王宇欣 郭 怡 王 沖

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)1 公共衛(wèi)生學(xué)院,2 醫(yī)學(xué)科研實驗中心,陜西省咸陽市 712046)

肥胖是當(dāng)代社會面臨的嚴(yán)重健康問題之一,與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。結(jié)腸炎相關(guān)性癌(colitis-associated cancer,CAC)是以腸道慢性炎癥為基礎(chǔ)的癌變,結(jié)腸炎癥持續(xù)存在并向癌癥轉(zhuǎn)化的動態(tài)演進(jìn)過程即為結(jié)腸炎-癌轉(zhuǎn)化。近年來,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肥胖與結(jié)腸炎-癌轉(zhuǎn)化之間存在著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)。肥胖引起的微生物群組成和干細(xì)胞調(diào)節(jié)的改變可以促進(jìn)CAC的發(fā)生[2]。Wunderlich等[3]的研究結(jié)果顯示,與正常飼料喂養(yǎng)的結(jié)腸炎小鼠相比,高脂飼料喂養(yǎng)所致肥胖的結(jié)腸炎小鼠的異常增生性腫瘤發(fā)生率升高,且小鼠結(jié)直腸組織中炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子、IL-1β和IL-10的表達(dá)水平升高,表明肥胖加劇了結(jié)腸炎癥,損害了腸道屏障功能,促進(jìn)CAC的發(fā)生。

脂聯(lián)素是一種由脂肪細(xì)胞分泌的激素,被認(rèn)為對能量代謝、炎癥調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生起著重要作用[4]。血清中的脂聯(lián)素水平與內(nèi)臟肥胖的發(fā)生呈負(fù)相關(guān),并具有抗糖尿病、抗炎和抗動脈粥樣硬化的特性[5-6]。脂聯(lián)素主要通過與脂聯(lián)素受體(adiponectin receptor,AdipoR)1和AdipoR2的結(jié)合而發(fā)揮作用[7]。脂聯(lián)素及其受體參與調(diào)控腫瘤的生長和進(jìn)展過程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵過程,對結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生雙重影響[8]。然而,在肥胖狀態(tài)下,AdipoR在結(jié)腸炎-癌轉(zhuǎn)化過程中的作用還不清楚。因此,本研究首先建立肥胖小鼠模型,然后通過腹腔注射氧化偶氮甲烷聯(lián)合飲用2%硫酸葡聚糖鈉鹽的方法[9-11]建立CAC模型,探究AdipoR在肥胖相關(guān)CAC小鼠結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 氧化偶氮甲烷購自Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司(批號:25843-45-2),葡聚糖硫酸鈉購自MP Biomedicals Co.,Ltd.(批號:100GM),高脂飼料購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司,RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR檢測試劑盒均購自TaKaRa公司(批號分別為9108、DRR036A、DRR081AP),兔抗AdipoR1多克隆抗體購自GenXspan公司(批號:GXP10744),山羊抗AdipoR2多克隆抗體、生物素化山羊抗鼠IgG(H+L)購自Abcam公司(批號分別為ab77612、ab6789),β-actin抗體購自Merck Millipore公司(批號:MABT825),RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、二喹啉甲酸蛋白濃度檢測試劑盒、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物(武漢博士德生物工程有限公司,批號分別為AR0102、AR1178、AR0146、AR1197)。顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司(型號:CX21),高速臺式冷凍離心機購自Eppendorf公司(型號:5417R),組織勻漿器購自IKA公司(型號:T10basic),超微量分光光度計購自Thermo Fisher Scientific公司(型號:NanoDrop 2000c),PCR儀購自Applied Biosystems公司(型號:ABI-7500),電泳儀、電泳電源購自Bio-Rad公司(型號分別為1658004、1645070),凝膠成像系統(tǒng)購自ProteinSimple公司(型號:FC3)。

1.2 肥胖小鼠模型的建立 34只無特定病原體級健康雌性昆明小鼠購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司[動物合格證號:SCXK(川)2020-030],4周齡,體重20～30 g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20 ℃～25 ℃,晝夜明暗交替(日光燈照明)。給予普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)(自由飲水)1周后,按空腹體重采用隨機數(shù)字表法選取14只小鼠設(shè)為正常組,繼續(xù)飼喂普通飼料。給予其余20只小鼠飼喂高脂飼料,喂養(yǎng)4周,其間每周測定1次空腹體重,4周后,選取空腹體重高出正常組平均體重20%的10只小鼠作為造模成功的肥胖小鼠(肥胖模型組)。

1.3 結(jié)腸炎-癌轉(zhuǎn)化小鼠模型的建立 采用隨機數(shù)字表法將14只正常組小鼠隨機分為空白對照組(6只)、空白模型組(8只)。給予空白模型組和肥胖模型組小鼠一次性腹腔注射氧化偶氮甲烷溶液(使用PBS配置濃度為1 mg/mL的溶液,給藥劑量為12 mg/kg),腹腔注射后給予自由飲水(滅菌蒸餾水),1周后飲水中添加2%硫酸葡聚糖鈉鹽,持續(xù)給藥1周后正常飲水(期間飲用滅菌蒸餾水)2周,此為1個循環(huán),共進(jìn)行3次循環(huán),于實驗結(jié)束時處死小鼠。給予空白對照組小鼠一次性腹腔注射同體積無菌生理鹽水,之后連續(xù)飲用滅菌蒸餾水。所有小鼠飼養(yǎng)條件完全相同。整個造模過程中,繼續(xù)給予空白對照組、空白模型組小鼠飼喂普通飼料,繼續(xù)給予肥胖模型組小鼠飼喂高脂飼料;每天觀察小鼠進(jìn)水量、排便形狀、便血情況和脫肛情況,每周記錄小鼠體重變化。

1.4 腸道組織的收集 造模結(jié)束后,稱量所有小鼠體重,通過腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉,待麻醉成功后將小鼠四肢固定于解剖板上,沿腹中線縱行剖開腹腔。鈍性分離結(jié)腸和遠(yuǎn)端回腸,冰浴截取從肛門處至盲腸末端的全部結(jié)直腸組織,用預(yù)冷的生理鹽水漂洗干凈,沿著結(jié)腸縱軸剖開,去除結(jié)腸回盲部,漂凈腸內(nèi)容物,用1%阿爾新藍(lán)染色結(jié)腸黏膜表面后拍照記錄,使用ImageJ軟件記錄每只小鼠結(jié)直腸腫瘤的數(shù)目。隨后將結(jié)直腸組織分為兩部分:將一部分組織放入EP管置于液氮凍存,隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存,用于后續(xù)分子生物學(xué)實驗;將另一部分組織翻卷成年輪狀后置于4%多聚甲醛中固定,用于后續(xù)HE染色。

1.5 腸道組織病理切片制作及HE染色 將結(jié)直腸組織置于4%甲醛溶液中固定后,用手術(shù)鉗修剪多余組織后放入包埋盒中,使用70%乙醇清洗兩次后過夜浸泡。第2天依次使用70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水10 min,將脫水后的組織置于無水乙醇與二甲苯的混合液(體積比為1∶1)中進(jìn)行透明。于55 ℃的烘箱中溶解石蠟后,將組織浸于54 ℃～56 ℃的石蠟中50 min,浸蠟完成后在石蠟包埋機中進(jìn)行包埋,將包埋好的蠟塊置于4℃冷藏過夜,第2天將蠟塊切片后置于55 ℃烤箱中烤片1 h,二甲苯脫蠟復(fù)水,將切片依次置于無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、雙蒸水中沖洗10 min以脫蠟復(fù)水。在切片上滴加蘇木素染色5 min,流水清洗10 min,伊紅染色5 min。再次對染色后的切片進(jìn)行脫水后,使用中性樹脂封片,在顯微鏡下觀察拍照。

1.6 實時熒光定量PCR檢測結(jié)直腸組織AdipoR1、AdipoR2的mRNA表達(dá)水平 按照RNAiso Plus說明書提取結(jié)直腸組織總RNA,并使用超微量分光光度計檢測260 nm、280 nm處的A值,以A260/280值來評估RNA的純度,確保A260/280值介于1.8～2.2之間。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的小鼠AdipoR1、AdipoR2基因序列,應(yīng)用Primer 3.0軟件設(shè)計引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列見表1。采用實時PCR儀及PCR檢測試劑盒進(jìn)行實時PCR 檢測。設(shè)置反應(yīng)體系為20 μL,包括TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNase H Plus)10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA模板4 μL、RNase-free ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 s;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置2個復(fù)孔,所有基因檢測均重復(fù)3次,并取其平均值。采用2-ΔΔCt法分析目的基因mRNA相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.7 Western blot檢測結(jié)直腸組織AdipoR1、AdipoR2的蛋白表達(dá)水平 取小鼠結(jié)直腸組織按100∶1的比例加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑,勻漿機充分研磨后冰上裂解30 min,12 000 r/min離心10 min后取上清液。采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度后,加入RIPA裂解液和5×上樣緩沖液統(tǒng)一濃度,水浴鍋100 ℃變性10 min,經(jīng)SDS-PAGE分離等量蛋白。電泳結(jié)束后,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,然后在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,然后用兔抗AdipoR1多克隆抗體(1∶1 000)、山羊抗AdipoR2多克隆抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶5 000)在4 ℃下孵育PVDF膜過夜,使用TBST洗膜3次,10 min/次,然后滴加生物素化山羊抗鼠IgG(H+L)(1∶5 000),室溫孵育1 h。使用ECL分析試劑顯影,經(jīng)曝光后,使用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行掃描分析。每個樣本設(shè)置2個復(fù)孔,所有蛋白樣品檢測至少重復(fù)4次,并取其平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示,服從正態(tài)分布且方差齊的計量資料,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠一般狀態(tài) 空白對照組小鼠精神飽滿,反應(yīng)靈敏,行動靈活自如,毛發(fā)光亮,食水?dāng)z入正常,大便呈現(xiàn)黃褐色顆粒狀,無腹瀉或便血等表現(xiàn)?？瞻啄Ｐ徒M和肥胖模型組小鼠普遍出現(xiàn)體重減輕、毛發(fā)晦暗及倦怠少動的現(xiàn)象,并且出現(xiàn)不同程度的腹瀉、便血、脫肛等情況。

2.2 3組小鼠的死亡和成瘤情況比較 在造模過程中,空白對照組死亡小鼠和成瘤小鼠均為0只,死亡比例及成瘤率均為0;空白模型組死亡小鼠1只、成瘤小鼠5只,每只腫瘤數(shù)量0～6個,死亡比例為12.5%(1/8),成瘤率為71.4%(5/7);肥胖模型組死亡小鼠6只、成瘤小鼠4只,每只腫瘤數(shù)量5～6個,死亡比例為60.0%(6/10),成瘤率為100.0%(4/4)。由于每組的小鼠數(shù)量較少,故僅對小鼠存活情況進(jìn)行描述性分析。此外,為保證實驗數(shù)據(jù)的一致性,本實驗以肥胖模型組小鼠的存活數(shù)量4只為標(biāo)準(zhǔn),在空白對照組小鼠和空白模型組成瘤小鼠中,采用隨機數(shù)字表法各選取4只進(jìn)行實時熒光定量PCR和Western blot實驗。

2.3 3組小鼠結(jié)直腸組織的大體形態(tài) 空白對照組小鼠結(jié)直腸組織結(jié)構(gòu)正常;空白模型組小鼠結(jié)腸長度縮短,結(jié)腸黏膜變薄,腸腔內(nèi)可見深黑色糞便,腸壁可見血絲,部分小鼠結(jié)腸遠(yuǎn)端出現(xiàn)數(shù)量不等的腫瘤;與空白模型組小鼠相比,肥胖模型組小鼠結(jié)腸呈短粗狀,糞便堵塞腸腔,腸壁增厚顯著,充血較為嚴(yán)重,結(jié)腸遠(yuǎn)端有多個肉眼可見的大小不一、個數(shù)不等的腫瘤,并且腫瘤數(shù)量明顯增加,見圖1。

空白對照組 空白模型組 肥胖模型組

2.4 3組小鼠結(jié)直腸組織病理學(xué)形態(tài)的比較 空白對照組小鼠的結(jié)腸肌層和黏膜層形態(tài)完整,且隱窩排列整齊,未見炎性細(xì)胞浸潤,無病變情況。與空白對照組相比,空白模型組與肥胖模型組小鼠的結(jié)腸壁厚度增加,鏡下黏膜層及黏膜下層出現(xiàn)廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤,腺體組織結(jié)構(gòu)紊亂、形狀不規(guī)則,且可觀察到腺管樣結(jié)構(gòu),具有組織異型性。與空白模型組相比,肥胖模型組小鼠的結(jié)腸上皮損傷更嚴(yán)重,炎癥反應(yīng)更明顯,杯狀細(xì)胞顯著減少,上皮細(xì)胞核極性破壞,大多數(shù)腺體結(jié)構(gòu)扭曲變形,細(xì)胞核增大深染,部分小鼠的腫瘤侵犯黏膜下層及肌層,見圖2。

空白對照組 空白模型組 肥胖模型組

2.5 3組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR1、AdipoR2的mRNA表達(dá)情況 與空白對照組相比,空白模型組和肥胖模型組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR1、AdipoR2的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05);與空白模型組相比,肥胖模型組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR2的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05),見表2。

表2 3組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR1和AdipoR2的mRNA相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.6 3組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR1、AdipoR2的蛋白表達(dá)情況 與空白對照組相比,空白模型組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR2的蛋白表達(dá)水平、肥胖模型組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR1及AdipoR2的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與空白模型組相比,肥胖模型組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR1的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),見圖3和表3。

圖3 3組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR1、AdipoR2蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 3組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR1和AdipoR2的蛋白相對表達(dá)水平比較(x±s)

3 討 論

CAC是基于腸道慢性炎癥發(fā)展而來的一種癌變類型[12-13]。結(jié)腸炎癥的持續(xù)存在并逐漸演進(jìn)至癌癥是結(jié)腸炎-癌轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程。結(jié)腸炎與結(jié)腸癌之間的相互關(guān)系及其對結(jié)腸癌治療的影響已成為防治結(jié)腸癌領(lǐng)域的研究熱點和挑戰(zhàn)。

肥胖與多種健康問題和慢性疾病密切相關(guān),如癌癥、脂肪肝和阿爾茨海默病等[14]。越來越多的研究表明,肥胖已經(jīng)成為CAC發(fā)生的一個重要危險因素。肥胖本身為一種炎癥狀態(tài),可對腸道環(huán)境和機體免疫功能產(chǎn)生不利影響[15],從而增加結(jié)腸炎和結(jié)腸癌的患病風(fēng)險[16]。肥胖與結(jié)腸炎-癌轉(zhuǎn)化之間存在多個復(fù)雜的相互作用機制。肥胖導(dǎo)致脂肪組織增加,并釋放出多種脂肪因子和炎癥因子,如脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子-α[17]和IL-6[18]等,這些因子可以直接或間接地影響結(jié)直腸組織的炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)展。Tabuso等[19]報告駐留脂肪細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞之間的相互作用,可促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成和結(jié)腸癌的發(fā)展,具體表現(xiàn)為在結(jié)腸癌中駐留脂肪細(xì)胞表現(xiàn)為激活表型,導(dǎo)致促腫瘤因子的增加,從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和新血管生成等過程。B?hr等[20]的研究表明,肥胖大鼠血漿中的IL-1水平較高而IL-10水平較低,這可能導(dǎo)致自然殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性受到抑制,從而增加肥胖大鼠結(jié)腸癌的發(fā)生率。此外,自然殺傷細(xì)胞數(shù)量減少和功能受損可能是肥胖人群結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險增高的原因之一。在本研究中,空白模型組和肥胖模型組小鼠的毛發(fā)稀疏,光澤少,活動明顯減少,出現(xiàn)不同程度的腹瀉、脫肛、便血等表現(xiàn);空白模型組和肥胖模型組小鼠的結(jié)腸遠(yuǎn)端出現(xiàn)數(shù)量不等的腫瘤,腸黏膜炎癥反應(yīng)明顯,結(jié)腸黏膜腺體結(jié)構(gòu)紊亂,且肥胖模型組小鼠的結(jié)腸腫瘤數(shù)量更多,結(jié)腸上皮損傷更嚴(yán)重,炎癥反應(yīng)更明顯。這提示成功建立了CAC小鼠模型及肥胖相關(guān)CAC小鼠模型,且肥胖相關(guān)CAC小鼠模型表現(xiàn)出更嚴(yán)重的腸道癥狀,由此推測肥胖因素可能加劇了CAC的發(fā)展,但關(guān)于肥胖與CAC之間的分子機制仍需進(jìn)一步研究和闡明。

脂聯(lián)素是一種由脂肪組織分泌的激素,被認(rèn)為對能量代謝、炎癥調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生起著重要作用[21],并且具有抗動脈粥樣硬化、抗炎、胰島素增敏的特性[22]。AdipoR是脂聯(lián)素信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵組成部分,它包括AdipoR1和AdipoR2,這兩種受體分布在不同類型的組織和細(xì)胞中[23]。脂聯(lián)素通過與AdipoR結(jié)合來實現(xiàn)信號傳導(dǎo)和生物學(xué)效應(yīng),抑制與腫瘤發(fā)生相關(guān)的生物過程[22]。既往研究表明,AdipoR1和AdipoR2在小鼠結(jié)腸、盲腸和骨骼肌中大量表達(dá),并且同樣也在人腸上皮細(xì)胞系Caco-2、T-84和SW-480中表達(dá)[24]。Peng等[18]制備了豬AdipoR1轉(zhuǎn)基因小鼠(pAdipoR1小鼠)并進(jìn)一步誘導(dǎo)建立結(jié)腸炎小鼠模型,結(jié)果顯示AdipoR1的長期過表達(dá)加劇了小鼠的結(jié)腸炎,并增強巨噬細(xì)胞和結(jié)腸上皮細(xì)胞中促炎因子的表達(dá)。AdipoR1和AdipoR2在轉(zhuǎn)移性或局部晚期乳腺癌患者的樹突狀細(xì)胞中富集,AdipoR1、AdipoR2可能分別通過激活單磷酸腺苷酸激活蛋白激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體和環(huán)氧合酶2信號通路,進(jìn)而減弱樹突狀細(xì)胞的抗腫瘤作用[25]。目前的研究多聚焦于探究AdipoR1和AdipoR2對結(jié)直腸癌預(yù)后的影響。例如,一項基于369例結(jié)直腸癌患者的研究顯示,AdipoR1的過表達(dá)與結(jié)直腸癌的總體生存率較低相關(guān)[26];Barresi等[27]報告AdipoR1和AdipoR2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的總生存率呈顯著相關(guān)性。然而AdipoR1和AdipoR2對肥胖相關(guān)CAC的作用機制尚不明確。因此,我們檢測了AdipoR1和AdipoR2在CAC小鼠和肥胖相關(guān)CAC小鼠結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,空白模型組和肥胖模型組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR1、AdipoR2的mRNA表達(dá)水平升高,空白模型組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR2的蛋白表達(dá)水平、肥胖模型組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR1及AdipoR2的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與空白模型組相比,肥胖模型組小鼠結(jié)直腸組織中AdipoR2的mRNA表達(dá)水平、AdipoR1的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。這表明,在CAC小鼠中脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2的基因和/或蛋白表達(dá)上調(diào),且肥胖狀態(tài)加重這一現(xiàn)象。

總之,脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2與肥胖相關(guān)CAC密切關(guān)聯(lián),兩者有望成為治療肥胖相關(guān)CAC的新靶點。然而,脂聯(lián)素受體在CAC和肥胖相關(guān)CAC中的作用機制,以及其是否可作為結(jié)腸癌的臨床診斷標(biāo)志物,仍需要進(jìn)一步研究證實。