徐宗昌，魯雪莉，魏云沖，孟晨，張夢超，張緣楊，王萌，王菊英，張成省，李義強*

（1. 中國農業(yè)科學院煙草研究所海洋農業(yè)研究中心，山東 青島 266100；2. 青島農業(yè)大學農學院，山東 青島 266109；3. 山西農業(yè)大學農學院，山西 晉中 034100；4. 國家鹽堿地綜合利用技術創(chuàng)新中心，山東 東營 257345；5. 青島市濱海鹽堿地資源挖掘與生物育種重點實驗室，山東 青島 266100）

土壤鹽漬化是制約現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展的世界性難題之一，一般情況下能夠導致作物減產15%～20%，嚴重的甚至絕產［1］。世界范圍內超過100 多個國家的近20%的耕作土地正在遭受土壤鹽漬化的威脅［2］。中國鹽漬化土地面積約有3600 萬hm2，約占全國可利用土地資源的4.88%［3］，是非常重要的后備耕地資源。培育耐鹽作物品種、牧草品種是提高鹽漬化土地利用程度的重要方式。

航天誘變是指利用返回式衛(wèi)星或載人飛船搭載生物材料進入太空環(huán)境，利用外太空微重力、強輻射以及弱地磁等誘導生物材料產生可遺傳變異的一種特殊的誘變育種手段。相較于傳統(tǒng)育種方式動輒10 年起步的育種周期而言，航天誘變新品種育成平均5 年，通常在第3、4 代性狀就開始穩(wěn)定［4］，育種周期大大縮短。因此，自20 世紀60 年代初期，蘇聯(lián)學者開始進行航天誘變研究以來，美國、中國等國家相繼開展了航天誘變育種工作［5-6］。目前，我國的航天育種技術走在世界前列，已經開展了包括農作物、蔬菜、花卉、牧草、中藥材、木本植物等在內的上千個植物材料的誘變工作，育成品種500 多個，累計推廣面積超過13.33 萬hm2［7-10］，極大地豐富了各種作物品種資源和遺傳背景。

野大豆（Glycine soja）是栽培大豆的近緣野生種，起源于中國，在國內各省份分布廣泛。野大豆籽粒營養(yǎng)豐富，富含蛋白質、脂肪以及異黃酮等功能活性物質，藥用食用均可［11］；莖細而軟，粗纖維含量低，青飼時鮮嫩多汁，干草柔軟，是良好的飼草原料［12］；另外，野大豆耐鹽堿能力突出，篩選耐鹽堿的野大豆種質材料進行飼草品種培育或與大豆雜交培育各種耐鹽種質材料在鹽堿地上應用，是踐行“以種適地”鹽堿地綜合利用的有效途徑。

目前，通過航天誘變方式育成的大豆品種已有報道，并指出品質育種應在SP1代開始選擇，產量和高光效育種則分別從SP2和SP3代開始選擇為宜［13］，但尚未見關于野大豆航天誘變材料的相關報道。逆境條件對作物的品質和產量均會產生影響，因此本研究以黃河三角洲地區(qū)野大豆為材料，對航天誘變SP1群體苗期進行鹽脅迫處理，通過多指標綜合分析、主成分分析、隸屬函數(shù)綜合評價等多元統(tǒng)計方法，建立系統(tǒng)的野大豆種質資源耐鹽評價體系，從SP1代開始進行野大豆耐鹽突變材料的鑒定，為優(yōu)異資源發(fā)掘交換、耐鹽機理解析、航天誘變群體耐逆篩選時期以及品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗野大豆材料取自東營黃三角農高區(qū)野外（37°17' N，118°37' E），經單粒傳法［14］獲得遺傳背景相對一致的繁育材料于實驗室內長期保存。濃硫酸處理脫泥膜后，野大豆種子經神舟十二號載人飛船于2021 年6-9 月搭載3 個月后返回地面，獲得野大豆SP1群體。

1.2 試驗設計

于2022 年3 月在中國農業(yè)科學院煙草研究所植物培養(yǎng)間內開展試驗。挑選籽粒大小基本一致的150 粒種子，播種于裝滿蛭石的32 孔育苗盤中（規(guī)格540 mm×280 mm×53 mm），每個穴孔播種1 粒，播種深度1 cm。從育苗盤底部倒入2 L 1/10 MS 營養(yǎng)液，在光周期為16 h 光照，8 h 黑暗，溫度（24±1） ℃，濕度60%的植物培養(yǎng)間進行培養(yǎng)。待80%植株子葉完全展開時，從育苗盤底部加入3 L 150 mmol·L-1NaCl 溶液，使蛭石中鹽溶液處于飽和狀態(tài)。蛭石缺水時，均從育苗盤底部加入過量的150 mmol·L-1NaCl 溶液，以充分淋洗蛭石中的鹽分，使鹽溶液濃度維持穩(wěn)定。試驗過程中NaCl 溶液均使用1/10 MS 營養(yǎng)液配置。

1.3 調查指標

鹽脅迫7 d 后，剔除SP1群體中包括子葉不伸展、無生長點以及植株明顯矮化不再生長的各種突變類型，調查植株株高（7 d plant height， 7PH）、下胚軸長（7 d hypocotyl length， 7HL）和下胚軸粗（7 d hypocotyl diameter，7HD，子葉處）；鹽脅迫21 d 后調查植株株高（21 d plant height， 21PH）、下胚軸長（21 d hypocotyl length， 21HL）、莖粗（21 d stem diameter， 21DD，子葉處）、葉綠素a 含量（content of chlorophyll a， CCA）、葉綠素b 含量（content of chlorophyll b， CCB）、葉面積（leaf area， LA）、單葉鮮重（fresh weight of leaf， FWL）和單葉干重（dry weight of leaf， DWL）等11 個指標。其中葉面積、單葉鮮重和單葉干重調查植株的第一對真葉平均值，真葉使用Canon 5D Mark III（日本）拍照后，用Image J 軟件（https：//imagej. net/software/fiji/，F(xiàn)iji 版）進行面積測量；葉片干鮮重使用萬分之一電子天平稱重。葉綠素a 和葉綠素b 使用植株的第2～4 片真葉包括復葉進行測量，植株生理指標丙二醛（malondialdehyde， MDA）、過氧化物酶（peroxidase， POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和過氧化氫酶（catalase， CAT）的含量使用植株剩余葉片測量。上述指標的測定方法按照薛秀棟等［15］的報道進行，其中葉綠素含量測定使用分光光度計法，MDA 含量測定使用硫代巴比妥比色法，POD 活性測定使用愈創(chuàng)木酚法，SOD 活性測定使用氮藍四唑法，CAT 活性測定使用紫外吸收法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel、SPSS 24.0 等軟件進行平均值、極值、方差、顯著性分析、相關性分析、主成分分析以及聚類分析等多元分析內容。用到的相關公式如下：

式中：U表示隸屬函數(shù)值，Xij表示第i個種質的第j個主成分分值，Xjmax表示第j個主成分的最大值，Xjmin表示第j個主成分的最小值。

式中：權重wj表示第j個主成分的重要程度，pj表示第j個主成分的貢獻率。

式中：D值表示第i個誘變材料在鹽脅迫條件下的耐鹽性綜合評價值，根據(jù)D值將突變體材料劃分為4 個耐鹽等級：0.75≤D≤1.0，高耐鹽；0.50≤D＜0.75，耐鹽；0.25≤D＜0.50，中間型；0≤D＜0.25，不耐鹽。最后，根據(jù)D值采用歐式距離，最短距離法對129 個SP1個體進行聚類。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下野大豆SP1群體苗期各性狀變異分析

苗期11 個性狀的調查結果如表1 所示，各個指標的變異系數(shù)為6.45%～51.78%。在11 個指標中，以21 d 株高、7 d 株高和葉面積3 個指標的變異系數(shù)較大，分別為51.78%，24.96%和24.03%，說明其對鹽脅迫的響應較為靈敏；葉綠素a（6.45%），7 d 下胚軸粗（11.09%）和葉綠素b（11.20%）這3 個指標的變異系數(shù)相對較小，說明鹽脅迫對這些指標的影響較小。

表1 野大豆SP1群體鹽脅迫下各性狀變異統(tǒng)計Table 1 Variation analysis of characters in SP1 population of wild soybean under salt stress

2.2 指標相關性分析

對11 個鹽脅迫下性狀進行相關性分析，結果如表2 所示，7 d 株高與21 d 株高、單葉鮮重和單葉干重呈顯著正相關，與7 d 下胚軸長和葉面積呈極顯著正相關；7 d 下胚軸長與21 d 下胚軸長呈顯著正相關，與7 d 下胚軸粗呈顯著負相關，與單葉鮮重和單葉干重呈極顯著正相關；7 d 下胚軸粗與21 d 莖粗呈極顯著正相關，但與21 d 株高呈極顯著負相關；21 d 株高與21 d 下胚軸長和單葉鮮重呈顯著正相關，與葉綠素b 呈極顯著正相關，但與21 d 莖粗呈極顯著負相關；21 d 下胚軸長與葉面積呈極顯著正相關，與21 d 莖粗呈顯著負相關；21 d 莖粗與葉綠素b 呈顯著正相關，與單葉鮮重和單葉干重呈極顯著負相關；葉綠素a 與單葉鮮重呈極顯著正相關；葉面積與單葉鮮重和單葉干重呈極顯著正相關；單葉鮮重與單葉干重呈極顯著正相關。

表2 野大豆SP1群體鹽脅迫下各個指標相關性分析Table 2 Correlation analysis of each index in SP1 population of wild soybean under salt stress

2.3 主成分分析

對在150 mmol·L-1濃度鹽脅迫下的11 個調查指標進行主成分分析。根據(jù)特征值大于1 和累計貢獻率大于90%的原則，共提取到5 個主成分，各成分的貢獻率分別為36.49%、15.56%、12.36%、16.67%和10.64%，累計貢獻率達到91.72%，可代表11 個單一指標的絕大部分信息。各主成分因子的特征值，對原始指標的載荷矩陣和對表型的貢獻率如表3 所示。主成分因子I 主要與7 d 下胚軸長、21 d 株高和21 d 莖粗等性狀密切相關；主成分因子II 主要與葉綠素b、葉面積和單葉鮮重等密切相關；主成分因子III 主要對7 d 下胚軸粗、21 d 莖粗和葉綠素a 等性狀發(fā)揮作用；主成分因子IV 主要與7 d 株高、7 d 下胚軸長和21 d 下胚軸長等性狀密切相關；而主成分因子V 主要與葉綠素b、單葉鮮重和單葉干重等性狀密切相關。綜上，通過主成分分析將鹽脅迫下野大豆SP1群體的11 個耐鹽相關指標轉換為了5 個獨立的綜合指標，以用于下一步的耐鹽綜合評價分析。

表3 前5 個主成分的特征值及特征向量描述Table 3 Eigen values and eigenvectors of the first five principal components

2.4 耐鹽性綜合評價

根據(jù)不同SP1個體野大豆的主成分值，利用公式1）計算5 個綜合指標的隸屬函數(shù)值，利用公式2）計算各主成分的權重，5 個主成分的權重值分別為0.3978，0.1697，0.1347，0.1817 和0.1160。得到綜合指標的隸屬函數(shù)值和各自權重后，根據(jù)公式3）進一步計算各SP1群體個體的耐鹽性綜合評價指標D值。各材料D值范圍為0.1890～0.8981，綜合評價D值越高代表材料的耐鹽能力越強，根據(jù)評判標準，共鑒定到高耐鹽材料10 份（0.7582≤D≤0.8981），耐鹽材料53 份（0.5031≤D≤0.7451），中間型材料63 份（0.2505≤D≤0.4901）以及3 份不耐鹽材料（0.1890≤D≤0.2340）（表4）。

2.5 聚類分析

利用不同野大豆突變株系耐鹽性評價值D值，根據(jù)最短距離法對129 份野大豆突變株系進行聚類。如圖1 所示，所有供試材料被劃分成了4 類，各亞類較好地對應了野大豆突變株系耐鹽（含高耐鹽）、中間型和不耐鹽4 個耐鹽級別。第I 類包含32 份材料，D值為0.5093～0.8930，其中包含8 份高耐鹽材料和24 份耐鹽材料；第IV 類包含31 份材料，D值為0.3633～0.8981，其中包含2 份高耐鹽材料，2 份中間型材料和27 份耐鹽材料；第III 類包括62份材料，D值為0.2505～0.6373，包含60 份耐鹽性中等的中間型材料和2 份耐鹽材料；第II 類包含4 份材料，D值為0.1890～0.3410，是SP1群體中相對最不耐鹽的材料，包括不耐鹽材料3 份和中間型材料1 份。

圖1 129 份野大豆材料D 值聚類分析Fig.1 D-value cluster of 129 wild soybean materials

2.6 生理指標測定

從不同耐鹽等級材料中各隨機挑選1 份，測定鹽脅迫下葉子MDA 含量和抗氧化酶活性（圖2）。除POD 活性為高耐鹽材料（SP1-29）顯著高于不耐鹽材料（SP1-40）外（圖2D），MDA 含量、SOD 和CAT 活性在四類耐鹽性不同的野大豆突變材料中差異不顯著（圖2A～C），這說明POD 在野大豆航天誘變材料的耐鹽性中發(fā)揮重要作用。

圖2 代表性誘變個體生理指標測定Fig.2 Physiological indexes of representative mutagenic individuals

3 討論

“以種適地”提高鹽堿地產能和利用效率，是綜合利用鹽堿地的有效手段，而獲得良好的耐鹽植物品種是實現(xiàn)這一目標的前提。航天誘變是一種特殊的物理誘變方式，通過后期持續(xù)選育不僅能夠有效獲得性狀穩(wěn)定的遺傳材料，而且還能大幅縮短育種時間［4］。與其他理化誘變類似，誘變方式造成的非致死性遺傳損傷一般都會遺傳給下一代，并且在自交繁殖的過程中逐漸純合。因此航天誘變材料在SP1當代就能夠表現(xiàn)出農藝性狀差異［16］。王瑞珍等［17］研究指出，大豆SP1群體的發(fā)芽率、熟期、株高、單株總莢數(shù)等性狀指標與未經搭載的大豆相比都發(fā)生了顯著變化。本研究統(tǒng)計了鹽脅迫下野大豆SP1群體苗期的11 個指標，變異系數(shù)為6.45%～51.78%，以株高和葉面積為主的農藝性狀變異系數(shù)較大（表1），這說明野大豆SP1群體的確表現(xiàn)出了性狀變異，與前人研究一致。

一般而言，SP2～SP4世代是航天誘變材料后代分離和性狀篩選的主要世代。棉花（Gossypiumspp.）SP3世代纖維品質變異程度大且范圍廣，篩選出的突變體一般都有比較好的產量性狀［18］。大豆SP2代對光合相關性狀如凈光合速率等選擇效率較低，但在SP3和SP4代進行篩選效果則很好［19］。單株有效莢數(shù)、底莢高度、單株粒數(shù)以及節(jié)間長度等性狀在SP2代篩選效果較好，但是對株高和有效節(jié)數(shù)的篩選作用較差［20］。總的來說，大豆航天品質育種應在SP1代開始選擇，產量性狀從SP2代開始選擇為宜，而高光效品種的選擇則從SP3代開始效率較高［13］。雖未見從低代開始進行耐鹽植株篩選的報道，但是對野大豆航天突變材料開展耐鹽評價和耐鹽株系篩選，對后期在高世代誘變群體中進行耐鹽材料的篩選具有指導意義。

國內外相關學者在作物耐鹽評價和篩選方面開展了大量卓有成效的工作，普遍認為鹽脅迫在作物的不同生育時期危害性不同，苗期對鹽脅迫尤為敏感［21］。目前對野大豆耐鹽性的研究多集中在芽期，以適應NaCl 單鹽或者復合鹽溶液濃度為主要方向［22-24］，也有開展鹽脅迫對野大豆苗期單一生理性狀指標如光合相關指標［25］、抗氧化酶活性［23］以及鈉鉀含量和鹽誘導基因表達等影響的相關研究［26］，但是關于野大豆苗期耐鹽性綜合評價方法和耐鹽品系篩選的研究較少［27］。在本研究中，采用主成分分析方法降低測定指標維度，將多個相互關聯(lián)的指標轉化為少數(shù)幾個相互獨立且能最大程度上反映樣本特征的指標，通過主成分隸屬函數(shù)和貢獻率計算每一個株系的耐鹽綜合評價指標D值，建立起的綜合評價體系將對后續(xù)野大豆耐鹽評價起到指導作用。

丙二醛（MDA）是植物細胞膜脂過氧化的主要產物之一，通常用來作為評價脂質過氧化程度的指標［15］。鹽脅迫等逆境脅迫通常會造成植物膜系統(tǒng)損傷，因而MDA 含量也通常用作表示植物遭受逆境損傷的指標。在使用不同濃度NaCl 溶液處理多個野大豆種質材料時，MDA 含量隨鹽濃度的升高逐漸增加［23］，表明MDA 是野大豆鹽脅迫響應的一個指示因子。在野大豆SP1群體中，不耐鹽的突變材料MDA 含量雖與耐鹽材料相比無統(tǒng)計學意義上的顯著差異，但是含量也高于多個耐鹽突變材料（圖2A），這與趙如皓等［25］的研究結果基本一致。另外，抗氧化酶也是植物抵御鹽脅迫的一個重要途徑。在SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶的作用下，由鹽脅迫導致的超氧陰離子被逐漸分解成水和氧氣［28］。在本研究中，鑒定到的不同耐鹽分級的野大豆突變材料，其SOD 和CAT 活性在鹽脅迫下沒有顯著差異（圖2B 和C），但是POD 活性在不耐鹽的株系中較高耐鹽材料顯著降低（圖2D）。而在其他區(qū)域的耐鹽野大豆種質材料中也有類似的現(xiàn)象，即抗鹽能力較強的種質其POD 活性也高［23］，這說明POD 很可能是野大豆響應鹽脅迫的重要途徑。

4 結論

鹽脅迫下野大豆SP1群體農藝性狀變異豐富，株高性狀變異系數(shù)最大。檢測的11 個性狀指標歸為5 個主成分，通過對主成分進行隸屬函數(shù)和權重分析，構建了基于D值的野大豆SP1群體耐鹽綜合評價指標和體系，共篩選出高耐鹽材料10 份，耐鹽材料53 份，中間型材料63 份以及3 份不耐鹽材料。生理指標測定表明POD 在野大豆耐鹽過程中發(fā)揮重要作用。