黃春暉，白天道，李遠(yuǎn)發(fā)，黃厚宸，鄭黨斌，蔣維昕

（1.廣西大學(xué) a.廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.林學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)國有雅長(zhǎng)林場(chǎng)，廣西 百色 533000）

空間遺傳結(jié)構(gòu)是指不同基因型個(gè)體在空間上的非隨機(jī)分布[1]，反映了物種/種群自身的生物學(xué)特性、生態(tài)適應(yīng)性、生境變遷與自然選擇效應(yīng)[2]。植物種群的空間遺傳結(jié)構(gòu)主要取決于物種繁育機(jī)制、花粉和種子的散播方式、遺傳漂移、微生境選擇及植物非隨機(jī)空間分布等因素[3]。通常來說，以風(fēng)媒傳粉和風(fēng)力傳播種子的松柏類植物，其個(gè)體基因型空間分布接近于隨機(jī)分布[4]，而當(dāng)花粉、種子傳播范圍小于植物種群面積時(shí)，小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)十分明顯[5]。對(duì)華木蓮Sinomanglietia glauca[6]和水青樹Tetracentronsinense[7]的小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)研究均發(fā)現(xiàn)，有限的基因流是居群形成空間遺傳結(jié)構(gòu)的主要原因。相反，種子具翅的植物，如鵝掌楸Liriodendronchinense[8]，可借助風(fēng)力傳播種子，基因流較強(qiáng)，一定程度上降低了其空間遺傳結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)影響著植物種群、交配系統(tǒng)、有效種群大小、近交程度以及種群對(duì)微生境變化的適應(yīng)能力，進(jìn)而影響植物種群的動(dòng)態(tài)[9]。通過分析種群空間遺傳結(jié)構(gòu)，可以有效地獲得種群歷史、生活史特征、遺傳漂變、基因流和其他遺傳過程的信息，有助于探討各種進(jìn)化因素間的作用，從而為科學(xué)制定種群的利用和保護(hù)策略奠定理論基礎(chǔ)。

擇伐是實(shí)現(xiàn)森林可持續(xù)經(jīng)營的重要措施，在林業(yè)生產(chǎn)中已持續(xù)超過半個(gè)世紀(jì)[10]。研究表明，擇伐通過移除部分成年樹木改變了林分的競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境，調(diào)節(jié)了林木間的資源分配，對(duì)林地環(huán)境、林木生長(zhǎng)和林下更新有顯著影響[11-15]。擇伐通過剔除部分基因型，很可能會(huì)對(duì)林分的基因構(gòu)成及空間遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。有研究認(rèn)為，擇伐會(huì)降低后續(xù)更新群體的遺傳多樣性[16]，也有研究發(fā)現(xiàn)擇伐和未擇伐群體在遺傳多樣性和空間結(jié)構(gòu)上無顯著差別[17-18]，但擇伐后保留個(gè)體有等位基因頻率減少和丟失的趨勢(shì)[19]。許玉蘭等[20]對(duì)不同擇伐條件下的云南松Pinusyunnanensis遺傳多樣化研究發(fā)現(xiàn)，不同的擇伐方式對(duì)云南松群體遺傳多樣性影響并不顯著；周祺[21]對(duì)色木槭Acermono天然種群的研究發(fā)現(xiàn)，人為撫育或干擾后保留適當(dāng)?shù)姆N群個(gè)體數(shù)則物種遺傳多樣性不會(huì)受到較大影響，同時(shí)有利于調(diào)控種群的空間遺傳結(jié)構(gòu)。盡管這些研究從人為經(jīng)營對(duì)林分遺傳多樣性影響的角度進(jìn)行了有益的探索，但總體上擇伐（尤其以收獲為主的大徑木擇伐）后林分遺傳多樣性和空間遺傳格局會(huì)發(fā)生何種變化，目前所知十分有限。

細(xì)葉云南松Pinusyunnanensisvar.tenuifolia被認(rèn)為是云南松適應(yīng)干熱河谷氣候的一個(gè)地理變種，僅分布于中國西南地區(qū)紅水河、南盤江、北盤江下游地帶，屬于微域分布的植被類型[22]。在南盤江流域森林中，細(xì)葉云南松作為上層優(yōu)勢(shì)樹種，在區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位[23]。近年來，該區(qū)域其他經(jīng)濟(jì)林（板栗Castaneamollissima、油茶Camelliaoleifera等）的迅速發(fā)展使得細(xì)葉云南松天然林受到大量蠶食和破壞，林分面積不斷衰減[24]。目前，對(duì)細(xì)葉云南松林分的研究主要包括群落結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)[25]、空間分布[26]、種內(nèi)和種間競(jìng)爭(zhēng)[27]、木材特性[28]、遺傳多樣性[29-30]等方面。而擇伐等人為擾動(dòng)對(duì)細(xì)葉云南松林分遺傳多樣性及小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)是否造成影響目前尚未見研究報(bào)道。本研究以細(xì)葉云南松天然次生種群為對(duì)象，基于nSSR標(biāo)記探究該林分在早年（1970年）經(jīng)大徑木強(qiáng)度擇伐（拔大毛）后，自然恢復(fù)至今（2019年）的林分遺傳多樣性變化及其小尺度空間遺傳格局。試圖從遺傳角度揭示大徑木擇伐對(duì)林分恢復(fù)的影響，進(jìn)而為細(xì)葉云南松天然林資源保育和人工林可持續(xù)經(jīng)營提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及采樣

樣品采集于廣西雅長(zhǎng)蘭科植物國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)花坪樣地（106°23′11″E，24°49′54″N，平均海拔約1 254 m）。據(jù)雅長(zhǎng)林場(chǎng)記載，該林分于1970年進(jìn)行了一次經(jīng)營性采伐，即伐掉干形通直的成年大樹（胸徑≥20 cm），保留未達(dá)采伐標(biāo)準(zhǔn)的小樹，其后林分自然恢復(fù)至今，未受到大規(guī)模人為干擾。2005年該林地被劃為自然保護(hù)區(qū)，使該林分的保護(hù)和恢復(fù)得以進(jìn)一步加強(qiáng)。2016年，因研究需要在該林分代表性區(qū)域建成了一塊永久性標(biāo)準(zhǔn)固定樣地（100 m×80 m），樣地內(nèi)上層優(yōu)勢(shì)樹種為細(xì)葉云南松、鐵堅(jiān)油杉Keteleeriadavidiana、栓皮櫟Quercusvariabilis以及西南樺Betulaalnoides等，樣地詳細(xì)情況參考李遠(yuǎn)發(fā)等[26]的相關(guān)報(bào)道。基于全站儀（南方測(cè)繪，NTS-372 R10）獲取樣地內(nèi)每株細(xì)葉云南松相對(duì)坐標(biāo)（x，y，z），總計(jì)46株，胸徑均在10 cm以上[27]。2019年8月，采集樣方內(nèi)全部個(gè)體的當(dāng)年生針葉，放入自封袋經(jīng)硅膠干燥后保存、備用。同時(shí)利用圍徑尺測(cè)定每株林木的胸徑（表1）。

表1 參試細(xì)葉云南松個(gè)體胸徑Table 1 DBH of P.yunnanensis var.tenuifolia

1.2 DNA提取

采用CTAB法提取細(xì)葉云南松針葉總DNA。利用微量核酸蛋白檢測(cè)儀（ScanDrop200，德國）進(jìn)行DNA質(zhì)量和濃度測(cè)定，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

1.3 nSSR-PCR擴(kuò)增

參試標(biāo)記來自馬尾松P.massoniana基因組SSR[31]。經(jīng)穩(wěn)定性和多態(tài)性篩選后，最終選擇15個(gè)標(biāo)記用于群體擴(kuò)增（表2）。PCR反應(yīng)體系10 μL，其中包含DNA模板0.1 μL（50 μg·μL-1），10× Buffer 1 μL，Taq酶 0.1 μL，MgCl21 μL，dNTPs 1 μL，正反引物各 0.3 μL，ddH2O 6.2 μL[32]。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)熱3 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30s（表2），72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，利用運(yùn)用GelAnalyzer 19.1[33]識(shí)別目的條帶大小，以50 bp DNA ladder（Takara）為參照。

表2 nSSR位點(diǎn)序列及引物信息Table 2 Sequence and primer information of microsatellite loci

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016軟件整理后，運(yùn)用R 4.2[34]及其擴(kuò)展包進(jìn)行分析。并采用ggplot2[35]軟件進(jìn)行可視化。

1.4.1 大徑木擇伐后群體遺傳多樣性動(dòng)態(tài)

為分析大徑木擇伐后49年內(nèi)林分遺傳多樣性隨時(shí)間的變化，基于直徑大小與樹齡的正相關(guān)關(guān)系，以及前人基于72年生細(xì)葉云南松解析木生長(zhǎng)規(guī)律的研究報(bào)道[36]，以其速生期（10～55 a）胸徑平均年生長(zhǎng)量（0.9 cm/a）為單位推算樣方現(xiàn)有林木的更新時(shí)間，將樣方內(nèi)細(xì)葉云南松按胸徑分為L(zhǎng)（＞45 cm，15個(gè)單株）、M（30～45 cm，19個(gè)單株）、S（＜30 cm，12個(gè)單株）3組，其中L組代表伐前（樹齡≥50 a）更新個(gè)體（0.9×50=45 cm），M組代表伐后15 a內(nèi)（樹齡34～49 a）更新個(gè)體（0.9×34=30.6 cm），S組代表伐后16 a至今（樹齡≤33 a）的更新個(gè)體。分別計(jì)算各組樣本的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)目（Na）、Shannon’s指數(shù)（I）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、固定指數(shù)（F）等采用R擴(kuò)展包poppr 和hierfstat[37]進(jìn)行計(jì)算；并基于置換檢驗(yàn)分析組間差異。

1.4.2 小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)

利用R包LEA[38]計(jì)算個(gè)體間共祖度（遺傳結(jié)構(gòu)），并結(jié)合樣本坐標(biāo)采用克里格法（Kriging）進(jìn)行空間插值，呈現(xiàn)樣方內(nèi)個(gè)體間的空間遺傳模式；對(duì)樣方高程數(shù)據(jù)采用反距離權(quán)重法（Inverse distance weighting,IDW）插值，描述樣方地形；利用R包adegenet[39]進(jìn)行空間主成分分析（Spatial principal component analysis,sPCA），并基于蒙特卡洛模擬檢測(cè)空間結(jié)構(gòu)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR結(jié)果

微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果顯示，DNA純度為1.61～2.03，純度較高；DNA濃度為129.41～1 006.58 ng/μL。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示提取DNA具有較好的完整性，無明顯拖尾和彌散（圖1）。PCR產(chǎn)物電泳條帶穩(wěn)定清晰（圖2），滿足下一步分析要求。

圖1 部分樣本DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis diagram of some samples

圖2 部分個(gè)體在位點(diǎn)P.Ma77的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification bands of partial samples at locus P.Ma77

2.2 遺傳多樣性動(dòng)態(tài)

參試細(xì)葉云南松群體平均等位基因數(shù)（A）為4.7個(gè)，Shannon’s指數(shù)（I）為1.209，平均觀測(cè)雜合度（Ho）為 0.487，期望雜合度（He）為0.641，該群體具有較豐富的遺傳多樣性（表3）。但其固定指數(shù)顯著大于零（F=0.234），表明群體可能存在一定程度的近/自交。哈迪溫伯格平衡（HWE）檢驗(yàn)表明，大部分位點(diǎn)（除了P.Ma95）均顯著偏離HWE（P＜0.05），表明群體存在非隨機(jī)交配。

表3 參試細(xì)葉云南松群體在15個(gè)nSSR位點(diǎn)上的遺傳多樣性?Table 3 Genetic diversity of 15 microsatellite loci in P.yunnanensis var.tenuifolia

比較不同徑級(jí)組的遺傳多樣性（圖3），發(fā)現(xiàn)Ho有隨徑級(jí)減小而增加的趨勢(shì)，L組與S組差異達(dá)到顯著水平（P=0.02＜0.05）。而He、I則表現(xiàn)為M組相對(duì)較小，且部分組間呈極顯著差異（P＜0.01）。盡管F值在組間未檢測(cè)到顯著差異，但其均值隨徑級(jí)減小呈下降趨勢(shì)，表明該林分在大徑木擇伐后短期內(nèi)遺傳多樣性有所下降，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)異交率和多樣性逐步增加。

2.3 空間遺傳結(jié)構(gòu)

基于最小交叉熵值，參試個(gè)體nSSR基因型最佳分組數(shù)（K）為2（圖4a）。nSSR共祖系數(shù)表明（圖4b），群體內(nèi)部分個(gè)體源于組間異交（含兩種顏色），但也有部分個(gè)體可能源于近交或自交（呈現(xiàn)單一顏色）。

圖4 參試細(xì)葉云南松樣本的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.4 The genetic structure of P.yunnanensis var.tenuifolia samples

將個(gè)體間共祖度結(jié)合個(gè)體空間坐標(biāo)進(jìn)行空間插值（圖5），發(fā)現(xiàn)nSSR基因型第二組（cluster2）除了極少數(shù)個(gè)體（n=3）分布在樣方的左上角，大部分個(gè)體（n=21）主要聚集分布在樣地右下角，而第二組（cluster1）主要分布在樣地中上部（圖5a）。結(jié)合樣方高程數(shù)據(jù)（圖5b），nSSR大致為低坡位個(gè)體聚為一類，高坡位個(gè)體聚為另一類?；趎SSR基因型的空間主成分分析（sPCA）表明，第一主成分特征值占比較大，基于第一主成分的個(gè)體空間主成分得分分布模式與基于nSSR空間遺傳分布模式類似（圖5c）。

圖5 基于個(gè)體遺傳關(guān)系的空間插值及空間主成分分析Fig.5 Spatial genetic structure based on spatial interpolation and spatial principal component analysis (sPCA)

空間自相關(guān)分析表明，樣地中細(xì)葉云南松在整體（圖6a）和局部（圖6b）尺度上均不存在顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu)（P＞0.05）。這說明樣方內(nèi)個(gè)體盡管在遺傳上似乎呈現(xiàn)一定的聚集分布，但個(gè)體間遺傳距離與空間距離關(guān)聯(lián)未達(dá)顯著水平，表明林分現(xiàn)有遺傳分布格局除了受到其花粉和種子自然傳播的影響外，大徑木擇伐造成的母樹空間格局改變可能是另一重要原因。

圖6 細(xì)葉云南松樣地在整體和局部尺度上的nSSR基因型空間自相關(guān)（基于1 000次蒙特卡羅模擬）Fig.6 nSSR genotype spatial autocorrelation analysis of P.yunnanensis var.tenuifolia on the global and partial scale in quadrat (based on 1 000 times Monte Carlo simulation).

3 討 論

3.1 擇伐對(duì)林分遺傳多樣性的影響

遺傳多樣性是生物適應(yīng)復(fù)雜生境、維持群體穩(wěn)定的基礎(chǔ)。對(duì)以異交為主的林木而言，群體減少可能導(dǎo)致其自交率增加，引起衰退直至瀕危[40]。擇伐作為森林經(jīng)營的重要措施，無論是以森林撫育為主的間伐還是收獲為主的大徑木強(qiáng)度擇伐，都會(huì)改變林分內(nèi)的個(gè)體數(shù)量及空間距離，這很可能對(duì)林分的基因構(gòu)成和交配模式造成影響[41]。以往的一些研究表明，強(qiáng)度擇伐會(huì)降低林分等位基因及基因型數(shù)量，造成群體漂變，使伐前及伐后群體遺傳距離增大，但在有效等位基因、期望及觀察雜合度、固定指數(shù)上的影響較小[17,42,19]。也有研究表明，林分成年個(gè)體（相對(duì)于幼年個(gè)體）具有較高的等位基因豐富度和較低的固定指數(shù)[43-44]，表明不同樹種在擇伐后的遺傳多樣性響應(yīng)有所不同[42]。本研究結(jié)果表明，細(xì)葉云南松大徑木強(qiáng)度擇伐后，隨著自我修復(fù)（更新）時(shí)間的延長(zhǎng)，林分的觀測(cè)雜合度有逐步增加的趨勢(shì)，而期望雜合度和Shannon’s指數(shù)呈先下降后增加的趨勢(shì)，總體上，林分的異交率呈增加趨勢(shì)。推測(cè)由于大徑木被伐除后，殘留少量生長(zhǎng)及形質(zhì)較差的植株（一般認(rèn)為是近/自交產(chǎn)生的后代）成為伐后一定時(shí)間內(nèi)林分的主要繁殖母樹，林分有效繁殖群體規(guī)模減小，使得林分更新子代在一定時(shí)間內(nèi)自交率有所增加，遺傳多樣性下降。同時(shí)這些劣質(zhì)母樹與伐前更新（尚未進(jìn)入繁殖期）個(gè)體一起構(gòu)成L組（圖2），在一定程度上降低了伐前更新群體的遺傳多樣性。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)（10～15 a后），林分內(nèi)伐前更新個(gè)體進(jìn)入繁殖期，林分內(nèi)有效繁殖群體增加，林分的異交率增大，林分遺傳多樣性得以恢復(fù)。從當(dāng)前林分來看，參試細(xì)葉云南松群體略高于其他一些松屬樹種的遺傳多樣性，如紅松（Na=2.08，I=0.38，Ho=0.15，He=0.24）[45]、樟子松（Na=2.53，I=0.291，Ho=0.051，He=0.083）[46]、馬尾松（Na=3.31，I=0.64，Ho=0.35，He=0.36）[47]等，說明當(dāng)前細(xì)葉云南松群體遺傳多樣性得到了很好的恢復(fù)。

3.2 林分空間結(jié)構(gòu)及其影響因素

分析空間遺傳結(jié)構(gòu)能有效了解物種遺傳變異與居群或個(gè)體所處位置生境狀況的相關(guān)性，有助于了解物種遺傳多樣性形成的原因，為物種保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)[48]。對(duì)植物而言，花粉流和種子流是影響空間遺傳結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的主要因素[49]。有限的花粉流和種子流會(huì)形成顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu)[50]?；ǚ蹅鞑シ矫?，風(fēng)媒花比蟲媒花擴(kuò)散范圍更大；種子傳播方面，風(fēng)力傳播比重力或鳥類傳播范圍更大[51]。依靠風(fēng)媒傳粉和風(fēng)力傳播種子的松柏類植物，其個(gè)體基因型空間分布接近于隨機(jī)分布[52]。與其他松樹類似，本研究中，細(xì)葉云南松在100 m尺度范圍內(nèi)未檢測(cè)到顯著的空間結(jié)構(gòu)。其作為風(fēng)媒植物，花粉粒小，具氣囊且不具黏性，易隨風(fēng)傳播。另外，細(xì)葉云南松球果成熟后通常存留在樹上并開裂，使種子散落，其種子具種翅，可借助風(fēng)力傳播，大大提高了種子往遠(yuǎn)處擴(kuò)散的可能[29]。

將nSSR空間遺傳分布與樣方高程分布模式進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩者具有一定的關(guān)聯(lián)，高海拔區(qū)（大部分）個(gè)體聚為一組，低海拔區(qū)個(gè)體聚另一組，表明樣地地形可能直接或間接影響（如風(fēng)向、土壤肥力等）了當(dāng)前林分的空間遺傳格局。值得注意的是，盡管樣方內(nèi)個(gè)體間無顯著空間自相關(guān)，但基于共祖系數(shù)及遺傳距離的空間聚類分析表明，細(xì)葉云南松在樣方內(nèi)仍存在一定的聚集分布。這可能歸因于大徑木擇伐后原有林分的隨機(jī)分布格局被破壞，林分內(nèi)非隨機(jī)分布的母樹間距離變大，在林木就近交配原則和種子流共同作用下，相鄰個(gè)體間表現(xiàn)出一定的遺傳相似性。

需要指出的是，本研究?jī)H基于nSSR標(biāo)記探究了100 m×80 m樣方范圍內(nèi)細(xì)葉云南松小尺度遺傳格局，要想更為準(zhǔn)確地探究其小尺度遺傳結(jié)構(gòu)，可能需要在多點(diǎn)設(shè)置更大的樣方，并結(jié)合其父系遺傳的葉綠體標(biāo)記（如cpSSR）進(jìn)行林分內(nèi)花粉流分析，以進(jìn)一步揭示其空間遺傳結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

本研究以大徑木強(qiáng)度擇伐后自然恢復(fù)49 a細(xì)葉云南松天然群體為材料，探究了大徑木強(qiáng)度擇伐對(duì)后續(xù)更新群體的遺傳多樣性及空間遺傳格局的影響。結(jié)果表明，大徑木擇伐后一定時(shí)間內(nèi)林分的遺傳多樣性有所下降，但隨著林分自然更新和恢復(fù)其遺傳多樣性逐步增加?？臻g遺傳結(jié)構(gòu)分析表明該群體在樣方內(nèi)呈現(xiàn)輕度聚集分布。大徑木強(qiáng)度擇伐一定程度上影響了林分空間格局，但在后期花粉及種子長(zhǎng)距離風(fēng)力傳播的影響下，林分的空間結(jié)構(gòu)（非隨機(jī)分布）得到緩解。細(xì)葉云南松林具有較好的遺傳多樣性自我修復(fù)能力。