沙才華，廖秀云，陳 軒，周傲白雪，蔣曉霞，徐博文，黃海超，趙福振，邵建宏

（拱北海關(guān)技術(shù)中心，國(guó)家外來(lái)病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家口蹄疫豬瘟檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，珠海，519001）

高鼻羚羊（Saiga tatarica）是與劍齒虎（Saber toothed tiger）同期的有蹄類(lèi)食草動(dòng)物［1］，被視為具有重要生物學(xué)研究?jī)r(jià)值的活化石。高鼻羚羊的角俗稱(chēng)羚羊角，在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被視為珍稀藥材。歷史上，高鼻羚羊廣泛分布于歐亞大草原，東北至蒙古，東南至中國(guó)新疆，橫跨西北部的喀爾巴阡山脈和西南部的高加索山脈，在更為久遠(yuǎn)的更新世，高鼻羚羊也曾出沒(méi)于白令區(qū)域和歐洲的不列顛群島［2］。目前，高鼻羚羊在中國(guó)境內(nèi)已滅絕，整合分類(lèi)學(xué)資訊系統(tǒng)（ITIS）公布的資料顯示［3］，高鼻羚羊分布于南亞、北亞和歐洲，又被稱(chēng)為草原高鼻羚羊（steppe saiga），“steppe”一詞特指西伯利亞一帶沒(méi)有樹(shù)木的大草原。另有資料顯示，高鼻羚羊現(xiàn)分布于俄羅斯、哈薩克斯坦、土庫(kù)曼斯坦和烏茲別克斯坦［4］。由于分布范圍小、數(shù)量少和人工馴養(yǎng)難度大，高鼻羚羊被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）列為瀕危物種紅色名錄極危（CR）物種［5］，被保護(hù)野生動(dòng)物遷徙物種公約（CMS）和瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約（CITES）列入附錄Ⅱ，是國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物。

調(diào)查顯示，高鼻羚羊的分布地區(qū)普遍存在盜獵行為，20世紀(jì)80年代從前蘇聯(lián)出口至中國(guó)、日本等地的高鼻羚羊角實(shí)際值為官方統(tǒng)計(jì)值的5～7倍，1994年從俄羅斯、哈薩克斯坦等地非法走私至東亞的高鼻羚羊角達(dá)44 t［6］。2005—2010年，分布有高鼻羚羊的土庫(kù)曼斯坦、烏茲別克斯坦、哈薩克斯坦、俄羅斯聯(lián)邦和蒙古5個(gè)國(guó)家相繼簽署CMS［7］，全面取消高鼻羚羊及其制品的國(guó)際貿(mào)易。然而，非法走私高鼻羚羊角的行為仍屢禁不止，單次最高走私量超過(guò)1 000 根［8-9］。此外，由于供需關(guān)系長(zhǎng)期嚴(yán)重不均衡，高鼻羚羊角的黑市價(jià)格已高達(dá)人民幣8 萬(wàn)元/根［10-11］。因此，研究高鼻羚羊角的鑒定方法對(duì)保護(hù)瀕危野生動(dòng)物，打擊違法犯罪和統(tǒng)一執(zhí)法口徑具有重要意義。

目前針對(duì)高鼻羚羊角鑒定方法的研究主要包括形態(tài)觀(guān)察、切片觀(guān)察等直接判斷法，光譜、色譜等理化分析法，以及各類(lèi)分子生物學(xué)法，由于技術(shù)原理和技術(shù)手段的區(qū)別，上述鑒定方法均有自身的適用性和局限性，基于同類(lèi)技術(shù)建立的不同鑒定方法在鑒定結(jié)果上也可能存在偏差。分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)微量、痕量樣品的鑒定具有顯著優(yōu)勢(shì)。自常規(guī)PCR 技術(shù)面世以來(lái)，基于分子生物學(xué)理念開(kāi)發(fā)的各類(lèi)檢測(cè)、鑒定方法一直在物種鑒定領(lǐng)域中占據(jù)主導(dǎo)地位，因此，本研究基于桑格測(cè)序法建立一套鑒定高鼻羚羊及其制品的分子生物學(xué)檢測(cè)方法并驗(yàn)證其可行性，以作為現(xiàn)有技術(shù)的進(jìn)一步補(bǔ)充。

1 試驗(yàn)材料

1.1 高鼻羚羊樣品

拱北海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室存留的高鼻羚羊完整角2份，編號(hào)1和2；市場(chǎng)采購(gòu)的商品化高鼻羚羊角粉3 份，廠(chǎng)商分別為北京同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司、成都岷江源藥業(yè)有限公司和內(nèi)蒙古普康藥業(yè)有限公司，對(duì)應(yīng)編號(hào)3、4和5。

1.2 對(duì)照樣品

拱北海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室存留的動(dòng)物組織和動(dòng)物制品，包括野牦牛（Bos mutus）肉、水牛（Bubalus bubalis）完整角、家牛（Bos taurus）完整角、梅花鹿（Cervus nippon）完整角、馴鹿（Rangifer tarandus）角切片、馬鹿（Cervus elaphus）角切片、山羊（Capra hircus）完整角、綿羊（Ovis aries）完整角和白犀牛（Ceratotherium simum）角磨粉，各1 份，編號(hào)6～14。樣品1、2和6～14均于較早前使用本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的分子生物學(xué)鑒定方法（經(jīng)CNAS 認(rèn)證）確認(rèn)為所述物種。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品DNA提取

用蘸有95%乙醇的棉球均勻擦拭角制樣品和肉制樣品的表面數(shù)次，以清除附著在樣品表面可能影響檢測(cè)結(jié)果的異物，干燥后使用碎瓷片或手電鉆（無(wú)菌鉆頭）刮/鉆取適量角實(shí)質(zhì)或使用無(wú)菌剪刀剪取適量肉組織制備待檢樣品。粉末狀制品直接拆封稱(chēng)取適量粉末制備待檢樣品。上述待檢樣品均嚴(yán)格按照OMEGA 核酸提取試劑盒（OMEGA E.Z.N.A.?Tissue DNA Kit D3396-02）說(shuō)明書(shū)提取DNA，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR引物合成

由上海輝睿生物科技有限公司合成PCR 引物，大小約300 bp，引物序列：F-primer-300，5'-ACTTCTAGCATCTTCCATAGTTGAG-3'；R-primer-300，5'-GGGAAGTGAAAGGAGTAGGAGG-3'［11］。

2.3 PCR擴(kuò)增

以供試樣品提取的DNA 為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），DNA 模板2.0 μL，補(bǔ)水至總反應(yīng)體積25.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃完全延伸5 min。

2.4 電泳和測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并采用桑格測(cè)序法雙向測(cè)序（測(cè)序工作由本實(shí)驗(yàn)室完成）。

2.5 序列分析

通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的序列比對(duì)工具BLAST 進(jìn)行物種相似性比對(duì)分析，驗(yàn)證物種來(lái)源。

3 結(jié)果

3.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

樣品1～4 在約300 bp 處均呈現(xiàn)顯著擴(kuò)增條帶，樣品5在300 bp處呈現(xiàn)極微弱擴(kuò)增條帶，樣品6～14、陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未見(jiàn)擴(kuò)增條帶（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplified products

3.2 NCBI比對(duì)結(jié)果

2份高鼻羚羊角樣品（樣品1、2）和3份商品化羚羊角粉樣品（樣品3、4 和5）的測(cè)序結(jié)果（表1）經(jīng)BLAST 檢索均顯示為Saiga tatarica，且所有測(cè)序結(jié)果與Saiga tatarica參考序列（登錄號(hào)：NC_020746.1）的相似性均大于99.42%（表2）。

表1 樣品1～5的測(cè)序結(jié)果Tab.1 Sequencing results of sample 1 to sample 5

表2 樣品1～5序列的BLAST結(jié)果Tab.2 Results of BLAST for the sequences of sample 1 to sample 5

4 討論

在探索高鼻羚羊桑格測(cè)序鑒定方法的過(guò)程中，本研究曾根據(jù)NCBI 基因數(shù)據(jù)庫(kù)公布的高鼻羚羊細(xì)胞色素c 氧化酶亞型Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COI）基因序列，在高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩套特異性PCR 引物（表3），多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明兩套引物均能準(zhǔn)確分辨供試樣品是否含有高鼻羚羊成分，但PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖呈現(xiàn)部分假陽(yáng)性（圖2），而使用上述對(duì)照樣品的引物配合PCR 反應(yīng)參數(shù)得到的擴(kuò)增結(jié)果未出現(xiàn)假陽(yáng)性。綜合既往研究，發(fā)現(xiàn)較長(zhǎng)的擴(kuò)增產(chǎn)物片段有利于提高序列分析的準(zhǔn)確性，但可能不利于凝膠電泳圖的特異性呈現(xiàn)。

表3 高鼻羚羊細(xì)胞色素c氧化酶亞型Ⅰ基因擴(kuò)增引物Tab.3 Cytochrome c oxidase subunit I gene amplification primers for Saiga antelope

圖2 部分樣品的Primer-654檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Gel electropherograms of PCR amplification products of some of the samples using Primer-654

具有特征曲線(xiàn)的角是高鼻羚羊最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的組織，但多數(shù)動(dòng)物的角組織由角質(zhì)蛋白和膠原蛋白等成分組成，其線(xiàn)粒體DNA 含量遠(yuǎn)少于肉、皮和骨等其他組織，為確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究先后嘗試了全自動(dòng)核酸提取儀和人工過(guò)柱提取2 種不同的方法，發(fā)現(xiàn)后者得到的DNA 質(zhì)量略?xún)?yōu)于前者，DNA 質(zhì)量濃度均大于20 ng/μL，該濃度能夠滿(mǎn)足PCR 擴(kuò)增的基本要求，但DNA 的平均質(zhì)量濃度僅為其他常見(jiàn)組織的6%～10%。如圖1、表2 所示，本研究所有對(duì)照樣品均未見(jiàn)擴(kuò)增條帶，而所有陽(yáng)性樣品與高鼻羚羊參考序列的相似性均大于99.42%，其中，樣品5 的凝膠電泳條帶極其微弱，但其擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)得的序列仍能明確區(qū)分于林羚（Tragelaphus spekii）等其他近似物種。經(jīng)過(guò)對(duì)蔣超等［11］公開(kāi)的特異性引物進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化并增加桑格測(cè)序，本研究建立的檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增微量目標(biāo)基因。

此外，高鼻羚羊?qū)伲⊿aiga）物種的分類(lèi)在國(guó)際上仍未達(dá)成共識(shí)，查詢(xún)ITIS、NCBI、IUCN、CMS、CITES 以及國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄公布的最新物種信息，可歸納出兩個(gè)主要分歧和一個(gè)高度統(tǒng)一。分歧一是將蒙古高鼻羚羊單列為一個(gè)物種（ITIS、CMS 和CITES），亦或歸入高鼻羚羊的亞種（NCBI、IUCN）；分歧二是若蒙古高鼻羚羊單列為一個(gè)物種，是否應(yīng)將其進(jìn)一步細(xì)分為Saiga borealis borealis和S.b.mongolica2 個(gè)亞種。統(tǒng)一之處為除國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄外，其他機(jī)構(gòu)/名錄都從種或亞種的層面將高鼻羚羊與蒙古高鼻羚羊進(jìn)行區(qū)分（表4）。然而，本研究測(cè)得的所有目標(biāo)序列在NCBI 基因數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果僅匹配至種，未顯示具體亞種。為嘗試區(qū)分，本研究通過(guò)NCBI 進(jìn)一步查詢(xún)S.tatarica、S.t.tatarica和S.t.mongolica的相關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)NCBI 收錄上述3 個(gè)物種/亞種的線(xiàn)粒體基因序列數(shù)分別為291、76、26 條，前者有長(zhǎng)度大于16 000 bp的線(xiàn)粒體全基因序列，而后兩者序列的最長(zhǎng)長(zhǎng)度均小于1 220 bp，且后兩者均未登錄線(xiàn)粒體的COI基因序列，也未查詢(xún)到S.borealis的相關(guān)序列。因而，根據(jù)現(xiàn)有、可及的種和亞種序列，本研究無(wú)法進(jìn)一步判斷上述方法是否能夠準(zhǔn)確區(qū)分S.tatarica tatarica和S.t.mongolica，或S.tatarica和S.borealis。換言之，現(xiàn)階段的材料無(wú)法證明本研究建立的方法能夠在分子層面區(qū)分高鼻羚羊和蒙古高鼻羚羊。再者，本研究納入的平行樣品和對(duì)照樣品數(shù)量和種類(lèi)偏少，也未能基于明確、可信的證據(jù)分別獲得高鼻羚羊和蒙古高鼻羚羊的樣品，上述均有待后續(xù)加以拓展和驗(yàn)證。

表4 高鼻羚羊?qū)傥锓N分類(lèi)Tab.4 Species classification of Saiga