王 瑛，張 沖，蔡一村，王鑫杰，林穎崢，馮之航，潘良文

（1.上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所，上海，201210；2.昆明海關(guān)技術(shù)中心，昆明，650100；3.上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海，200135；4.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)基因數(shù)據(jù)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院（深圳）農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳，518120）

犀牛隸屬于哺乳綱（Mammalia）奇蹄目（Perissodactyla）犀科（Rhinocerotidae），包括白犀（Ceratotherium simum）、黑犀（Diceros bicornis）、印度犀（Rhinoceros unicornis）、爪哇犀（Rh.sondaicus）和蘇門答臘犀（Dicerorhinus sumatrensis），目前均被列入CITES 附錄Ⅰ，白犀指名亞種（Ceratotherium simum simum）（僅南非和斯威士蘭種群）被列入附錄Ⅱ。犀牛種群目前面臨的主要威脅是人類的開發(fā)活動(dòng)導(dǎo)致其棲息地減少和碎片化，同時(shí)因其角制品在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)［1-3］和工藝品［4-5］市場(chǎng)上具有重要價(jià)值，假冒［6］、盜獵和走私行為［7］屢禁不止。為保護(hù)犀牛，提高打擊非法活動(dòng)的有效性，開發(fā)一種能夠快速檢測(cè)犀牛DNA 的技術(shù)非常必要。目前，基于遺傳信息的物種鑒定技術(shù)［8］一般需要在有較高環(huán)境和儀器條件的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，而新興的酶促重組等溫?cái)U(kuò)增（enzymatic recombinase amplification，ERA）［9］和基于CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)［10-13］提供了一種全新的檢測(cè)策略，甚至可以在野外條件下完成特異性物種檢測(cè)鑒定?；谶@一策略，本研究建立了一種基于ERA-CRISPR/Cas12a-LFD［14-16］的犀牛特異性核酸快速鑒定技術(shù)，能夠快速準(zhǔn)確地鑒定犀牛DNA。該技術(shù)基于3 個(gè)嚴(yán)格相互制約的特異性限制，包括ERA的引物特異性、crRNA特異性識(shí)別靶基因序列及外源DNA 上的特殊PAM 位點(diǎn)與crRNA 匹配［17-18］機(jī)制。這種“三位一體”的特異性要求增加了物種特異性識(shí)別限制，從而提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

使用包括從本地超市或電商平臺(tái)購(gòu)買的肉類樣本及保存在上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室的野生動(dòng)物核酸樣本，均經(jīng)過一代測(cè)序鑒定確認(rèn)物種信息（表1）。核酸提取試劑使用美國(guó)OMEGA公司的Mag-Bind?Viral DNA/RNA 96 Kit，核酸純化使用普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司的Wizard?Genomic DNA Purification Kit，普通PCR 采用寶生物工程（大連）有限公司的PremixTaq?（ExTaq? Version 2.0），核酸定量使用美國(guó)通用醫(yī)療公司的GE NanoVue Plus 超微量分光光度計(jì)和賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司的Qubit dsDNA BR Assay Kit 核酸定量試劑盒，測(cè)序選擇Illumina MiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)和相關(guān)試劑［19］。人工合成了白犀（Y07726.1）、蘇門答臘犀（FJ905816.1）、黑犀（FJ905814.1）、爪哇犀（FJ905815）［20］和印度犀（X97336.1）［21］的靶基因片段，并克隆至pUC57 載體。為了使用數(shù)字PCR 精確定量質(zhì)粒的絕對(duì)拷貝數(shù)，在人工合成時(shí)加入標(biāo)簽序列。

表1 特異性動(dòng)物物種核酸樣本Tab.1 Species-specific animal nucleic acid samples

1.2 試劑與儀器

核酸釋放劑（NR201）、ERA 基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增試劑盒（KS101）、側(cè)向流試紙條（CRISPR，TS104）均購(gòu)自蘇州先達(dá)基因科技有限公司；EnGen?Lba Cas12a（Cpf1）購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司。

快速等溫?cái)U(kuò)增儀Genie Ⅲ，英國(guó)OptiGene 公司；VeritiTM96 梯 度PCR 儀，美 國(guó)Applied Biosystems 公司；NanoVue Plus 超微量分光光度計(jì)，英國(guó)GE 公司；Invitrogen Qubit?2.0 熒光定量?jī)x，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Life ViiATM7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems 公司；Illumina MiSeq 高通量測(cè)序儀，美國(guó)Illumina公司。

1.3 ERA引物和crRNA設(shè)計(jì)

選擇犀牛12S 核糖體RNA 基因（12S ribosomal RNA，GenBank：MF066643.1）作為ERA 擴(kuò)增靶基因［22］。首先，通過序列比對(duì)確定了一個(gè)283 bp（654～937 bp）的特定區(qū)域，并在該區(qū)域內(nèi)尋找候選PAM 位點(diǎn)（TTTV，V=G or C or A），利用在線設(shè)計(jì)軟件Cas-Designer（http：//rgenome.net/cas-designer/）［23-24］設(shè) 計(jì)與PAM 位點(diǎn)匹配的crRNA。根據(jù)ERA 引物設(shè)計(jì)原則，使用Applied Biosystems 公司的Primer Express v3.0 在PAM 位點(diǎn)和crRNA 的上下游區(qū)域設(shè)計(jì)犀牛特異性ERA 引物。引物和crRNA 均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表2。

表2 ERA引物和crRNA序列Tab.2 ERA primers and crRNA sequences

1.4 ERA-CRISPR/Cas12a-LFD

采用基于ERA 技術(shù)的核酸擴(kuò)增試劑盒（蘇州先達(dá)基因科技有限公司）擴(kuò)增靶基因片段。ERA 反應(yīng)在50.0 μL的體系中進(jìn)行，包括20.0 μL溶解劑，正、反向引物（10 μmol/L）各2.5 μL，2.0 μL DNA 模板，并用ddH2O補(bǔ)足48.0 μL混勻后，在反應(yīng)管蓋上加入2.0 μL激活劑（同步激活反應(yīng)），小心關(guān)閉管蓋，離心使激活劑進(jìn)入預(yù)混液中，快速將反應(yīng)管置于等溫?cái)U(kuò)增儀中或腋下，孵育5 min。取2.0 μL ERA 擴(kuò)增產(chǎn)物加入到CRISPR/Cas12a-LFD 檢測(cè)反應(yīng)體系。各組分含量：250.0 nmol/L Cpf1 1.0 μL，25.0 pmol/L ss-DNA（FAM-Biotin）探針1.0 μL，1.0 μmol/L crRNA 1.0 μL 和2.0 μL NEBufer 3.1（100 mmol/L NaCl，50.0 mmol/L Tris-HCl，10.0 mmol/L MgCl2，100.0 μg/mL BSA，pH7.5），總反應(yīng)體系20.0 μL。在等溫?cái)U(kuò)增儀（40 ℃）或腋下孵育15 min 后，在20.0 μL 的反應(yīng)產(chǎn)物中加入80.0 μL 雜交檢測(cè)分析緩沖液（先達(dá)）。在室溫條件下，將側(cè)向流試紙條直立插入反應(yīng)液。當(dāng)對(duì)照條帶（C 條帶，試紙條頂端）完全顯色后，測(cè)試帶（T 條帶，試紙條底端）上的信號(hào)可以用肉眼觀察并記錄。

1.5 特異性檢測(cè)

為評(píng)估檢測(cè)方法的特異性，使用ERA-CRISPR/Cas12a-LFD對(duì)上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室物種樣本庫(kù)中保存的18 種不同動(dòng)物的特異性核酸（表1）進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)1種犀牛組織中提取的核酸（印度犀）和4種人工合成的含有犀牛靶基因序列的質(zhì)粒DNA進(jìn)行5種犀牛通用性檢測(cè)，以確保5種犀牛均可以檢出。核酸樣本濃度大于20.0 ng/μL，質(zhì)粒樣本大于1×106拷貝/孔。每組試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，以最終確認(rèn)結(jié)果。

1.6 最低檢測(cè)下限（LOD95%）測(cè)定

在本研究中，最低檢測(cè)下限（LOD95%）定義為超過95%的重復(fù)檢測(cè)樣本產(chǎn)生陽性結(jié)果的最低DNA拷貝數(shù)。以5 個(gè)人工合成的含有犀牛靶基因的核酸樣本為檢測(cè)模板，用QX200 微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）進(jìn)行定量檢測(cè)。反應(yīng)體系：上、下游引物各1.8 μL（終濃度為900 nmol/L），0.5 μL 探針（終濃度為250 nmol/L），10.0 μL ddPCR Master Mix（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），4.0 μL 模板DNA（人工合成犀牛靶基因）和1.9 μL 雙蒸水（Thermo Scientific，Salt Lake City，UT，USA）。使用QX200 ddPCR 液滴發(fā)生器（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）將反應(yīng)混合物分成大約2×104個(gè)獨(dú)立液滴。常規(guī)PCR 在伯樂T100?熱循環(huán)儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）中進(jìn)行：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，98 ℃延伸10 min，40個(gè)循環(huán)。最后使用微滴分析儀對(duì)陽性液滴進(jìn)行分析和計(jì)算，通過泊松分布分析確定樣本DNA 的絕對(duì)拷貝數(shù)［25］。精確定量的核酸樣本進(jìn)行稀釋，從每個(gè)反應(yīng)1×104個(gè)拷貝數(shù)開始進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，最低拷貝數(shù)約為每個(gè)反應(yīng)1拷貝。使用5個(gè)濃度梯度，每個(gè)稀釋梯度做1 個(gè)反應(yīng)，分別進(jìn)行3 次獨(dú)立的ERACRISPR/Cas12a-LFD 檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。完成后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 環(huán)境條件變化的穩(wěn)定性驗(yàn)證

與在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的檢測(cè)方法穩(wěn)定的應(yīng)用環(huán)境不同的是，本檢測(cè)方法的應(yīng)用場(chǎng)景可能更為復(fù)雜且影響因素也可能更多。需要考慮幾個(gè)常見的影響因素，包括擴(kuò)增設(shè)備、試劑用量（包括引物和擴(kuò)增試劑），以及擴(kuò)增條件（包括溫度和時(shí)間）。為了確定這些因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的不確定性變化或疊加影響，在標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)體系中進(jìn)行如下改變：將引物添加量由標(biāo)準(zhǔn)的2.50 μL增加到2.75 μL或減少到2.25 μL；將溶解劑由20.0 μL增加到25.0 μL或減少到15.0 μL；將等溫?cái)U(kuò)增溫度由40 ℃增加到42 ℃或減少到38 ℃；在標(biāo)準(zhǔn)的5 min 擴(kuò)增時(shí)間基礎(chǔ)上，將擴(kuò)增時(shí)間增加或減少1 min?？紤]到實(shí)驗(yàn)在野外環(huán)境中應(yīng)用時(shí)無法使用電加熱設(shè)備，設(shè)計(jì)并測(cè)試了人體腋下溫度疊加試劑添加量變化和擴(kuò)增時(shí)間的變化對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響程度。腋下溫度使用水銀體溫計(jì)連續(xù)測(cè)量3 次記平均值（每次腋下放置3 min 穩(wěn)定后讀數(shù)）。

1.8 現(xiàn)場(chǎng)條件應(yīng)用性測(cè)試

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和野外現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)場(chǎng)景存在許多差異，因此應(yīng)用該檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際樣本進(jìn)行全流程應(yīng)用測(cè)試，以評(píng)估其現(xiàn)場(chǎng)適用性。檢測(cè)使用的核酸樣本均源于海關(guān)口岸截獲的可疑動(dòng)物角粉、血液、毛皮和藥品等。為了制備適用于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的DNA，利用商業(yè)化試劑盒，從犀牛角粉等樣品中提取DNA，即將20 mg 犀牛角粉或其他固體樣品（約芝麻粒大?。┘尤?00 μL 的DNA 釋放劑NR201（蘇州先達(dá)基因科技有限公司），混勻后在95 ℃水浴中震蕩浸泡5 min。如果樣本為液體（如組織液、血液等），則需取15 μL 加入1.5 mL 的離心管中，再加入150 μL 的核酸釋放劑，振蕩混勻，95 ℃水浴3 min，產(chǎn)物直接用于后續(xù)的ERA-CRISPR/Cas12a-LFD 檢測(cè)。在4 個(gè)不同地點(diǎn)讓4 位檢測(cè)人員進(jìn)行實(shí)際操作，以盡可能模擬真實(shí)應(yīng)用場(chǎng)景。實(shí)驗(yàn)操作人員均未接受過系統(tǒng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)操作地點(diǎn)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室外，并未刻意提前清潔操作環(huán)境。此外，對(duì)盲樣、操作說明和試劑耗材進(jìn)行打包分發(fā)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，操作人員使用智能手機(jī)拍照并獨(dú)立填寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，及時(shí)反饋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)和再現(xiàn)性

由至少3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的結(jié)果取均值，使用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 犀牛特異性ERA引物和crRNA設(shè)計(jì)驗(yàn)證

使用在線生物信息學(xué)分析軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)5 種現(xiàn)生犀牛和其他哺乳動(dòng)物的核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，選擇以犀牛線粒體12S核糖體RNA 基因作為檢測(cè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)犀牛特異性ERA引物和crRNA（圖1）。

圖1 犀牛特異性ERA引物和crRNAFig.1 Rhinoceros-specific ERA primers and crRNA

由于CRISPR/Cas12a 檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)弱依賴于crRNA 引導(dǎo)的靶向切割效率，這可能會(huì)受到crRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和匹配序列的影響［26］。序列比對(duì)分析顯示，ERA 引物和crRNA 的靶向區(qū)域在5 種犀牛中高度保守（表3），存在少量突變位點(diǎn)（表3 中紅色字體）。

表3 犀牛特異性ERA引物和crRNA突變位點(diǎn)Tab.3 Rhinoceros-specific ERA primers and crRNA mutant loci

2.2 特異性檢測(cè)

特異性驗(yàn)證使用5 種現(xiàn)生犀牛特有的核酸樣本和其他13 種哺乳動(dòng)物核酸樣本（表1）進(jìn)行ERACRISPR/Cas12a-LFD 檢測(cè)。結(jié)果顯示，本研究設(shè)計(jì)使用的犀牛特異性檢測(cè)方法針對(duì)5 種現(xiàn)生犀牛核酸樣本均出現(xiàn)了檢測(cè)帶而沒有出現(xiàn)控制帶或控制帶顯示微弱的情況；其他13 種哺乳動(dòng)物核酸樣品均沒有出現(xiàn)檢測(cè)帶而只出現(xiàn)了控制帶（圖2）。在每次測(cè)試中，樣品都加入基本相同量的模板DNA，每個(gè)反應(yīng)孔中加入大約1 000個(gè)拷貝的DNA，所有特異性和非特異性樣品都產(chǎn)生了預(yù)期的條帶信號(hào)。結(jié)果說明本研究所設(shè)計(jì)、優(yōu)化和建立的特異性ERA-CRISPR/Cas12a-LFD 檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確識(shí)別5 種現(xiàn)生犀牛成分。

圖2 ERA-CRISPR/Cas12q-LFD特異性檢測(cè)Fig.2 ERA-CRISPR/Cas12q-LFD specificity assay

2.3 最低檢測(cè)下限（LOD95%）測(cè)定

利用數(shù)字PCR技術(shù)和預(yù)先添加的標(biāo)簽基因?qū)θ斯ず铣傻? 種犀牛質(zhì)粒進(jìn)行核酸拷貝數(shù)的絕對(duì)定量檢測(cè)。經(jīng)過換算和稀釋，絕對(duì)拷貝數(shù)從1.00×104拷貝/孔到1 拷貝/孔，共5 個(gè)濃度。采用該檢測(cè)方法對(duì)這5個(gè)濃度核酸樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3），在10拷貝/孔的濃度水平，除了蘇門答臘犀和印度犀檢出陽性條帶，其他3 種犀牛核酸在這一濃度水平上均無法穩(wěn)定檢出。在100 拷貝/孔的濃度水平，5 種犀牛核酸都可以穩(wěn)定檢出陽性條帶。這些結(jié)果說明，該檢測(cè)方法在100拷貝/孔濃度水平可以做到全部陽性樣本的穩(wěn)定檢出。因此，該檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限（LOD95%）是10拷貝/孔。

圖3 最低檢測(cè)下限檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Lowest detection limit test results

2.4 穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

將引物和擴(kuò)增試劑的添加量在標(biāo)準(zhǔn)值的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)增減，并將擴(kuò)增溫度增加或減少2 ℃。8組實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果均為陽性（表4）。結(jié)果表明，即使在野外環(huán)境、實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)一定范圍內(nèi)的變化，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)體系中一些試劑添加量出現(xiàn)增減或者溫度出現(xiàn)一定變化的情況下，該檢測(cè)方法仍能夠完成犀牛特異性核酸檢測(cè)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)說明該檢測(cè)技術(shù)具有較好的穩(wěn)定性。

表4 不同影響因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Tab.4 Effect of different influencing factors on the test results

2.5 現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用性測(cè)試結(jié)果

為了進(jìn)一步縮短現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)間，使用商業(yè)化的一步法DNA 快速釋放劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的DNA 提取步驟，使該方法更適合在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，在30 min的測(cè)試期間，4 名操作人員在4個(gè)不同地點(diǎn)進(jìn)行了獨(dú)立檢測(cè)，結(jié)果一致，盲樣的檢測(cè)結(jié)果均正確。陽性信號(hào)的確認(rèn)時(shí)間集中在27～30 min（表5），沒有出現(xiàn)超時(shí)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明了犀牛特異性ERA-CRISPR/Cas12a-LFD檢測(cè)方法可以成功地應(yīng)用于野外環(huán)境中動(dòng)物樣本現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

表5 犀牛特異性ERA-CRISPR/Cas12a-LFD現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Rhinocerose-specific ERA-CRISPR/Cas12a-LFD field application test results

3 討論

本研究的目標(biāo)是為了解決野生動(dòng)物資源保護(hù)工作中野生動(dòng)物物種的現(xiàn)場(chǎng)鑒定技術(shù)問題。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，特別是常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)［8］，雖然具有高特異性和高靈敏度，但對(duì)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用存在一定的限制，需要專業(yè)技術(shù)人員、高水平的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和復(fù)雜精密的檢測(cè)儀器［27］。因此，提出了基于ERA-CRISPR/Cas12a-LFD 技術(shù)的檢測(cè)方法以實(shí)現(xiàn)對(duì)犀牛源性成分的現(xiàn)場(chǎng)鑒定。

本研究建立、優(yōu)化和驗(yàn)證的物種特異性ERACRISPR/Cas12a-LFD 檢測(cè)方法具備現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用所需的多項(xiàng)關(guān)鍵要素，突破了依賴傳統(tǒng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)限制。與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)相比，該檢測(cè)方法具有多項(xiàng)技術(shù)優(yōu)勢(shì)。最突出的是對(duì)模板DNA 數(shù)量的低要求，利用CRISPR 技術(shù)的非特異性剪切活性，只需少量的模板DNA 來觸發(fā)反應(yīng)并釋放信號(hào)完成識(shí)別。該方法對(duì)模板DNA 的低要求使得不需要精密變溫儀器的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得以順利應(yīng)用。較高的特異性也是該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，擴(kuò)增階段ERA 引物可以在反應(yīng)初始就對(duì)樣本進(jìn)行一次特異性篩選擴(kuò)增，識(shí)別階段引入的特異性crRNA 序列不但特異性識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物上特異性靶序列，還對(duì)與其匹配的PAM 位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別。這就從多個(gè)角度提供了靶基因特異性識(shí)別的多重限制，是其他檢測(cè)方法不具備的。讀取信號(hào)階段，利用LFD 技術(shù)可以在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中快速完成特異性信號(hào)的識(shí)別。這些新技術(shù)的創(chuàng)新性結(jié)合使用為現(xiàn)場(chǎng)物種鑒定提供了有力的支持，并為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了新的思路和方法。

在實(shí)際應(yīng)用中，野生動(dòng)物資源走私是海關(guān)日常工作中面臨的一個(gè)重要問題，特別是與瀕危野生動(dòng)物有關(guān)的產(chǎn)品的物種鑒定，是工作中一個(gè)較大的難點(diǎn)。海關(guān)的分子生物學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)室通常位于遠(yuǎn)離海關(guān)監(jiān)管的一線港口和查驗(yàn)點(diǎn)。采樣、送樣和檢測(cè)全流程周期較長(zhǎng)，直接影響人貨通關(guān)效率。犀牛角及其制品的走私是其中一個(gè)具有典型代表的問題。針對(duì)這一問題，快速、準(zhǔn)確、靈敏的物種識(shí)別技術(shù)至關(guān)重要。本研究建立的犀牛特異性ERA-CRISPR/Cas12a-LFD檢測(cè)技術(shù)可以在實(shí)驗(yàn)室外完成犀牛源性成分的現(xiàn)場(chǎng)鑒定。與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室實(shí)時(shí)定量PCR相比，該技術(shù)不僅降低了成本，還通過簡(jiǎn)化檢測(cè)過程降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求，展現(xiàn)了在野外物種鑒定方面的潛力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在較低的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，5 個(gè)現(xiàn)生犀牛的核酸樣本可以被準(zhǔn)確地顯示在試紙條上，其他哺乳動(dòng)物沒有陽性條帶出現(xiàn)；非專業(yè)人員可以在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中對(duì)樣品的物種信息進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定；全流程檢測(cè)時(shí)間是傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定技術(shù)所需時(shí)間的1/4，這還不包括樣本從口岸查驗(yàn)點(diǎn)流轉(zhuǎn)到實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間。

綜上所述，本研究成功建立了基于ERACRISPR/Cas12a-LFD 的犀牛特異性現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)，并證明其在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中快速靈敏地識(shí)別犀牛成分的能力。該技術(shù)具備實(shí)時(shí)檢測(cè)所需的關(guān)鍵要素，并在現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中展示了良好的效果；具有廣泛應(yīng)用的潛力，可以應(yīng)用于海關(guān)緝私、生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物多樣性監(jiān)測(cè)和生物遺傳材料的現(xiàn)場(chǎng)篩選等領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)高速、高靈敏度和高精度的犀牛物種遺傳信息識(shí)別。