曾升友　梁子聰　陸瑞娜　劉琦　張樂少雄

【摘要】目的：觀察水族藥南燭根對(duì)骨折大鼠的血管生成作用，探討其對(duì)骨折的治療作用。方法：采用鋸開法建立大鼠脛骨干骨折模型。將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型對(duì)照組，陽性對(duì)照組（接骨七厘片20 mg/kg）、南燭根水提液高、中、低劑量組（400 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg），每組10只。建模后第2天起，各給藥組按照相應(yīng)劑量配置溶液灌胃，每天2次。假手術(shù)組和模型對(duì)照組不給予藥物，正常飲食。連續(xù)給藥2周。觀察大鼠骨痂鏡下形態(tài)和測(cè)量血管面積比，免疫組化法檢測(cè)骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)量。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比、骨痂VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比、骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組骨痂血管面積百分比、骨痂組織VEGF陽性表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。與陽性對(duì)照組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組骨痂VEGFR-2陽性表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：南燭根水提液可明顯促進(jìn)骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞分裂，促進(jìn)血管新生，從而達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的作用。

【關(guān)鍵詞】骨折愈合；南燭根；血管生成

【中圖分類號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2023）21-0021-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.21.zgmzmjyyzz202318006

Study of Shui Medicine Vaccinium Bracteatum Thunb. for Promoting? Angiogenesis in Tibia Fracture RatsZENG Shengyou1LIANG Zicong2*LU Ruina3LIU Qi2ZHANG Leshaoxiong2

1.Luodian County Hospital of Traditional Chinese Medicine， Luodian 550100，China;

2.Qiannan Medical College for NationalitiesDuyun City， Guizhou 558000，China;

3.People's Hospital of Qiannan， Duyun 558000，ChinaAbstract：Objective This study aimed to observe the therapeutic effect of shui medicine Vaccinium bracteatum Thunb for promoting angiogenesis in tibia fracture rats.Methods The model of tibial shaft fracture will be established by sawing. 60 rats were randomly divided into sham operation group， model control group， positive control group （Jiegu Qili Tablet 20 mg/kg）， and high，medium，low dose groups of water extract of Vaccinium bracteatum Thunb.（400 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg），with 10 in each.Except for the sham operation group，all groups will be gavaged according to the corresponding dose，1time/d，continuous for 2 weeks.After the treatment，Observe the morphology of rat callus under microscope and measure the? Morphology of bone callus and the percentage of vascular area were measured.The relative expression of VEGF and VEGFR-2 protein was detected by immunohistochemistry.Results Compared with the sham operation group， the percentage of vascular area and the positive expression of VEGF and VEGFR-2 in model control group， positive control group， low dose group， medium dose group and high dose group were significantly higher （P<0.05）.Compared with the model control group，the percentage of vascular area and the positive expression of VEGF and VEGFR-2 in positive control group， low dose group， medium dose group and high dose group were significantly higher （P<0.05）.Compared with the positive control group and the high dose group，the percentage of vascular area andVaccinium bracteatum the positive expression of VEGF in low dose group， medium dose group were significantly lower （P<0.05）.Compared with the positive control group，the positive expression of VEGFR-2 in low dose group， medium dose group and high dose group were significantly lower （P<0.05）.Conclusions Extraction ofshui medicine Vaccinium bracteatum Thunb. could significantly enhance the positive expression of VEGF and VEGFR-2 in bone tissue， also could promote endothelial cell division and angiogenesis， which mechanism is advantage for fracture healing.

Keywords：Fracture Healing; Vaccinium Bracteatum Thunb. ; Angiogenesis

隨著國(guó)家人口的老齡化和工業(yè)交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展，臨床上骨折的發(fā)病率越來越高［1］。豐富的血液供應(yīng)是骨折愈合的基礎(chǔ)，而VEGF是促進(jìn)血管新生的關(guān)鍵因子［2］。南燭根是杜鵑花科植物烏飯樹Vaccinium bracteatum Thunb.的根［3］，水族民間常將其用于治療骨折，但其促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制至今尚未明確。本課題建立脛骨骨折大鼠模型，觀察水族藥南燭根對(duì)骨折大鼠的血管生成作用，探討其對(duì)骨折的治療作用，為揭示其作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1材料

1.1動(dòng)物SD大鼠（清潔級(jí)）60只，體重200～220g，雄性。每組分籠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，期間飲水、喂食正常進(jìn)行，購(gòu)于湖南長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司［動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0014］。

1.2藥材與試劑水藥南燭根中藥飲片采自貴州三都水族自治縣內(nèi)，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院民族醫(yī)學(xué)科教授胡建山鑒定為杜鵑花科植物烏飯樹Vaccinium bracteatum Thunb.的根。蘇木精伊紅液、Masson染液（上海碧云天公司），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）免疫組化抗體試劑盒（北京中杉金橋公司）。接骨七厘片（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20003140，湖南金沙藥業(yè)有限公司），其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2方法

2.1南燭根水提液制備將南燭根碾碎，以10倍超純水浸泡0.5 h，煎鍋煎煮1.5 h，重復(fù)提取2次，混合藥液旋蒸儀濃縮至濃度1.5 g/mL，存放4 ℃冰箱備用。

2.2模型建立及分組采用鋸開法建立大鼠脛骨干骨折模型。所有SD大鼠均以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，以平臥位固定于造模臺(tái)。碘伏消毒左足至左大腿上段，于脛骨結(jié)節(jié)下方2 mm沿脛骨脊作1.5 cm縱向切口，剝離外皮，繼續(xù)沿脛骨脊外側(cè)0.5 mm位置將淺筋膜與深筋膜層縱向切開，游離脛骨前肌群，暴露脛骨外骨面。采用5 mL注射器針頭于脛骨髕韌帶開口，插入克氏針沿髓腔達(dá)脛骨粗隆間，于脛骨中段前方最高點(diǎn)鋸開約3 mm左右缺損，缺損達(dá)骨髓腔，形成脛骨中段橫行骨折。繼續(xù)插入克氏針穿過骨折位置貫穿整個(gè)脛骨髓腔，固定骨折，剪除多余克氏針，將其遠(yuǎn)端埋于骨皮質(zhì)下。以0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后逐層縫合切口，涂抹適量紅霉素軟膏，連續(xù)3 d每天注射8萬U青霉素以預(yù)防感染。成功建立大鼠脛骨骨折模型后，將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型對(duì)照組，陽性對(duì)照組（接骨七厘片20 mg/kg）、南燭根水提液高、中、低劑量組（400 mg/kg，200 mg/kg，100 mg/kg），每組10只。建模后第2天起，各給藥組按照相應(yīng)劑量配置溶液灌胃，每天2次。假手術(shù)組和模型對(duì)照組不給予藥物，正常飲食。連續(xù)2周。

2.3鏡下病理及血管新生情況觀察處死大鼠后，以骨折位置作為中心，上下各取5 mm×5 mm骨痂組織標(biāo)本，以4%多聚甲醛固定24 h，組織塊常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制作成厚度5 μm的切片，脫蠟后Masson染色，光鏡下拍照，采用Image ProPlus Software 6.0 IPP軟件測(cè)定新生血管面積百分比（血管面積/截圖面積），在骨痂愈合平面單位視野內(nèi)隨機(jī)選取10個(gè)不相鄰視野，計(jì)算每個(gè)視野平均值。

2.4免疫組化法檢測(cè)骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)量切片常規(guī)脫蠟復(fù)水后，微波修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化酶，BSA封閉滴加一抗（VEGF 1∶400，VEGFR-2 1∶400）4 ℃過夜，次日37 ℃復(fù)溫漂洗后二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，經(jīng)脫水透明后封片，應(yīng)用image pro圖像軟件測(cè)定骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)量。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本資料組間比較采用單因素方差分析及重復(fù)測(cè)量方差分析，經(jīng)Levene檢驗(yàn)滿足方差齊性者，采用單因素方差分析，以最小顯著性差異LSD-t檢驗(yàn)行兩兩比較；方差不齊者，采用Welch檢驗(yàn)，再以Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1各組大鼠骨痂鏡下病理觀察和血管面積測(cè)定結(jié)果的比較假手術(shù)組大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)見骨小梁大小、粗細(xì)、間隔均勻一致，骨小梁間隔中可見散在血管穿過。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠脛骨骨痂內(nèi)可見大量的成熟軟骨細(xì)胞，有豐富的新生微血管，骨小梁較粗、大小不均。與模型對(duì)照組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組鏡下表現(xiàn)相似，而陽性對(duì)照組和南燭根水提液高劑量組軟骨細(xì)胞更加成熟，骨小梁粗大、密集，骨小梁間隔可見豐富的血管。如圖1。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比顯著增高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比顯著增高（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組骨痂血管面積百分比明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

3.2大鼠脛骨骨痂VEGF、VEGFR-2免疫組化陽性表達(dá)結(jié)果的比較與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠骨痂VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組大鼠骨痂VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組骨痂VEGF陽性表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與陽性對(duì)照組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組骨痂VEGFR-2陽性表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。如圖1、圖2、圖3所示。

4討論

骨折是臨床上骨科最常見的疾病之一。骨折愈合的速度決定了患者回歸正常生活的時(shí)間，如何促進(jìn)骨折快速愈合是臨床醫(yī)師共同面對(duì)的難題。骨折愈合是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，骨折的早期階段由間充質(zhì)干細(xì)胞聚集于骨折斷端，然后其可分化為纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及原始軟骨細(xì)胞，是最早骨細(xì)胞的來源，促進(jìn)成骨反應(yīng)［4］。通過成骨細(xì)胞的骨膜成骨和軟骨細(xì)胞的骨化形成原始骨組織，然后產(chǎn)生軟骨基質(zhì)和無機(jī)鹽沉淀礦化成骨［5］。新生血管的形成和豐富的血液供應(yīng)是許多細(xì)胞發(fā)揮其生長(zhǎng)和修復(fù)功能的重要因素［6］。研究［7］證明，VEGF可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂，增加血管通透性，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管新生。VEGFR-2是VEGF的特異性抗體，兩者結(jié)合可以誘導(dǎo)新的血管生成。研究顯示，通過拮抗劑競(jìng)爭(zhēng)性與VEGFR結(jié)合，從而抑制了VEGF活性，引起小鼠股骨骨折模型愈合障礙［8］。動(dòng)物骨折模型可以分為開放性和閉合性造模，開放性骨折模型主要是采用切開皮膚及皮下組織后，使用手鋸或者側(cè)刀切斷骨組織造成骨折，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要固定或者不固定骨折處［9］。閉合性模型大部分使用固定裝置固定造模側(cè)肢體，然后利用重物撞擊患肢，使得患肢形成骨折，而不破壞皮膚［10］。實(shí)驗(yàn)主要觀察骨痂處軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)及組織因子表達(dá)程度，閉合性骨折模型由于動(dòng)物的體位、肢體固定的角度造成重物下墜時(shí)難以控制骨折后形成面積，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成較大誤差，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了鋸開法制造大鼠脛骨干動(dòng)物模型。

南燭根是杜鵑花科植物烏飯樹的根，主要分布于貴州、湖南、江西等地，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)，其主要治療功效為散瘀消腫、強(qiáng)筋止痛。南方民眾早有將南燭葉的浸汁做成烏米飯食用，但南燭根用藥的報(bào)道較少。水族民間常用南燭根熬成藥汁用于治療骨折，療效明顯。研究顯示，南燭根浸出物中富含分槲皮素、山柰酚、芹菜素和木犀草素等活性成分［11］。多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，槲皮素可通過多條信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs的增殖和成骨細(xì)胞分化，達(dá)到抗骨質(zhì)疏松癥和促進(jìn)骨折愈合的作用［12-14］。本研究結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比和大鼠骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)顯著增高；鏡下病理結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組和南燭根水提液高劑量組軟骨細(xì)胞更加成熟，骨小梁粗大、密集，骨小梁間隔可見豐富的血管。由此說明，南燭根水提液可以通過提高VEGF、VEGFR-2的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生，增加新生血管的數(shù)量，從而加速骨折端的愈合。實(shí)驗(yàn)中，南燭根水提液低劑量組和中劑量組與模型對(duì)照組在血管面積、骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)等方面未見明顯差異，說明當(dāng)南燭根水提液達(dá)到400 mg/kg可明顯促進(jìn)骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)，從而起到治療作用。

綜上所述，水族民間常用南燭根治療骨折，但由于基礎(chǔ)研究和臨床報(bào)道較少，因此未被廣泛應(yīng)用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，南燭根水提液可明顯促進(jìn)骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞分裂，促進(jìn)血管新生，從而達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的作用。本實(shí)驗(yàn)僅揭示了南燭根通過提高VEGF、VEGFR-2表達(dá)的作用，南燭根的其他作用途徑仍需下一部實(shí)驗(yàn)證實(shí)。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-03-02編輯：劉斌）