宋曉朋, 孔子明

(1.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 河南 駐馬店 463000; 2.遂平縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 河南 遂平 463100)

小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一,選育和推廣高產(chǎn)、多抗、高效的小麥品種對(duì)保障國(guó)家糧食安全具有重要作用。傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)育種主要對(duì)小麥主要目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇,以達(dá)到聚合目標(biāo)性狀優(yōu)異等位基因[1],進(jìn)而選育出符合育種目標(biāo)的品種,這種育種方式是當(dāng)前小麥品種選育的主要手段,但這種育種手段易受到育種家的經(jīng)驗(yàn)和環(huán)境條件的影響,新品種的選育效率較低、育種周期長(zhǎng)[2]。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,小麥分子標(biāo)記輔助育種越來越受到育種家的重視[3]。功能標(biāo)記是依據(jù)與表型性狀相關(guān)的功能基因的等位變異開發(fā)的分子標(biāo)記,是小麥分子標(biāo)記輔助育種的理想標(biāo)記[4]。Liu等[5]對(duì)小麥農(nóng)藝性狀、抗逆性等的功能標(biāo)記進(jìn)行了總結(jié),為小麥分子標(biāo)記輔助選擇與常規(guī)育種結(jié)合提供了途徑。

競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allel-Specific PCR,KASP)是一種利用熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)基因組中特定位點(diǎn)進(jìn)行雙等位基因監(jiān)測(cè)的基因分型技術(shù),已經(jīng)用于小麥種質(zhì)資源的鑒定[6]。Rasheed等[7]對(duì)70個(gè)與小麥性狀相關(guān)KASP標(biāo)記進(jìn)行了驗(yàn)證,分子標(biāo)記檢測(cè)效率得到了極大提高,為分子標(biāo)記輔助育種和種質(zhì)資源的鑒定提供參考。張維軍等[8]利用粒重基因相關(guān)的KASP標(biāo)記對(duì)寧夏灌區(qū)小麥種質(zhì)的粒重進(jìn)行檢測(cè),篩選出聚合多個(gè)基因的優(yōu)異單位型的種質(zhì);權(quán)有娟等[9]通過KASP標(biāo)記對(duì)青海和西藏小麥種質(zhì)的光周期基因進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)光周期不敏感型在小麥品種中占主導(dǎo)地位;王志偉等[10]利用株高和粒重相關(guān)的KASP標(biāo)記對(duì)云南小麥種質(zhì)進(jìn)行篩選,鑒定含有目標(biāo)基因的優(yōu)異種質(zhì);張穎君等[11]對(duì)336份小麥種質(zhì)材料的抗赤霉病基因進(jìn)行KASP標(biāo)記監(jiān)測(cè),發(fā)掘攜帶Fhb1基因的材料,為黃淮冬麥區(qū)抗赤霉病育種提供參考。前期課題組保存了一批農(nóng)藝性狀較好的核心育種材料,但對(duì)這些品種攜帶的重要性狀的功能基因還不清楚,為提高育成品系中優(yōu)異等位基因的比例,本研究利用與小麥重要性狀相關(guān)的KASP標(biāo)記對(duì)育種親本進(jìn)行檢測(cè),明確育種材料中相關(guān)功能基因的單倍型的比例,為進(jìn)一步利用材料和分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試的107份小麥品種(系)為本課題組收集保存的小麥育種親本,其中陜西育成的品種(系)71份,其他地方(河南、山東、河北、江蘇)育成的品種(系)為36份,參試品種(系)的信息詳見表1。

表1 供試材料名稱及來源

1.2 KASP標(biāo)記檢測(cè)

參試材料于三葉期進(jìn)行采樣,采用CTAB法提取葉片DNA[12],DNA質(zhì)量控制通過Nanodrop One檢測(cè)完成。相關(guān)性狀功能基因包括2個(gè)株高相關(guān)基因(Rht-B1、Rht-D2),3個(gè)光周期基因(Ppd-A1、Ppd-B1和Ppd-D1),4個(gè)春化基因(Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1、VRN-B3),3個(gè)早熟基因(TaELF3-B1、TaElf3-D1、TaMOT1-D1),1BL/1RS易位系,12個(gè)籽粒性狀相關(guān)基因(TaCwi-A1、TaCKX-D1、TaGASR7-A1、TaSus1-7A、TaSus1-7B、TaSus2-2A、TaSus2-2B、TaGS-D1、TaGS5-A1、TaGW2-6A、TaGW2-6B、TaTGW6-4A),4個(gè)穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因(TaPHS1、TaMFT-A1、Vp-B1、TaSdr-B1),7個(gè)抗旱相關(guān)基因(CWI-4A、CWI-5D、TaMoc-A1、TaSST-A2、TaSST-D1、Dreb-B1、1-feh-w3),14個(gè)抗病蟲基因(Fhb1、Cre8、Rlnn1、Pch1、Sr2、Sr36、Lr9、Lr14a、Lr21、Lr34、Lr47、Lr67、Sbm1、Tsn1)。KASP標(biāo)記檢測(cè)程序參考Rasheed等[7]設(shè)計(jì)的流程,標(biāo)記檢測(cè)由西北農(nóng)林科技大學(xué)完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)材料基因分型結(jié)果的統(tǒng)計(jì)用Excel軟件和Origin2018軟件完成,聚類圖采用類平均法(UPGMA)進(jìn)行繪制并在iTOL網(wǎng)站進(jìn)行優(yōu)化處理。

2 結(jié)果分析

2.1 適應(yīng)性相關(guān)基因的檢測(cè)

在株高相關(guān)基因檢測(cè)中,主要對(duì)主效株高基因Rht-B1和Rht-D1進(jìn)行KASP標(biāo)記檢測(cè),供試材料中攜帶2個(gè)矮稈基因的優(yōu)勢(shì)單倍型分別有58份和76份,其中Rht-B1矮稈單倍型在陜西育成材料中比例較低,Rht-D1矮稈單倍型在陜西育成材料中比例較高;光周期和春化基因與小麥的適應(yīng)性密切相關(guān),在光周期基因的KASP標(biāo)記檢測(cè)中,光周期不敏感單倍型Ppd-A1a、Ppd-B1a在供試材料中的比例分別為83.18%和94.39%(圖1),在陜西和其他地方育成的材料中比例較為接近,而供試材料全部含有Ppd-D1優(yōu)異等位基因;春化基因Vrn-A1和Vrn-B1晚開花的單倍型在供試材料中占比都達(dá)到了90%以上,Vrn-D1晚開花單倍型在陜西和其他地方育成的材料中比例分別為76.06%和63.89%(表2),Vrn-D1是主要的春化基因;早熟基因中,同時(shí)攜帶3個(gè)早開花基因單倍型在供試材料中只有航麥247和輪選987;小麥品種中攜帶1BL/1RS易位系可以提高品種的適應(yīng)性,供試材料有44份含有1BL/1RS易位系,占41.12%,陜西育成的材料中攜帶1BL/1RS的比例較低。

圖1 供試材料部分KASP標(biāo)記等位基因占比

圖2 107份小麥種質(zhì)基于KASP標(biāo)記的聚類分析結(jié)果

表2 不同地方育成種質(zhì)部分農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的KASP標(biāo)記檢測(cè)

2.2 籽粒性狀相關(guān)基因的檢測(cè)

籽粒大小和千粒重是小麥籽粒產(chǎn)量的重要影響因素,本研究利用12個(gè)與籽粒大小和千粒重相關(guān)的基因?qū)┰嚥牧线M(jìn)行檢測(cè),在供試材料中沒有檢測(cè)到千粒重高的單倍型TaCKX-D1a,而供試材料含有TaSus1-7A、TaGW2-6B和TaTGW6-4A高千粒重單倍型的比例都較高;TaSus1-7B、TaSus2-2A、TaSus2-2B、TaGS-D1、TaGW2-6A在陜西和其他地方育成的材料中高千粒重單倍型的比例相差不大,TaCwi-A1優(yōu)異單倍型的比例在陜西和其他地方育成的材料中占比分別為40.85%和69.44%(表2),差別較大;籽粒大優(yōu)異單倍型TaGASR7-A1-H1c在陜西育成的材料中占比較低,而其他地方的材料都攜帶了這個(gè)基因的優(yōu)異單倍型,TaGS5-A1b優(yōu)異單倍型在陜西和其他地方育成材料中的比例分別為92.96%和69.44%(表2),相差較大。

2.3 抗穗發(fā)芽相關(guān)基因的檢測(cè)

TaPHS1是白粒小麥中的抗穗發(fā)芽基因,供試材料攜帶該基因穗發(fā)芽抗性單倍型的比例為82.24%,在陜西和其他地方育成的品系中抗性比例差別不大。TaMFT-A1、Vp-B1和TaSdr-B1也是小麥穗發(fā)芽抗性基因,這些基因的優(yōu)異單倍型在陜西和其他地方育成材料中的比例都不高,聚合這些優(yōu)異等位基因?qū)π←溈顾氚l(fā)芽品種選育具有重要意義。

2.4 抗旱基因的檢測(cè)

供試材料大多都攜帶抗旱基因CWI-5D和TaSST-A2優(yōu)異單倍型,CWI-4A和TaMoc-A1在干旱情況下能使品種維持較高的穗粒數(shù),CWI-4A優(yōu)異單倍型比例在供試材料中較高,而TaMoc-A1優(yōu)異單倍型的比例較低,這2個(gè)基因優(yōu)異單倍型在陜西育成材料中的比例較低;TaSST-D1和1-feh-w3優(yōu)異單倍型在其他地方育成材料的比例較高,分別為80.56%和47.22%(表2),而陜西育成的材料含有Dreb-B1的比例較高,占29.58%。

2.5 抗病蟲基因的檢測(cè)

Fhb1是小麥赤霉病抗性的主效基因,在供試材料中沒有攜帶赤霉病抗性基因。小麥稈銹病抗性基因Sr2和Sr36在陜西育成的材料都沒有檢測(cè)到,Sr36抗性基因在其他地方育成的材料只有3份,比例偏低?？谷~銹病基因Lr21、Lr34、Lr47、Lr67在供試材料中均沒有檢測(cè)到抗性等位基因,只有4份含有Lr9抗性基因,而Lr14a抗葉銹病基因在陜西育成的材料中的比例較低,僅為15.49%。Sbm1是抗土傳黃花葉病的基因,僅有5份材料攜帶抗性基因,陜西育成材料中攜帶抗褐斑病基因Tsn1的比例較高,達(dá)到85.92%?？购坦孺吣揖€蟲病基因Cre8在供試材料中的比例較低,僅有6份材料攜帶抗性基因,Rlnn1是小麥抗根腐線蟲病基因,在陜西育成材料中的比例較高,占26.76%。

2.6 基于KASP標(biāo)記聚類分析

為了深入了解供試材料之間的親緣關(guān)系,采用功能基因的KASP標(biāo)記對(duì)107份小麥種質(zhì)進(jìn)行聚類,航麥247、輪選987和淮麥22聚為一類,中優(yōu)9507單獨(dú)聚為一類,一些種質(zhì)基于功能基因KASP的遺傳關(guān)系較近,如秦鑫216與小偃22、武農(nóng)36與武農(nóng)3號(hào)等,不同地方選育出的種質(zhì)在聚類的不同分支中均有出現(xiàn),材料之間出現(xiàn)了較強(qiáng)的融合,沒有明顯的分離現(xiàn)象。

3 討 論

小麥1BL/1RS易位系與小麥抗病、抗逆等密切相關(guān),攜帶該1BL/1RS易位系能夠提高小麥品種的產(chǎn)量和增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力,但是對(duì)小麥品質(zhì)性狀有不利的影響,會(huì)使面團(tuán)粘性增大,烘烤品質(zhì)變劣[13]。本研究供試材料中1BL/1RS易位系的比例占41.12%,陜西育成的材料中比例相對(duì)較低,占38.03%,這與本地區(qū)小麥品種選育重視品質(zhì)育種有關(guān)。株高對(duì)小麥產(chǎn)量影響較大,在小麥品種后代選擇中是重要指標(biāo),應(yīng)用矮稈基因降低株高和提高籽粒產(chǎn)量是小麥高產(chǎn)育種的主要育種策略之一[14],本研究中2個(gè)主效矮稈基因Rht-B1和Rht-D1優(yōu)勢(shì)單倍型在陜西和其他地方育成的材料中占比差別較大,對(duì)育成材料影響較大。Vrn-D1是主要的春化基因,在供試材料中多態(tài)性較高。小麥產(chǎn)量性狀可利用的功能標(biāo)記較少,目前主要研究集中于小麥籽粒性狀功能標(biāo)記的開發(fā),本研究中小麥籽粒性狀的KASP標(biāo)記都為微效基因控制,基因效應(yīng)較小,聚合多個(gè)有利基因位點(diǎn)能夠增加粒重。同樣,抗穗發(fā)芽也都是微效基因,本研究中陜西育成的材料中有8份材料聚合了4個(gè)微效穗發(fā)芽抗性基因,可以作為抗穗發(fā)芽的重要親本來源。在抗旱基因檢測(cè)中,大部分材料沒有攜帶多個(gè)抗旱基因,師欒02-1和金禾9123聚合了多個(gè)抗旱基因,這與河北地區(qū)重視抗旱育種有關(guān)[15]。小麥抗病基因可以利用的功能標(biāo)記較少,本研究在多份種質(zhì)中檢測(cè)到Lr14a基因,該基因位于小麥7BL染色體上,可以作為抗葉銹的種質(zhì),但葛潤(rùn)靜等[16]研究發(fā)現(xiàn),該基因已經(jīng)喪失對(duì)葉銹病的抗性。本研究利用功能標(biāo)記對(duì)育種親本進(jìn)行優(yōu)異等位基因的檢測(cè),通過分子標(biāo)記輔助選擇聚合優(yōu)異性狀基因,為品種選育提供依據(jù)。

隨著小麥高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,許多性狀的功能基因得到克隆,功能基因的KASP標(biāo)記數(shù)量逐步增多,但是在小麥分子育種中應(yīng)用還面臨著許多挑戰(zhàn)[17]。本研究利用功能基因的KASP標(biāo)記對(duì)試驗(yàn)種質(zhì)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)部分功能基因標(biāo)記的多態(tài)性較低,不能有效區(qū)分材料,這可能與試驗(yàn)選用的種質(zhì)有關(guān)?；蚓酆鲜切←湻肿佑N的主要策略,本研究中抗病和產(chǎn)量性狀基因較少,隨著小麥基因定位的不斷深入,更多的KASP標(biāo)記加入到分子標(biāo)記輔助育種體系中。篩選出育種價(jià)值較高的功能基因標(biāo)記是小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種的主要程序,使用功能基因KASP標(biāo)記對(duì)育種親本進(jìn)行檢測(cè),明確育種材料中重要性狀的優(yōu)異等位基因分布,通過不同的育種手段將多個(gè)有利等位基因聚合,為后續(xù)實(shí)現(xiàn)常規(guī)育種與分子標(biāo)記輔助育種結(jié)合提供重要參考。