武峰峰，高振秋，鄭亮，3，牛欣雨，魏佳琪，吳志軍，張華，曹宏偉，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.鹽城師范學(xué)院藥學(xué)院；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

宿主的先天免疫是抵御病毒感染的第一道防線，但一些病毒已經(jīng)進(jìn)化出多種逃避抗病毒先天免疫的策略。豬腸道冠狀病毒（PECS）包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬δ 冠狀病毒（PDCoV）、傳染性胃腸炎冠狀病毒（TGEV）和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV），可引起仔豬致死性腹瀉，威脅全球養(yǎng)豬業(yè)。與其他冠狀病毒一樣，PEDV 的免疫逃逸是引起感染的關(guān)鍵致病機(jī)制。

PEDV 為冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，基因組結(jié)構(gòu)包括編碼S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白和N 蛋白四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的基因，其余基因編碼16 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。PEDV 可引起豬的急性和高度傳染性腸道病毒病。從2010 年開始，美國(guó)和亞洲國(guó)家的PEDV 疫情顯著增加，在全球范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]，已確定導(dǎo)致這些疫情發(fā)生的是高毒力的PEDV 毒株的變種。這些PEDV 毒株的免疫逃逸與仔豬病情嚴(yán)重密切相關(guān)。在PEDV 感染過程中，病毒能夠通過某種途徑抵抗宿主的抗病毒反應(yīng)，幾個(gè)復(fù)制酶作為干擾素拮抗劑，阻斷宿主抗病毒蛋白的表達(dá)[4]。PEDV Nsp14是一種具有鳥嘌呤N7 甲基轉(zhuǎn)移酶和外切酶結(jié)構(gòu)域的雙功能酶[5]，N7 甲基轉(zhuǎn)移酶活性對(duì)病毒基因組的翻譯至關(guān)重要，能夠防止宿主將病毒mRNAs 視為“非我”[6]，如果Nsp14 的N7 甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，那么PEDV 對(duì)宿主的天然免疫反應(yīng)將會(huì)變得更加敏感。而Nsp14 的外切酶活性在抵抗病毒天然免疫反應(yīng)的過程中也發(fā)揮著重要作用[6]。一項(xiàng)研究表明，N7 甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷的PEDV 在復(fù)制方面存在缺陷，但感染該病毒會(huì)導(dǎo)致Ⅰ型和Ⅲ型IFN 分泌增加[7]。對(duì)冠狀病毒Nsp14 的研究已經(jīng)逐漸深入，然而PEDV Nsp14 仍有許多功能有待進(jìn)一步探究。

所以，研究擬利用RT-PCR 的方法從病變豬小腸中擴(kuò)增出PEDV Nsp14 基因，并將該基因與真核表達(dá)載體PRK5-Myc 相融合后轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，觀察重組表達(dá)載體PRK5-Myc-Nsp14 的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示，研究成功構(gòu)建PEDV Nsp14 基因的重組表達(dá)載體PRK5-Myc-Nsp14，并用Western Blot 技術(shù)驗(yàn)證PRK5-Myc-Nsp14 重組載體成功在真核細(xì)胞中表達(dá)，為以后深入探索PEDV Nsp14 蛋白的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑

HeLa 細(xì)胞和IPEC J2 細(xì)胞均保存于生物中心509 試驗(yàn)室液氮罐中；小鼠抗Myc 單克隆抗體（mAb）、小鼠抗β-actin 單抗（mAb）以及山羊抗小鼠辣根酶標(biāo)記IgG、FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)公司；DEME 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal cattle serum，F(xiàn)BS）、Lipofectamine TM 2 000 購(gòu)自英濰捷基（Invitrogen）上海貿(mào)易有限公司；DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Omega 公司；MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR 試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq 熱啟動(dòng)DNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公司；引物合成和序列測(cè)定由擎科生物（北京）公司完成；感受態(tài)細(xì)胞DH5α 購(gòu)自北京天根公司；PRK5-Myc 載體由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)及表達(dá)載體構(gòu)建路線

根據(jù)已發(fā)表在GenBank 網(wǎng)站中PEDV USA/KS/2013 毒株（KJ184549.1）基因序列，設(shè)計(jì)具有特異性的PEDV Nsp14 基因上游及下游引物，上游引物：5’-AAGCCTGACATTGACATTG-3’（EcoRⅠ）和下游引物：5’-TGCCGAACCTATCATTGA-3’（HindⅢ）。將PEDV Nsp14 基因插入PRK5-Myc 的EcoRⅠ/HindⅢ位點(diǎn)之間。構(gòu)建以Myc 為標(biāo)簽的Nsp14 蛋白融合表達(dá)載體。

1.3 擴(kuò)增PEDV Nsp14 基因

取部分病變的豬小腸組織于研缽中，加入液氮并迅速研磨，將研磨成粉末狀的組織分裝于1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol 溶液后劇烈搖晃60 s，靜置10 min 后加入200 μL 在4 ℃冰箱中預(yù)冷的三氯甲烷溶液并迅速搖晃20 s，靜置15 min 后在4 ℃低溫離心機(jī)中離心15 min，離心力10 000×g。將離心結(jié)束后的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中并向其中加入600 μL 異丙醇溶液，輕搖混勻后靜置10 min。靜置完畢在4 ℃低溫離心機(jī)中離心10 min，離心力為10 000×g。離心結(jié)束后棄掉上清，并向其中加入600 μL用DEPC 水配制的濃度為75%的乙醇，靜置10 min后在4 ℃低溫離心機(jī)中離心10 min，離心力為10 000×g。離心結(jié)束后棄上清，靜置5 min 后加入20 μL 的DEPC 水靜止15 min，測(cè)量RNA 濃度后保存于-80 ℃冰箱中。

取1 000 ngRNA 于PCR 管中，加入1 μL oliga（dT）并補(bǔ)加DEPC 水至6 μL，放入PCR 儀70 ℃持續(xù)10 min。10 min 后再加入2 μL buffer，2 μL dNTP，0.25 μL RRI，0.1 μL M-MLV，5.65 μL DEPC 水，放入PCR 儀30 ℃10 min；42 ℃1 h，80 ℃10 min。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束獲得PEDV Nsp14 基因的cDNA，測(cè)量DNA濃度后保存于-20 ℃冰箱中。

取500 ng 上一步得到的cDNA 于PCR 管中，加入4 μL dNTP Mixture，5.0 μL 10×PCR Buffer，0.4 μL上游引物、0.4 μL 下游引物、0.25 μL Taq 酶，最后加入dd H2O 至總體積為50 μL，放入PCR 儀94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35 次。最后一個(gè)循環(huán)72 ℃，延伸10 min，獲得PEDV Nsp14 基因片段。

1.4 PEDV Nsp14 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將PEDV Nsp14 基因片段和PRK5-Myc 載體均使用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，試驗(yàn)條件為37 ℃，酶切2 h，酶切完畢后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并利用Omega DNA 膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。

向上述兩種回收產(chǎn)物中加入T4 連接酶、buffer和去離子水，置于16 ℃連接儀，連接反應(yīng)持續(xù)12 h。連接產(chǎn)物用DH5α 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并于固體LB 培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。從過夜培養(yǎng)的固體LB 培養(yǎng)基上挑取單菌落于液體LB 培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，并使用Omega 質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，將所提質(zhì)粒進(jìn)行PCR 鑒定和雙酶切鑒定，篩選正確的質(zhì)粒，保存于-20 ℃冰箱中。并從中取10 μL 質(zhì)粒送至公司進(jìn)行測(cè)序，重組質(zhì)粒命名為PRK5-Myc-Nsp14。

1.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞及Western Blot 檢測(cè)

將Hela 細(xì)胞和IPEC J2 細(xì)胞接種至24 孔板內(nèi)，當(dāng)其細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用脂質(zhì)體Lipofectin2 000 將質(zhì)粒送入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h 后棄掉培養(yǎng)液，沿壁輕柔加入PBS 緩沖液清洗2~3 次，加入RIPA 裂解液30 μL，冰浴裂解30 min。裂解完畢，刮下細(xì)胞置于1.5 mL 離心管中，在4 ℃低溫離心機(jī)中離心10 min，離心力為12 000×g，收集上清液，加入5×Loading Buffer，在沸水中煮10 min。得到處理好的蛋白樣品，將所得蛋白樣品進(jìn)行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后將目的條帶經(jīng)濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后，用TBST 洗膜8 次，每次15 min，用小鼠抗Myc單克隆抗體（1∶3 000）在4 ℃低溫?fù)u床中孵育過夜，用TBST 洗膜8 次，每次15 min，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶3 000）搖床孵育2 h，經(jīng)TBST 洗膜，利用特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.6 間接免疫熒光

向24 孔板中放入爬片，將Hela 細(xì)胞和IPEC-J2細(xì)胞接種至24 孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí)，用Lipofectin2 000 將PRK5-Myc 和PRK5-Myc-Nsp14 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至IPEC-J2 和Hela 細(xì)胞中，4~6 h 后更換含有10%胎牛血清的DMEM。在37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h 后棄掉培養(yǎng)液，沿壁輕柔加入4 ℃預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗2~3 次，每孔加入500 μL 的4%的多聚甲醛，室溫條件下固定20 min；再用4 ℃預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗細(xì)胞2~3 次，每次清洗5 min。然后加入0.1%的Triton X-100，室溫條件下透膜20 min；用4 ℃預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗細(xì)胞2~3 次，每次5 min；加入5% BSA 封閉2 h，加入一抗孵育1 h；PBS 清洗3 次，每次清洗5 min；加入熒光素標(biāo)記的二抗（1∶3 000），在室溫條件下避光孵育2 h；PBS 清洗3 次，每次5 min。最后取干凈且滅菌后的載玻片，滴加少量DAPI 染料，用針頭挑出爬片，讓帶有細(xì)胞的面朝下扣在載玻片上，用吸水紙吸掉多余液體，用橡皮輕輕壓緊，再將指甲油均勻涂抹在爬片周圍，避光晾干，待片子干燥后用熒光顯微鏡觀察拍照，并保存圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV Nsp14 基因片段的PCR 擴(kuò)增

取病變豬小腸組織于研缽中，加入液氮研磨成粉末后，用Trizol 試劑提取組織總RNA，以提取出的總RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，接下來以cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到片段大小為1 551 bp 的目的條帶，即為特異的PEDV Nsp14 基因片段，結(jié)果如圖1。

圖1 Nsp14 基因片段的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Nsp14 gene fragment

2.2 PEDV Nsp14 及真核表達(dá)載體PRK5-Myc 的雙酶切

將PCR 擴(kuò)增后的目的基因與真核表達(dá)載體PRK5-Myc 連接之前，用EcoRⅠ和HindⅢ核酸內(nèi)切酶將目的基因和載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2。

圖2 PEDV Nsp14 基因和真核表達(dá)載體PRK5-Myc 的雙酶切Fig.2 Double restriction digestion of PEDV Nsp14 gene and eukaryotic expression vector PRK5-Myc

2.3 重組質(zhì)粒PRK5-Myc-Nsp14 的PCR 鑒定

利用T4 連接酶將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及提取質(zhì)粒后得到重組質(zhì)粒PRK5-Myc-Nsp14。用常規(guī)方法進(jìn)行PCR 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在1 551 bp 附近有單一明亮目的條帶，符合理論設(shè)計(jì)結(jié)果，結(jié)果如圖3。

圖3 重組質(zhì)粒PRK5-Myc -Nsp14 的PCR 鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid PRK5-Myc -Nsp14 using PCR

2.4 重組質(zhì)粒PRK5-Myc-Nsp14 雙酶切鑒定

經(jīng)PCR 初步鑒定后，取1 000 ng 結(jié)果為陽性的質(zhì)粒，加入EcoRⅠ和HindⅢ兩種酶置于37 ℃水浴鍋中對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果得到片段大小約為1 551 bp 和4 720 bp 的兩條目的條帶，得到結(jié)果與預(yù)期理論設(shè)計(jì)結(jié)果相符，結(jié)果如圖4。

圖4 重組質(zhì)粒PRK5-Myc-Nsp14 的雙酶切分析Fig.4 Double enzyme digestion analysis of recombinant plasmid PRK5-Myc-Nsp14

2.5 重組表達(dá)載體序列比對(duì)

取10 μL PRK5-Myc-Nsp 14 質(zhì)粒送至北京生物公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與PEDV USA/KS/2013 毒株（KJ184549.1）序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示其同源性高達(dá)99%，結(jié)果如圖5。

圖5 PRK5-Myc-Nsp14 與USA/KS/2013 毒株（KJ184549.1）序列比對(duì)Fig.5 Sequence alignment between PRK5-Myc-Nsp14 and USA/KS/2013（KJ184549.1）strains

2.6 Western Blot 檢測(cè)細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白

處理好的蛋白樣品經(jīng)SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將目的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜完畢，先用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后分別用鼠抗Myc 單抗及山羊抗小鼠二抗（1∶3 000）孵育，檢測(cè)載體PRK5-Myc 及重組表達(dá)載體PRK5-Myc-Nsp14 的表達(dá)情況，其結(jié)果顯示為圖6。

圖6 Western Blot 鑒定蛋白融合表達(dá)Fig.6 Identification of protein fusion expression by western Blot

2.7 Nsp14 蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)

利用熒光顯微鏡觀察PRK5-Myc-Nsp14 在Hela細(xì)胞和IPEC-J2 細(xì)胞中紅色熒光的分布情況，以此用來確定重組表達(dá)載體PRK5-Myc-Nsp14 在細(xì)胞中的表達(dá)以及定位的情況。結(jié)果顯示重組表達(dá)載體PRK5-Myc-Nsp14 質(zhì)粒成功表達(dá)，并且在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有分布，結(jié)果如圖7。

圖7 Nsp14 蛋白在Hela 細(xì)胞和IPEC-J2 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.7 Expression of Nsp14 protein in Hela cells and IPEC-J2 cells

3 討論

2010 年以來，PEDV 變異株逐漸席卷全球養(yǎng)豬業(yè)，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病毒如此巨大的危害與其強(qiáng)大的傳播性分不開。一般來說，PEDV 的主要傳播途徑是糞口傳播，但在豬與豬以及農(nóng)場(chǎng)與農(nóng)場(chǎng)之間可能通過糞便到鼻腔的途徑進(jìn)行空氣傳播[8]。PEDV 主要感染豬腸上皮細(xì)胞，然后定植于腸道，導(dǎo)致腸道絨毛萎縮、壞死和脫落，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，引起豬嘔吐、腹瀉、體重減輕、食欲不振和抑郁[9-10]。當(dāng)PEDV 進(jìn)入到糞便中時(shí)，受污染的糞便可能會(huì)導(dǎo)致大規(guī)模疫情。保護(hù)新生哺乳仔豬免受PEDV 感染最有效的策略是從初乳和乳汁中獲得足夠的母體抗體[11]。雖然PEDV 滅活疫苗、弱毒疫苗已經(jīng)開始廣泛使用，但各國(guó)豬場(chǎng)感染率仍然非常高[12]。因此，迫切需要對(duì)該病及其病原體進(jìn)行深入研究，并迅速開發(fā)基于流行毒株的有效疫苗。

有關(guān)PEDV 各方面的研究已經(jīng)展開，例如在PEDV 引起細(xì)胞自噬方面[13]，在PEDV 抗原表位鑒定方面等[14]。有報(bào)告指出Nsp14 是一種雙功能蛋白，它除了具有核酸外切酶活性外，在其C 末端結(jié)構(gòu)域還具有鳥嘌呤N7 甲基轉(zhuǎn)移酶活性，屬于核酸外切酶超家族DEDD，Nsp14 還包括許多DNA 聚合酶以及其他真核和原核外核酸酶的校對(duì)結(jié)構(gòu)域[15]。N7 甲基鳥苷帽是真核生物mRNA 的一個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)特征，包括那些在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的真核生物病毒。Nsp14 能夠催化核苷單磷酸沿3’-5’方向切除[16]。這種核酸外切酶活性對(duì)于冠狀病毒復(fù)制過程中的校對(duì)活性至關(guān)重要。Nsp14 包含三個(gè)外顯子保守基序，在三個(gè)外顯子保守基序中含有四個(gè)關(guān)鍵的金屬配位氨基酸。金屬離子Mg2+或Mn2+對(duì)Nsp14 核酸外切酶活性至關(guān)重要[16]。不同部位的基序發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致突變率增加，對(duì)致死性突變和IFN-β 更敏感，感染峰值滴度降低等影響[16-19]。

一些研究表明，冠狀病毒nsp10 是Nsp14 外切酶活性的刺激因子，使其核酸外切酶活性增加[16-17]。破壞nsp10 和Nsp14 之間的相互作用或Nsp14 外切酶活性失活會(huì)降低復(fù)制的保真度，并加速致死突變的產(chǎn)生[18，20-21]。雖然基本的Nsp14 外切酶活性不需要輔因子的存在，但它的活性只有在nsp10 蛋白存在的情況下才被完全激活[17]。Nsp14 核酸外切酶還參與了病毒生命周期的其他過程，包括對(duì)病毒基因組重組的調(diào)控[22]和干擾宿主的先天性免疫反應(yīng)[6]。此外，Nsp14外切酶活性可能使冠狀病毒對(duì)核苷類似物（NA）藥物[20，23-25]產(chǎn)生特異性耐藥性，這對(duì)以nsp12（RNA 依賴RNA 聚合酶）為靶標(biāo)的核苷抑制劑的開發(fā)構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn)。因此，研究Nsp14 的功能對(duì)了解病毒免疫逃逸的機(jī)制等其他方面具有重要作用。

試驗(yàn)使用Trizol 法從病變豬小腸中提取總RNA，并通過PCR 技術(shù)獲得PEDV Nsp14 基因，將基因和空載體同時(shí)雙酶切后用T4 連接酶連接，連接產(chǎn)物在固體LB 培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化，10 h 后將部分單菌落在液體LB 中擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，經(jīng)過PCR 檢測(cè)和雙酶切檢測(cè)鑒定重組質(zhì)粒，在真核細(xì)胞中檢測(cè)表達(dá)情況和細(xì)胞定位情況。試驗(yàn)為后續(xù)對(duì)Nsp14 蛋白功能的探索奠定了基礎(chǔ)。