彭茜翎，王如意，喬美萍，周 磊，王洪永，蔣本模，吳 杰，楊 杰，其美拉姆，顏其貴

（1.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都，611130；2.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都，611130；3.青川九藥麝業(yè)開發(fā)有限公司，廣元，628100；4.四川養(yǎng)麝研究所，都江堰，611845；5.鳳縣逢春濟民可信科技養(yǎng)殖有限公司，寶雞，721000；6.上察隅鎮(zhèn)農牧綜合服務中心，林芝，860614）

林麝（Moschus berezovskii）是國家一級重點保護野生動物，也是名貴中藥材麝香的基源動物［1］。王永奇等［2］分析2001—2012 年陜西339 只林麝死亡病例，發(fā)現(xiàn)導致林麝死亡的主要為呼吸道、消化道和不明原因疾病。引起林麝各類疾病的病原較為復雜，目前報道有大腸埃希氏菌（Escherichia coli）［3］、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）［4］、支氣管敗血波氏桿 菌（Bordetella bronchiseptica）［5］和黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）［6］等。弗格森埃希菌（Escherichia fergusonii）于1885 年 被Theodor Escherich 首次發(fā)現(xiàn)，與大腸埃希氏菌同屬于埃希氏菌屬（Escherichia）成員［7］。弗格森埃希菌不僅能引起人類疾病，在動物體內也能引發(fā)一系列感染，主要從傷口感染、尿路 感染、菌血癥、腹瀉、胰腺癌、眼內炎和胸膜炎等癥狀的患者和動物體內分離得到［8-11］。Farmer等［12］于1985 年首次報道從豬、馬及火雞體內分離得到弗格森埃希菌；隨后從患肺炎的牛［13］、腹瀉馴鹿（Rangifer tarandus tarandus）［14］和腹瀉馬［15］的體內均分離出弗格森埃希菌。作為人獸共患病病原微生物，弗格森埃希菌也許會對動物食品安全存在潛在的威脅。

與大腸埃希氏菌感染的治療方式類似，弗格森埃希菌的治療方式是以抗生素藥物治療為主，但隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，治療效果有所下降。弗格森埃希菌的多重耐藥性和產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）菌株的出現(xiàn)均有報道［16-21］。Tang等［22］于2019年從中國3個省份1 400 份動物樣本（豬、雞和鴨）中分離得到133 株弗格森埃希菌，并檢測其耐藥基因，發(fā)現(xiàn)弗格森埃希菌已在我國動物中廣泛流行且具有較高的耐藥性。

目前在野生動物中分離出弗格森埃希菌的相關報道較少。本試驗從死亡林麝體內分離得到1 株弗格森埃希菌，對其培養(yǎng)特性和生化特性進行研究，分析16S rDNA 基因序列及耐藥性，為深入研究弗格森埃希菌的生物學特性、致病性及預防治療弗格森埃希菌引起的相關疾病提供科學有效的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

2020 年，在四川省廣元市青川縣某林麝養(yǎng)殖場內對1只死亡林麝的脾、腎和腹腔積液進行采樣。

1.2 引物合成

16S rDNA 通用引物及耐藥基因bla-OXA1/4/30［23］、bla-CTX-M［24］、bla-AAK和bla-SHV共5 對引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。序列信息如表1所示。

表1 引物信息Tab.1 Primers sequence

1.3 細菌分離純化

無菌采集養(yǎng)殖場內死亡林麝的脾、腎和腹腔積液做致病性細菌分離。使用無菌接種環(huán)從病料上采集樣本，連續(xù)劃線接種于含5%胎牛血清的TSA培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司），37 ℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取單菌落，并將單菌落接種于固體培養(yǎng)基上進一步純化，再用無菌接種環(huán)挑取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 分離菌株16S rDNA擴增與序列分析

用細菌基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取分離菌株的DNA，以分離菌株DNA 為模板，PCR 擴增16S rDNA。反應體系20 μL：2×T5 Super PCR Mix（Colony）（北京擎科生物科技有限公司）10 μL，上、下游引物（表1）各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補足反應體系。PCR 反應程序：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸25 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。擴增后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。在GenBank 上篩選4 株相關細菌的16S rDNA 序列，將測序結果與其進行同源性分析，利用DNA Star 構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.5 分離菌株的生化鑒定

細菌生化鑒定步驟按照青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司的細菌生化微量鑒定管操作說明書進行。鑒定項目為葡萄糖、山梨醇、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、尿素、枸櫞酸鹽、硫化氫、賴氨酸脫羧酶、纖維二糖、丙二酸鹽、甲基紅、靛基質和鳥氨酸脫羧酶。

1.6 藥敏試驗及耐藥基因檢測

采用藥敏紙片擴散法對分離菌株進行藥敏試驗。藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，測定藥物包括阿米卡星、呋喃唑酮、氨芐西林、頭孢噻肟、多西環(huán)素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻吩、卡那霉素、頭孢他啶、四環(huán)素、復方新諾明、氯霉素、青霉素和鏈霉素。

將菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。用0.5麥氏比濁管與菌液對比，將濃度調至1.5×108cfu/mL。在無菌條件下，將100 μL菌液均勻涂布于MH 培養(yǎng)基后，將藥敏紙片貼在涂布有菌液的MH 培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)18～20 h。參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）的標準，根據(jù)各抑菌環(huán)的直徑判定。

參照GenBank 中耐藥基因的序列及文獻，合成4 對引物［23-24］，隨后以提取的細菌DNA 為模板，擴增β-內酰胺類耐藥基因。反應體系20 μL：2×TaqPCR Master 10 μL，上、下游引物（表1）各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補足反應體系。PCR 反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，退火溫度根據(jù)上、下游引物計算，退火30 s，72 ℃延伸8 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。擴增后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2 結果

2.1 弗格森埃希菌的分離和同源性

接種死亡林麝脾、腎和腹腔積液的TSA 在37 ℃培養(yǎng)24 h 后生長出灰白色、濕潤的光滑型（S）菌落（圖1A），通過革蘭氏染色鏡檢鑒定為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢（圖1B）。

圖1 培養(yǎng)后的分離菌株菌落（A）和菌株形態(tài)（B；革蘭氏染色，10×100）Fig.1 Colony（A）and strain morphology（B；Gram staining，10×100）of isolated strains after culture

以菌株DNA 為模板，用引物（表1）擴增分離菌株的16S rDNA 基因，擴增產(chǎn)物在1 400 bp 存在目的條帶（圖2）。

測序后經(jīng)BLAST 比對分析，顯示分離菌株的16S rDNA 序列與GenBank 上弗格森埃希菌T3-3（登錄號MT416423.1）的16S rDNA 序列同源性最高，將其命名為CD20200904。同時構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果顯示分離菌株CD20200904 與弗格森埃希菌T3-3 菌株親緣關系最近（圖3），初步確定該分離菌株為弗格森埃希菌。

2.2 弗格森埃希菌的生化鑒定

通過比較，發(fā)現(xiàn)試驗分離菌株的生化特性與文獻［25］中弗格森埃希菌的生化特性高度一致，進一步確定該分離菌株為弗格森埃希菌（表2）。

表2 分離菌株的生化反應特性Tab.2 The results of biochemical reactions of strain

2.3 藥敏試驗及耐藥基因檢測

分離菌株對頭孢噻肟、頭孢噻吩及青霉素具有耐藥性，對阿米卡星、慶大霉素和鏈霉素等氨基糖苷類抗生素，對呋喃唑酮、環(huán)丙沙星、卡那霉素和頭孢他啶等藥物敏感（表3）。對分離菌株進行4 種耐藥基因檢測，可檢測到bla-OXA1/4/30、bla-CTX-M和bla-SHV三種耐藥基因（圖4）。

圖4 分離菌株的耐藥基因檢測結果Fig.4 Antibiotic resistance genes amplification results of the isolate

表3 分離菌株的藥敏試驗結果Tab.3 The results of drug sensitivity test

3 討論

作為人獸共患病病原微生物，弗格森埃希菌感染人和動物的病例在世界各地均有報道，由于抗生素藥物的廣泛使用，弗格森埃希菌的耐藥性水平也日漸升高。因此，對弗格森埃希菌耐藥基因進行檢測，研究耐藥表型的變化能夠為該菌的治療和防控提供參考。2010年Lagacé-Wiens等［19］首次分離得到表達ESBLs 的弗格森埃希菌菌株。2016 年Simmons等［26］從雞泄殖腔和盲腸樣本中收集到245 株弗格森埃希菌分離株，經(jīng)藥敏試驗和耐藥基因檢測后發(fā)現(xiàn)最常見的耐藥抗生素是氨芐西林、鏈霉素和四環(huán)素，而攜帶基因blaCMY2、blaCEM、blaACT、blaSHV和blaCTX-M-15的檢出率分別為94.5%、24.4%、6.3%、4.7%和3.2%。Rayamajhi 等［21］發(fā)現(xiàn)2008—2009 年部分分離菌株攜帶CTX-M-15 質粒復制子，耐藥基因的傳播是導致許多耐藥菌株不斷出現(xiàn)的原因之一［27-28］，而弗格森埃希菌可能與大腸埃希菌相似，在耐藥基因的傳播鏈中發(fā)揮著重要作用。

目前，弗格森埃希菌在我國食用動物中的流行情況、流行特征及耐藥性已有研究報道［22］，但在野生動物上的報道較為少見。2005年，Herráez等［29］從成年鴕鳥（Struthio camelus）腸道中分離出弗格森埃希菌；2015 年，葉泥等［30］從野生扭角羚（Budorcas taxicolor）肝臟中分離出1 株弗格森埃希菌，僅對氨芐西林有強耐藥性；2021 年，Gracy 等［31］從黑髯墓蝠（Taphozous melanopogon）腸道中分離得到1 株能夠降解甲殼素的弗格森埃希菌。本試驗首次從死亡林麝體內分離純化出1 株林麝源弗格森埃希菌，并選用15 種抗菌藥物進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)分離菌株對頭孢噻肟、頭孢噻吩及青霉素具有耐藥性，對氨基糖苷類藥物、喹諾酮類敏感，對氨基青霉素類中介。由于青霉素、頭孢噻肟及頭孢噻吩同屬于β-內酰胺類抗生素，隨后對分離菌株進行ESBLs 的檢測。ESBLs 種類較多，主要包括Temoneira（TEM）、Sulfhydryl variable（SHV）、Cefotaxime（CTX-M）和 Oxacillinase（OXA）等，并且以上述4 種β-內酰胺酶最為常見。SHV因對頭孢噻吩中巰基的水解作用而得名［32］，攜帶SHV型耐藥基因的菌株對第三代頭孢菌素呈現(xiàn)多重耐藥性，例如頭孢他啶、頭孢噻吩，大多數(shù)腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細菌、綠膿桿菌和鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）等常攜帶SHV耐藥基因［33-34］。CTX-M存在于不同的腸桿菌科細菌中，最常見的宿主菌是大腸埃希菌，其次是肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）及沙門氏菌（Salmonella）［35］，而攜帶CTX-M型耐藥基因的菌株能夠水解頭孢噻吩和頭孢噻肟［36］。OXA主要存在于綠膿桿菌中［37］，其中OXA-1型耐藥基因能夠降低對頭孢匹羅和頭孢吡肟的敏感性［38］。耐藥基因檢測結果顯示，分離菌株攜帶bla-OXA1/4/30、bla-CTX-M和bla-SHV三種耐藥基因，與該分離菌株對青霉素、頭孢噻吩和頭孢噻肟的耐藥性密切相關。

根據(jù)測序結果發(fā)現(xiàn)，分離菌株攜帶的bla-OXA1/4/30、bla-CTX-M和bla-SHV三種耐藥基因分別由綠膿桿菌、大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的基因組所編碼，表明耐藥基因在不同菌株間轉移的現(xiàn)象十分普遍。

4 結論

本試驗從死亡林麝的臟器樣本中分離得到1 株弗格森埃希菌CD20200904，該菌株經(jīng)細菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、生化鑒定和16S rDNA 基因測序及分析等試驗鑒定，表明其為弗格森埃希菌，該菌對頭孢噻肟、頭孢噻吩及青霉素具有耐藥性，并且攜帶bla-OXA1/4/30、bla-CTX-M和bla-SHV三種耐藥基因。