/MS 分析 固相微萃取條件：取2 mL 樣品放入15 mL 頂空瓶，并加入內(nèi)標(biāo)液（6.42 μg/mL 的1，2-二氯苯，4 μL），渦旋儀混勻，然后用聚四氟乙烯隔膜密封頂空瓶口，50 ℃下保溫20 min，用活化好的75 μm Carboxen/PDMS萃取頭在進(jìn)樣瓶頂空部分進(jìn)行吸附，50 ℃吸附20 min，然后插入GC 進(jìn)樣口，250 ℃解吸7 min。

GC 條件：TR-35 MS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；升溫條件：初始溫度35 ℃，持續(xù)3 min，以2.5 ℃/min 升至70 ℃，然后以8 ℃/min 升至150 ℃，最后以20 ℃/min 的速率上升到230 ℃，保持5 min。

MS 條件：檢測器溫度280 ℃；離子源溫度200 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍30～500 m/z。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。在NIST 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫中自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并通過揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物1，2-二氯苯進(jìn)行相對定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理溫度對EBBH-MRP 呈味物質(zhì)的影響

不同溫度測定的游離氨基酸及風(fēng)味核苷酸含量及變化趨勢如表1 和圖1 所示。游離氨基酸的存在使熱處理樣品有不同的滋味。在美拉德反應(yīng)中，寡肽可以通過熱處理降解為游離氨基酸。在不同熱處理溫度條件下，總游離氨基酸含量逐漸降低，這是因?yàn)橛捎谄鋮⑴c了美拉德反應(yīng)，溫度繼續(xù)升高至130 ℃時(shí)氨基酸含量增加，這可能是因?yàn)殡脑诟邷叵陆到狻Ｔ跍囟?10～125 ℃范圍內(nèi)，游離氨基酸含量隨著溫度的上升逐漸下降，這可歸因于美拉德反應(yīng)過程中Strecker 的增強(qiáng)和游離氨基酸在半胱氨酸存在下的熱反應(yīng)中熱降解形成揮發(fā)性化合物，此外，還有可能是糖和游離氨基酸或結(jié)合氨基酸之間的交聯(lián)形成非揮發(fā)性化合物[8]。這與Liu等[9]的研究結(jié)果相吻合。

圖1 熱處理樣品中相關(guān)氨基酸含量隨溫度的變化趨勢Fig.1 Variation trend of related amino acid content in heat-treated samples with temperature

游離氨基酸根據(jù)官能團(tuán)不同分為苦味氨基酸（組氨酸、精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸）、鮮味氨基酸（谷氨酸、半胱氨酸）和甜味氨基酸（包括絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和賴氨酸）。在不同熱處理溫度條件中，苦味氨基酸含量均較高，呈苦味的組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸含量均下降，蛋氨酸含量增加。但苦味氨基酸含量與苦味并沒有直接關(guān)系，低于其閾值的苦味氨基酸具有提鮮和增加滋味復(fù)雜的作用[10]。呈鮮味的半胱氨酸含量隨著溫度的上升而下降，這可能是因?yàn)槠鋮⑴c美拉德反應(yīng)過程中揮發(fā)性化合物的形成[11]。甜味氨基酸穩(wěn)定增加，其中蘇氨酸、丙氨酸含量升高，賴氨酸含量下降，這是因?yàn)榧訜徇^程中蛋白質(zhì)降解形成甜味氨基酸增加。

呈味核苷酸由嘌呤堿基或嘧啶堿基、核糖或脫氧核糖和磷酸組成。核苷酸能與氨基酸協(xié)同增鮮，并可以提升總體風(fēng)味[12]。由表1 可知，不同熱處理溫度對核苷酸類物質(zhì)的影響不同，牛骨酶解液經(jīng)熱處理后，檢測出了5'-GMP 和5'-IMP 兩種核苷酸，5'-GMP 和5'-IMP 是重要的鮮味核苷酸。在美拉德反應(yīng)中，ATP 在ATP 酶等的作用下轉(zhuǎn)化為ADP，然后在磷酸激酶的作用下降解為AMP，再脫氫形成IMP。隨著溫度的升高，兩種核苷酸的含量均增加，115 ℃略有下降，主要的原因可能是隨著溫度的升高，RNA 更容易被破壞，有利于5'-GMP 和5'-IMP 的釋放[13]。檢測到的5'-GMP 含量高于5'-IMP，說明在牛骨酶解液美拉德反應(yīng)中，5'-GMP 對鮮味所做的貢獻(xiàn)大于5'-IMP。

2.2 熱處理溫度對EBBH-MRP 揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響

不同熱處理溫度的EBBH-MRP 的揮發(fā)性風(fēng)味成分種類和含量見表2，通過比較峰面積和內(nèi)標(biāo)物的峰面積來計(jì)算這些化合物的貢獻(xiàn)。不同熱處理溫度共檢測出62 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其主要為醇類、醛類、酮類、酸類和雜環(huán)類化合物。在不同熱處理溫度下均檢測到1-丁醇、1-己醇、苯甲醇、苯基乙醇、苯甲醛、糠醛、1-（1H-吡咯-2-基）-乙酮、乙酸、苯甲酸、丁酸、3-甲基丁酸、辛酸、戊酸、丙酸、2-甲基丙酸、吡咯、1，3-二氯-苯、芐腈、苯酚等19 種揮發(fā)性物質(zhì)。不同溫度條件下的EBBHMRP 經(jīng)HS-SPME-GC/MS 分析，在110，115，120，125，130 ℃條件下分別檢測出38，38，34，42，35 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，含量分別為176.86，195.33，144.06，142.00，148.24 μg/kg。

表2 不同熱處理溫度的EBBH-MRP 的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其含量Table 2 Volatile flavor compounds and their contents of EBBH-MRP at different heat treatment temperatures

熱處理后形成的揮發(fā)性化合物可分為3 類：1）糖脫水或破碎產(chǎn)物（如呋喃、羰基和酸）；2）氨基酸通過降解得到的產(chǎn)物（例如：醛類）；3）進(jìn)一步作用產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物（例如：吡咯、吡啶、咪唑和噻唑）。由表2 及圖2 可知，醇類化合物含量隨著熱處理溫度的增加明顯降低，其中1-丁醇隨溫度升高變化明顯，說明溫度對1-丁醇含量影響大，醇類化合物對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的氣味有協(xié)同增效作用，但對風(fēng)味的整體貢獻(xiàn)較小。

醛、酮類化合物是由于氨基酸、脂肪酸降解產(chǎn)生的，對肉香味貢獻(xiàn)大[14]。隨著熱處理程度增加，醛類化合物含量顯著增加，說明氨基酸降解加快。其中糠醛的含量變化較大?？啡┦荅BBH-MRP 中焦糖風(fēng)味的重要來源，羰基化合物經(jīng)Amadori 重排后脫氨，自身環(huán)化成糠醛類化合物[15]，這些化合物除了本身有水果、奶油香或焦糖香，還能修飾肉味[16-17]。苯甲醛在不同溫度條件下均被檢測到，其可能賦予產(chǎn)物脂香風(fēng)味。此外，醛類閾值低，有6～9 個(gè)碳時(shí)具有水果味、清淡味和脂肪味，與其它物質(zhì)具有重疊的風(fēng)味效應(yīng)，并對整體的風(fēng)味特征有貢獻(xiàn)。酮類化合物的閾值比醛類高，可以在較低的溫度下生成，如110 ℃，其含量隨著溫度的上升而增加。酮類物質(zhì)有花香、清香和水果香，對EBBHMRP 的風(fēng)味形成有益，反應(yīng)溫度為130 ℃條件下醛、酮類化合物含量最多。

雜環(huán)化合物主要有吡咯、吡啶、咪唑、吡嗪和噻唑。吡嗪、噻唑、吡咯類呈甜烤香味，其中吡嗪是肽美拉德反應(yīng)系統(tǒng)中最典型的揮發(fā)性化合物，它們的閾值非常低，這對酶解產(chǎn)物的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[18]。酯類化合物有甜的水果香，酯類和酮類物質(zhì)共存時(shí)能協(xié)調(diào)和平衡整體風(fēng)味[19]。不同溫度下檢測出了丁酸甲酯、乙酸丁酯、苯乙酸辛酯等酯類。不同熱處理溫度的EBBH-MRP 產(chǎn)生的酸類化合物相對含量相差不大，相對含量最高的是具有不良?xì)庀⒌囊宜幔岬拈撝捣浅８?，對酶解產(chǎn)物的風(fēng)味幾乎沒有影響。

2.3 熱處理時(shí)間對EBBH-MRP 呈味物質(zhì)的影響

如表3 和圖3 所示，不同熱處理時(shí)間（25，40，55，70，85 min）檢測到的總游離氨基酸含量整體呈上升趨勢，70 min 時(shí)最多。70 min 后游離氨基酸含量下降，過長時(shí)間的熱處理不利于游離氨基酸的積累，其較少的原因與熱預(yù)處理溫度下的原因分析相一致。隨著時(shí)間的延長，苦味氨基酸增加明顯，主要由于酪氨酸含量的增加，但其含量均低于呈味閾值，這時(shí)可增加其它氨基酸的鮮味和甜味。呈苦味的苯丙氨酸含量下降，這可能因?yàn)槠滢D(zhuǎn)化為苯甲醛等揮發(fā)性風(fēng)味。呈現(xiàn)鮮味的天冬氨酸和谷氨酸含量增加，其鈉鹽具有類似味精的鮮味，有助于改善酸味[20]。甜味氨基酸則整體呈下降趨勢，其中呈甜味的丙氨酸含量高，下降幅度大，丙氨酸在美拉德反應(yīng)過程中呈現(xiàn)焦糖味，說明隨著時(shí)間的延長，EBBH-MRP 的焦糖味不斷減弱。熱處理時(shí)間的長短影響各氨基酸的含量變化，合理控制熱處理時(shí)間能降低游離氨基酸損失，提升滋味。

表3 不同熱處理時(shí)間EBBH-MRP 的滋味物質(zhì)及其含量（mg/L）Table 3 Taste substances and their contents of EBBH-MRP with different heat treatment time（mg/L）

圖3 熱處理樣品中相關(guān)氨基酸含量隨時(shí)間的變化趨勢Fig.3 Variation trend of related amino acid contents in heat-treated samples with time

隨著熱處理時(shí)間的延長，檢測到5’-GMP、5’-IMP 兩種呈味核苷酸，其含量呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢。5’-IMP 可以提供令人愉悅的肉香味，Murata&Sakaguchi 研究發(fā)現(xiàn)黃尾魚中IMP 被降解后，其提取物鮮味顯著降低，當(dāng)添加2 mL IMP 后口感恢復(fù)，而添加味精則沒有恢復(fù)味覺的作用[21]。呈味核苷酸與谷氨酸混合可改善食品風(fēng)味，使得風(fēng)味更加圓潤、濃郁[22]。核苷酸隨時(shí)間延長含量增加的原因可能是由于RNA 逐漸被破壞，釋放出了更多的5’-GMP 和5’-IMP。

2.4 熱處理時(shí)間對EBBH-MRP 揮發(fā)性成分的影響

不同熱處理時(shí)間的EBBH-MRP 的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量如表4 所示。不同熱處理溫度共檢測出54 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，比不同溫度下檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類少8 種，說明溫度對EBBH-MRP 揮發(fā)性風(fēng)味的影響較大。在不同熱處理時(shí)間中均檢測到吡咯、苯甲醇、壬醛、糠醛、苯甲醛、蟻酸、丙酸、2-甲基丙酸、丁酸、3-甲基丁酸、戊酸、甲苯、芐腈、苯酚等14 種揮發(fā)性化合物。經(jīng)HS-SPME-GC/MS 分析，在25，40，55，70，85 min條件下分別檢測出30，38，37，36，29 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，含量分別為83.55，197.76，146.65，254.05，219.88 μg/kg。其中，40 min 產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量是25 min 的2 倍多，熱處理時(shí)間40 min 以上則含量上升較為平緩。由此可見，適當(dāng)?shù)臏囟扔兄诿览路磻?yīng)揮發(fā)性成分的積累。

表4 不同熱處理時(shí)間EBBH-MRP 的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其含量Table 4 Volatile flavor compounds and their contents in EBBH-MRP with different heat treatment time

不同熱處理時(shí)間的EBBH-MRP 揮發(fā)性風(fēng)味化合物總含量差異比較分析如圖4，醇類化合物含量隨著熱處理時(shí)間的增加而增加，其中40 min檢測出的1-丁醇含量較高，這可能是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)臒崽幚砜梢砸鹛囟ㄖ舅峤到?，釋放某些醇類化合物。醛類化合物含量不斷增加，?5 min 時(shí)又減少，含有肉的特征風(fēng)味的醛具有低閾值。不同熱處理時(shí)間均檢測出壬醛、糠醛、苯甲醛，它們由不飽和脂肪酸氧化和氨基酸降解生成，本身具有香味，是美拉德反應(yīng)后續(xù)階段的重要前體，與醇類、醛類、氨類發(fā)生縮合或聚合反應(yīng)，產(chǎn)生揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，從而影響EBBH-MRP 的色澤和風(fēng)味。壬醛能表現(xiàn)出新鮮味?？啡┦且环N不含硫呋喃類化合物，是焦糖風(fēng)味的重要來源，由半胱氨酸-Amadori 經(jīng)1，2-烯醇化形成3-脫氧鄰?fù)┨?，然后脫水而成，它也是如糠硫醇等其它雜環(huán)化合物的重要前體物質(zhì)，其含量隨時(shí)間的延長顯著增加。苯甲醛能產(chǎn)生脂香風(fēng)味，來源于苯丙氨酸，隨時(shí)間的延長，苯丙氨酸含量下降，苯甲醛含量上升。

圖4 不同熱處理時(shí)間的EBBH-MRP 中各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的變化趨勢Fig.4 Variation trend of volatile fLavor compounds in EBBH-MRP with different heat treatment time

酮是主要的糖類化合物，具有芳香活性，是美拉德反應(yīng)體系中的風(fēng)味前體，閾值低，對香氣的貢獻(xiàn)很大。酮類化合物隨時(shí)間的延長緩慢增加，在25 min 未檢測到酮類，說明酮類化合物的形成需要較長的時(shí)間。其中，二氫-2-甲基-3（2H）-呋喃酮、1-（2-呋喃基）-乙酮含量隨時(shí)間的延長不斷增加，這些呋喃衍生物在熱加工食品風(fēng)味的形成中發(fā)揮了重要作用[23]。酸類化合物一方面來自醇、醛在美拉德反應(yīng)過程中高溫氧化，另一方面來自長鏈脂肪酸降解。不同熱處理時(shí)間的酸類化合物的種類分別為13，12，12，11，9 種。其中55 min 后酸類化合物總含量上升，主要表現(xiàn)在乙酸含量的上升，說明較長的時(shí)間將增加不良?xì)馕丁３宜嵬馄溆嗨犷惢衔镫S時(shí)間變化相對含量相差不大，酸類化合物對整體的香氣貢獻(xiàn)不大。

還檢測到噻唑、4-甲基噻唑、吡咯、2-乙酰噻唑、4-甲基-1H 咪唑等雜環(huán)化合物，噻唑、吡咯類呈甜烤香氣，這些物質(zhì)通常被認(rèn)為是造成熟肉中烘烤風(fēng)味的原因，它們的閾值非常低，對EBBHMRP 的風(fēng)味有很大貢獻(xiàn)。熱處理55 min 后未檢測到噻唑及其化合物，且吡咯等風(fēng)味化合物含量降低，說明較長的熱處理時(shí)間對美拉德反應(yīng)風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。

3 結(jié)論

本研究采用游離氨基酸、核苷酸測定及HSSPME-GC/MS 等方法，分析了熱處理溫度和時(shí)間對EBBH-MRP 的游離氨基酸、風(fēng)味核苷酸和揮發(fā)性風(fēng)味化合物的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的上升，游離氨基酸含量逐漸減少。此外，還檢測出了5'-GMP 和5'-IMP 兩種核苷酸，其含量均隨溫度的升高而增加。經(jīng)HS-SPME-GC/MS 分析，不同溫度條件下分別檢測出38，38，34，42，35 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，含量分別為176.86，195.33，144.06，142.00，148.24 μg/kg。隨著時(shí)間的延長，游離氨基酸含量整體呈增加趨勢，檢測出的5'-GMP 和5'-IMP 含量也上升。經(jīng)HS-SPME-GC/MS 分析，不同時(shí)間條件下分別檢測出30，38，37，36，29 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，含量分別為83.55，197.76，146.65，254.05，219.88 μg/kg。