曹心怡，沈宗霖，李桂秋，林志偉，鄭金鑫，余治健，魏影，4

1 佳木斯大學臨床醫(yī)學院，黑龍江佳木斯 154003；2 華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院深圳市內(nèi)源性感染重點實驗室；3 華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心；4 黑龍江省衛(wèi)生健康管理服務評價中心

2021 中國細菌耐藥性監(jiān)測結果顯示，在革蘭陽性菌中金黃色葡萄球菌位居分離菌首位，其次為糞腸球菌［1］。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是金黃色葡萄球菌中常見的多藥耐藥菌，被稱為超級細菌，其毒力比普通金黃色葡萄球菌強且在不同地區(qū)之間的克隆型存在差異［2］。金黃色葡萄球菌感染人體可引起菌血癥，嚴重時可能危及生命；糞腸球菌能夠引起感染性心內(nèi)膜炎，長期定居在腸道可增加肝癌發(fā)生風險［3-4］。生物被膜指附著于有生命或無生命物體表面被蛋白質、多糖、DNA 等細菌胞外大分子包裹的有組織的細菌群體，對抗生素和宿主免疫防御機制的抗性很強。革蘭陽性菌表面蛋白聚集形成生物被膜后可附著于醫(yī)療器械表面難以清除，從而通過導尿管、假肢關節(jié)等感染人體?？堤孢虬?、利奈唑胺屬于新型惡唑烷酮類抗生素，近年來逐步應用于感染治療［5］。研究發(fā)現(xiàn)，康替唑胺對革蘭陽性菌抗菌效果高于一般抗生素，藥代動力學及藥效學參數(shù)顯示康替唑胺對多重耐藥陽性菌具有抗菌活性［6］。利奈唑胺與常見抗生素連用可增加抗菌活性，例如利奈唑胺與萬古霉素聯(lián)合治療可有效降低兒童肺部金黃色葡萄球菌感染，且不良反應少［7］。我們在前期研究中對抗生素進行篩選時發(fā)現(xiàn)，惡唑烷酮抗生素對革蘭陽性菌抗菌活性強并可在亞抑菌濃度下抑制細菌生物被膜形成。因此，2022年9月—2023 年5 月我們進一步研究了康替唑胺、利奈唑胺對常見革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、糞腸球菌的體外抗菌活性及對生物被膜的影響，并通過蛋白質組學初步探究其機制，旨在為臨床研究提供治療指導及對抗生素藥物的研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料 45 株金黃色葡萄球菌臨床菌株、34 株糞腸球菌臨床菌株，其中YUSA145 為MRSA、CHS101 為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA），分別來自2015—2018 年華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院收集的不同住院患者，剔除同一患者不同部位分離的重復菌株。所有菌株均使用Phoenix 100 自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，并在實驗前平板連續(xù)傳代培養(yǎng)后經(jīng)基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）對所有菌株進行重新鑒定?？堤孢虬罚℉Y-19915-117216）、利奈唑胺（HY-10394-44240）均購自美國MCE 公司。質量控制菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213 和糞腸球菌ATCC29212 均購自ATCC 菌株庫。Phoenix-100 全自動細菌鑒定及藥敏系統(tǒng)購自美國BD 公司，全自動生物質譜檢測系統(tǒng)IVD MALDI Biotyper 購自德國布魯克公司，全自動生長曲線分析儀購自芬蘭Bioscreen公司，Q Exactive Plus 液質聯(lián)用儀購自美國Thermofisher Scientific 公司，RIPA 裂解液購自上海翌圣生物科技股份有限公司，陽離子調節(jié)MH 肉湯（CAMHB）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）均購自英國OXOID公司。

1.2 康替唑胺、利奈唑胺對革蘭陽性菌的體外抗菌活性觀察 采用微量肉湯稀釋法。取平臺期金黃色葡萄球菌臨床菌株及標準株ATCC29213、糞腸球菌臨床菌株及標準株ATCC29212，使用TSB 將其調整至600 nm 處光密度值（OD600）=0.1，在96 孔板中分別加入100 μL 濃度梯度的康替唑胺、利奈唑胺及100 μL 經(jīng)CAMHB 培養(yǎng)基1∶1 000 稀釋的菌液，使藥物濃度梯度分別為16.000 00、8.000 00、4.000 00，2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 μg/mL。實驗中另外設置只加細菌的陽性對照及只加培養(yǎng)基的陰性對照。37 ℃溫箱培養(yǎng)20～24 h 后觀察結果，若肉眼不見任何細菌沉淀即為該抗生素對應的最小抑菌濃度（MIC）值。MIC 值越小代表藥物抗菌活性越好，結果根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會指南（CLSI）進行判定。

1.3 康替唑胺、利奈唑胺對革蘭陽性菌生物被膜的影響觀察

1.3.1 康替唑胺、利奈唑胺藥物作用濃度篩選 分別取MRSA YUSA145、MSSA CHS101 及糞腸球菌16C51 各100 μL 過夜，使用TSB 培養(yǎng)基1∶100 稀釋菌液，分別加入100 μL 康替唑胺及利奈唑胺，使其最終濃度為0、1/8×MIC、1/4×MIC、1/2×MIC 及1×MIC。使用全自動生長曲線分析儀每間隔1 h，連續(xù)24 h 測定OD600，代表不同藥物濃度下細菌的生長情況。生長曲線結果顯示，康替唑胺、利奈唑胺濃度達到1×MIC 時細菌生長被完全抑制，在1/2×MIC 濃度并未對細菌生長產(chǎn)生影響。

1.3.2 康替唑胺、利奈唑胺對革蘭陽性菌生物被膜形成的影響觀察 采用結晶紫染色。分別取6 株MRSA、MSSA及糞腸球菌各100 μL 過夜，加入用TSBG（2% GLU+TSB）培養(yǎng)基1∶200 稀釋菌液，添加終濃度為1/8×MIC、1/4×MIC、1/2×MIC 抗生素，只添加菌液作為對照。37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，棄去培養(yǎng)基，用無菌水沖洗3 次，干燥后甲醇固定10 min，0.5% 結晶紫染液染色15 min。流水沖洗至無色，室溫下晾干。使用酶標儀測定570 nm 處的OD值，OD570值即代表生物被膜量。

1.3.3 康替唑胺、利奈唑胺對革蘭陽性菌生物被膜內(nèi)細菌存活率的影響觀察 12 孔板中加入1 mL TSBG 培養(yǎng)基稀釋的MSSA CHS101 及糞腸球菌16C51，添加終濃度為1/8×MIC的康替唑胺、利奈唑胺，只添加菌液作為對照。37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌，使用刮刀刮掉黏附在底部的生物被膜并收集，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋后涂板，分別在12、24 h后進行菌落計數(shù)。

1.4 康替唑胺、利奈唑胺抑制革蘭陽性菌生物被膜的機制分析

1.4.1 康替唑胺、利奈唑胺作用下革蘭陽性菌生物被膜差異表達蛋白篩選 取平臺期細菌MRSA YUSA145 接種到15 mL TSBG 培養(yǎng)基，康替唑胺組及利奈唑胺組分別予以1/4×MIC 康替唑胺、利奈唑胺處理，對照組加同等體積DMSO，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，刮刀收集形成的生物被膜，5 000 r/min 離心5 min。1 mL PBS 水洗3 次，棄去上清后轉移至1.5 mL EP管。將添加蛋白酶抑制劑Cocktail的RIPA裂解緩沖液及直徑為0.1 mm 的磁珠加入含有細菌菌體的EP管。使用破碎儀裂解菌體，破碎60 s 后中止10 s，重復操作4 次。離心機4 ℃、12 000×g 離心20 min，吸出上清液進行BCA 蛋白濃度測定。收集100 μg 蛋白質加入10 mmol/L DTT 中，放置于70 ℃，經(jīng)過1 h還原后，暗處加入50 mmol/L碘乙酰胺烷基化15 min。連續(xù)3次使用100 μL 0.5 mol/L碳酸氫銨脫鹽，使用Amicon 超離心過濾器過濾?？偟鞍装凑?∶50 加入胰蛋白酶并在37 ℃下消化過夜，凍存在-80 ℃，用LC-MS/MS 三重串聯(lián)液質聯(lián)用儀根據(jù)離子帶電荷狀態(tài)對三組所含蛋白質進行定性、定量分析［8］。利用Proteome Discoverer 2.4 和Sequest HT 與金黃色葡萄球菌（Strain NCTC 8325/PS 47）的Uniprot 蛋白組比對進行蛋白鑒定和定量。在至少兩個技術重復中，與對照組同蛋白表達變化2 倍以上且P＜0.05 可確定為上調和下調的差異表達蛋白。

1.4.2 差異表達蛋白的功能分析 將差異表達蛋白上傳到OMICSBEAN 數(shù)據(jù)庫（http：//www. omicsbean.com）進行基因本體（GO）功能注釋及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。利用STING對蛋白質相互作用網(wǎng)絡（PPI）進行分析，觀察蛋白之間的相互作用關系。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件及GraphPad Prism（8.0.2）繪圖軟件。計量資料采用K-S 檢驗進行正態(tài)性分析，符合正態(tài)分布的資料以-x±s表示，組間比較行獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 康替唑胺、利奈唑胺對革蘭陽性菌的體外抗菌活性 康替唑胺對金黃色葡萄球菌的MIC 主要為1、2、4 μg/mL，對糞腸球菌的MIC主要為2、4 μg/mL。利奈唑胺對金黃色葡萄球菌的MIC主要為2、4 μg/mL，對糞腸球菌的MIC 主要為1、2、4 μg/mL。康替唑胺及利奈唑胺對兩種革蘭陽性菌抗菌活性主要集中在2 μg/mL，均≤4 μg/mL，提示抗菌活性較好。

2.2 康替唑胺、利奈唑胺對革蘭陽性菌生物被膜的影響 生長曲線結果顯示，康替唑胺、利奈唑胺在MIC 下完全抑制細菌生長，1/2 MIC 以下未對細菌生長造成任何影響。見OSID 碼圖1。在亞抑菌濃度下康替唑胺、利奈唑胺均導致MRSA YUSA145、MSSA CHS101 及糞腸球菌生物被膜含量下降（P均＜0.05），并且1/2×MIC 濃度時抑制生物被膜效果最顯著，隨著藥物濃度降低抑制效果逐漸減弱。見OSID 碼圖2。1/8×MIC 濃度下康替唑胺、利奈唑胺處理降低了MSSA 及糞腸球菌生物被膜內(nèi)細菌存活率（P均＜0.05），藥物作用12、24 h時細菌生物被膜內(nèi)細菌存活率沒有統(tǒng)計學差異。見OSID碼圖3。

2.3 康替唑胺、利奈唑胺抑制革蘭陽性菌生物被膜形成的機制 康替唑胺作用下革蘭陽性菌生物被膜差異表達蛋白共有290個，其中165個表達上調、125個表達下調；利奈唑胺作用下革蘭陽性菌生物被膜差異表達蛋白共有222個，其中120個表達上調、102個表達下調；差異蛋白主要涉及上調蛋白質生物合成相關蛋白rpmJ、rplE 等；下調表面蛋白SasG、群體感應蛋白luxS、丙氨酸脫氫酶1（ald1）、D-丙氨酸氨基轉移酶等。GO注釋分析顯示，康替唑胺作用下差異表達蛋白主要與丙酮酸代謝過程、氨基酸代謝等過程相關；利奈唑胺作用下差異表達蛋白主要涉及嘧啶代謝過程、嘌呤代謝、氨基酸代謝等過程。KEGG 分析顯示，康替唑胺作用下差異表達蛋白主要涉及萘降解、嘧啶代謝、糖酵解、核糖體切除修復等過程；利奈唑胺作用下差異表達蛋白主要涉及氨基酸降解、脂肪酸降解、嘌呤代謝、戊糖和葡萄糖磷酸鹽轉化過程。PPI 網(wǎng)絡分析顯示，兩種抗生素作用下的差異表達蛋白主要與核糖體相關。見OSID碼圖4、5。

3 討論

細菌的群體感應系統(tǒng)及外界環(huán)境改變均與生物被膜形成相關。細菌生物被膜的存在給醫(yī)療造成了極大危害，細胞外聚集物質促進細菌生物被膜形成，而生物被膜阻止細菌被中性粒細胞吞噬，導致臨床治療失?。?］?？股氐某霈F(xiàn)使得生物感染率大大降低，對人類的生存有著巨大幫助，但是長期使用抗生素易引起細菌耐藥，因此新型抗生素的研發(fā)尤為重要［10］。傳統(tǒng)抗生素抑制生物被膜形成的效果不佳，惡唑烷酮是新型抑制細菌蛋白質合成的抗生素，康替唑胺、利奈唑胺作為新型惡唑烷酮抗生素，逐漸被引入臨床治療皮膚和軟組織感染。研究表明，當MIC≤2 mg/L 時，每天給予膿毒血癥患者600 mg 利奈唑胺可以在肺泡灌洗液中達到最佳治療效果［11］。

本研究結果顯示，惡唑烷酮類抗生素康替唑胺、利奈唑胺對常見革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、糞腸球菌具有廣譜抗菌活性，MIC≤4 μg/mL，即使對MRSA 多重耐藥菌也顯示出良好的抗菌活性。結晶紫染色結果顯示，無論糞腸球菌還是MSSA，甚至MRSA，在亞抑菌濃度下兩種抗生素均可導致細菌生物被膜含量下降，并且在1/2×MIC 時抑制生物被膜效果最顯著，隨著濃度降低抑制效果逐漸減弱，存在劑量依賴性，提示康替唑胺、利奈唑胺能夠以劑量依賴的方式抑制革蘭陽性菌生物被膜的形成。我們進一步選擇MSSA CHS101 及糞腸球菌16C51，觀察在康替唑胺、利奈唑胺1/8×MIC 濃度分別處理細菌12、24 h 后的生物被膜內(nèi)細菌存活率，發(fā)現(xiàn)康替唑胺、利奈唑胺處理降低了MSSA CHS101 及糞腸球菌16C51 生物被膜內(nèi)細菌存活率，但藥物作用12、24 h時細菌生物被膜內(nèi)細菌存活率沒有統(tǒng)計學差異。這可能是因為兩種抗生素僅僅在初期發(fā)揮抑制生物被膜作用，生物被膜形成能力較強的金黃色葡萄球菌、糞腸球菌經(jīng)過12 h就已經(jīng)形成了成熟的生物被膜。

為了分析康替唑胺、利奈唑胺抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的作用機制，我們采用定量蛋白質組學分析1/4×MIC 康替唑胺、利奈唑胺作用下金黃色葡萄球菌生物被膜蛋白質變化。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，康替唑胺組共有290 個差異表達蛋白；利奈唑胺組共有222 個差異表達蛋白，主要涉及上調rpmJ、rplE 等蛋白質生物合成相關蛋白，下調SasG、luxS、ald1、D-丙氨酸氨基轉移酶等蛋白?？堤孢虬?、利奈唑胺處理后均降低sasG、群體感應系統(tǒng)luxS、ald1及D-丙氨酸氨基轉移酶表達。生物被膜形成的第一過程是黏附，研究表明，表面蛋白SasG 不斷聚集能夠增加黏附細胞數(shù)量，從而促進生物被膜形成。攜帶SasG可促進細菌與鱗狀鼻上皮細胞結合，從而促進細菌鼻腔定植［12］。ROCHE 等［13］研究顯示，感染金黃色葡萄球菌患者血清SasG 蛋白抗體水平比未感染人群高。群體感應系統(tǒng)是微生物的通信系統(tǒng)，可因細菌群體密度改變而導致生理和代謝活動改變［14］。LuxS能夠通過抑制金黃色葡萄球菌中轉錄因子Rbf 及細菌多糖細胞間黏附抑制細菌生物被膜的形成［15-16］。肽聚糖存在于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁中，ald1 為肽聚糖層的重要成分。藥物壓力下降低ald1，可能在細胞壁的合成中發(fā)揮作用。丙氨酸氨基轉移酶是一種參與蛋白質代謝的酶，D-丙氨酸氨基轉移酶能夠通過催化α-酮酸，在維持細胞壁穩(wěn)定性中發(fā)揮作用［17］。此外，康替唑胺、利奈唑胺處理金黃色葡萄球菌上調了rpmJ、rplE 等蛋白質生物合成相關蛋白，推測其原因為細菌處于應激狀態(tài)時為了應對外界環(huán)境的變化，從而加速核糖體合成，因而蛋白質合成增加［18］。GO注釋分析顯示，兩種藥物的差異表達蛋白均與氨基酸代謝過程有關。細菌的生命活動、生物被膜形成離不開氨基酸代謝過程，當外界環(huán)境發(fā)生變化時，氨基酸代謝過程快速對此做出應答［19］。由上可見，康替唑胺及利奈唑胺可能通過抑制初級代謝相關過程、生物被膜形成相關基因及群體感應系統(tǒng)抑制細菌生物被膜形成，但是作用的具體靶點還需進一步探究。

綜上所述，惡唑烷酮類抗生素康替唑胺、利奈唑胺對常見革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、糞腸球菌表現(xiàn)出廣譜抗菌活性，在亞抑菌濃度下可有效降低細菌生物被膜形成且減少已形成生物被膜中的細菌。通過生物被膜蛋白質組學分析顯示，兩種抗生素均對群體感性系統(tǒng)、氨基酸代謝及核糖體等代謝途徑產(chǎn)生影響。通過對康替唑胺、利奈唑胺抗菌活性及生物被膜抑制作用的研究，可為臨床抗生素的選擇提供指導，對清除頑固生物被膜從而減少臨床感染具有重要意義。