王 艷,高 原,朱明軍,唐進法,李 彬,王 賀,曹英杰,崔 琳,王小曉,沈 思

心肌缺血再灌注(I/R)損傷是指在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)發(fā)生后,藥物或機械的早期再灌注在挽救缺血心肌的同時,會進一步導(dǎo)致心肌細胞功能障礙和組織損傷[1]。其中,心律失常是心肌I/R損傷的重要臨床表現(xiàn),以室性心律失常最為常見,嚴重者可發(fā)生惡性室性心動過速(ventricular tachycardia,VT)和心室纖顫(ventricular fibrillation,VF),是造成病人猝死的重要原因。細胞內(nèi)鈣超載和心肌能量代謝障礙是誘發(fā)心律失常的重要原因,而Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶在維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)及能量的產(chǎn)生和利用方面起重要作用[2-4]。心肌I/R發(fā)生時Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低,導(dǎo)致心臟電活動的不穩(wěn)定性和傳導(dǎo)異常,增加心律失常發(fā)生率[5-6]。心肌細胞間信號傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是縫隙連接(gap junction,GJ),在心臟電傳導(dǎo)活動中發(fā)揮著重要的作用[7-8]。縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)則是心肌細胞間縫隙連接的主要連接蛋白,在心肌I/R狀態(tài)下其表達含量和自身磷酸化狀態(tài)的改變造成心肌細胞間電脫偶聯(lián),導(dǎo)致電沖動傳導(dǎo)異常和心律失常的發(fā)生和持續(xù)[9-10]。桂枝甘草湯(Guizhi Gancao Decoction,GGD)溫陽益氣,是治療心悸的基礎(chǔ)方,出自漢代張仲景《傷寒論》,原文記載:“發(fā)汗過多,其人叉手自冒心,心下悸,欲得按者,桂枝甘草湯主之”。臨床研究表明,GGD對不同類型心律失常具有較好療效[11-12]?，F(xiàn)有研究提示,GGD能夠通過減輕鈣超載、清除氧自由基、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等機制對I/R心肌具有保護作用[13-14]。本研究通過構(gòu)建大鼠心肌I/R損傷模型,從分子生物學(xué)層面研究GGD通過改善Cx43表達對心肌I/R致心律失常的影響及相關(guān)機制,為其減輕心律失常的臨床治療提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠90只,體質(zhì)量250～300 g,購自河南省實驗動物中心,動物許可證號為SCXK(豫)2017-0001。

1.2 藥品及試劑

GGD浸膏(按照原著藥量比例:即桂枝、甘草按2∶1的比例制備;1 g浸膏相當于9 g生藥)由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。琥珀酸美托洛爾緩釋片(Met)購自阿斯利康制藥有限公司;血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(cTnI)檢測試劑盒(批號:M3U4S6G5BR、78C8ABFAJY)購自Elabscience Biotechnology Co.,Ltd;Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒(批號:TF4X7MBJWY、24NWU56XV9)購自Elabscience Biotechnology Co.,Ltd;大鼠Cx43免疫組化試劑盒(批號:15386-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;Kir2.1多克隆抗體(批號:B7301)、磷酸化Cx43(p-Cx43)多克隆抗體(批號:B7101)購自ImmunoWay Biotechnology Company;辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠二抗(批號:B0101)、HRP標記山羊抗兔二抗(批號:20000258)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(批號:43929)購自GeneTex。

1.3 方法

1.3.1 造模方法

建立大鼠心肌I/R模型[15],末次給藥1 h后,所有大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg,腹腔注射)麻醉后,仰臥位固定,連接PowerLab持續(xù)描記心電圖Ⅱ?qū)?lián)。于頸部正中切開行氣管插管并通過動物呼吸器輔助呼吸,在胸骨左緣第3肋與第4肋間間隙進行開胸手術(shù),暴露心臟,用6-0號帶針縫合線于左前降支(肺動脈圓錐與左心耳交界)處穿線,將一直徑3 mm的乳膠管墊于結(jié)扎線與血管之間,系緊縫合線,進行心肌缺血30 min,然后取出墊扎乳膠管,進行再灌注120 min。對照組只穿線不結(jié)扎。缺血模型成功標準:結(jié)扎部位以下心肌組織變暗、發(fā)紺,心電圖ST段明顯抬高。再灌注模型成功標準:缺血區(qū)心肌發(fā)紺消失、逐漸變紅,抬高的ST段逐漸回落>50%。

1.3.2 分組及給藥方法

將90只大鼠隨機分為對照組、I/R組、GGD低劑量組、GGD高劑量組和美托洛爾組,每組18只。GGD低劑量組、GGD高劑量組分別給予1.8、3.6 g/kg的GGD灌胃,每天1次,連續(xù)14 d;美托洛爾組給予美托洛爾9.5 mg/kg灌胃,每天1次,連續(xù)14 d;對照組及I/R組給予相同體積生理鹽水。因麻醉或手術(shù)失敗導(dǎo)致大鼠意外死亡,各組存活大鼠數(shù)量分別為對照組18只,I/R組、GGD低劑量組、美托洛爾組各15只,GGD高劑量組14只。

1.3.3 心電圖指標及評分方法

觀察再灌注后室性期前收縮(ventricualr premature contraction,VPC)、VT或VF的發(fā)生率和持續(xù)時間,并進行心律失常評分。根據(jù)1984年倫敦Lambeth會議確定的評分標準[16]:0分為無心律失常;1分為持續(xù)時間≤10 s的VT或其他心律失常,無VF;2分為持續(xù)11～30 s的VT或其他心律失常,無VF;3分為持續(xù)31～90 s的VT或其他心律失常,無VF;4分為持續(xù)91～180 s的VT或其他心律失常,和(或)少于10 s的可逆性VF;5分為持續(xù)超過180 s的VT或其他心律失常,和(或)超過10 s的可逆性VF;6分為不可逆性VF。

1.3.4 心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平的測定

采用分光光度法檢測心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量。制備心肌組織勻漿,用考馬斯亮藍和光譜法測定蛋白含量,比色定磷法測定,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶按照試劑盒的說明書進行測定。

1.3.5 血清CK-MB、cTnI水平測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定血清CK-MB、cTnI水平含量。再灌注120 min后腹主動脈取血,靜置30 min后,以2 000 r/min離心15 min(取上清液)。按照ELISA試劑盒步驟測定血清中CK-MB、cTnI含量。

1.3.6 心肌組織的病理學(xué)觀察

HE染色法觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變。再灌注120 min后取出心臟,用冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗。取心肌組織轉(zhuǎn)移至4%甲醛中浸泡,乙醇脫水,石蠟包埋切片(5 μm),用蘇木精-伊紅(HE)染色,在200倍放大鏡下觀察心肌組織的變化。

1.3.7 心肌組織Cx43表達的測定

采用免疫組化法檢測心肌組織Cx43表達。取心肌組織轉(zhuǎn)移至4%甲醛中浸泡,乙醇脫水,石蠟包埋切片(5 μm),脫蠟和抗原修復(fù)后,加3%的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,加一抗(1∶100),加酶標二抗,進行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木精復(fù)染,脫水和封片,鏡檢拍照顯微鏡下觀察。

1.3.8 心肌組織中p-Cx43和Kir2.1的蛋白表達

采用蛋白免疫印跡(Western Blot)法測定心肌組織中p-Cx43和Kir2.1的蛋白表達。提取心肌組織總蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜,用脫脂奶粉封閉后,分別加p-Cx43抗體(1∶1 000)和Kir2.1抗體(1∶1 000),與GAPDH一抗(1∶1 000)平行進行孵育過夜,TBST沖洗,加HRP標記羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)或HRP標記的山羊抗鼠IgG為二抗(1∶2 000),孵育1 h,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光試劑顯色,使用Image J圖像分析軟件分析各蛋白條帶的吸光度,蛋白表達水平以目的蛋白條帶IOD值/GAPDH的IOD值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 GGD對心肌I/R大鼠心律失常的影響

用PowerLab連續(xù)監(jiān)測心電圖(見圖1),分析再灌注期間心電圖的變化,監(jiān)測再灌注后心律失常發(fā)生率、持續(xù)時間和心律失常評分。結(jié)果顯示,對照組大鼠在心電監(jiān)測期間偶發(fā)VPC、手術(shù)時引起的VT,但無VF發(fā)生;其他組大鼠均發(fā)生VPC、VT或VF,且以VT及VF為主。與對照組相比,I/R組VPC次數(shù)明顯增多,VT及VF持續(xù)時間明顯延長,且心律失常評分明顯增高(P<0.01),表明造模成功;與I/R組比較,GGD高劑量組、美托洛爾組VPC的發(fā)生次數(shù)明顯減少,VT及VF的持續(xù)時間明顯縮短,心律失常評分明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

圖1 PowerLab連續(xù)監(jiān)測心電圖示例

表1 各組VPC發(fā)生次數(shù)、心律失常持續(xù)時間、心律失常評分比較

2.2 GGD對心肌I/R損傷大鼠血清CK-MB、cTnI水平的影響

與對照組相比,I/R組大鼠CK-MB、cTnI水平明顯升高(P<0.01);與I/R組相比,GGD低劑量組、GGD高劑量組和美托洛爾組CK-MB、cTnI水平明顯降低(P<0.01)。詳見圖2、圖3。

圖2 各組血清CK-MB水平比較

圖3 各組血清cTnI水平比較

2.3 GGD對心肌I/R損傷大鼠心肌組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶水平影響

與對照組相比,I/R組大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯降低(P<0.01);與I/R組相比,GGD低劑量組、GGD高劑量組和美托洛爾組Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯升高(P<0.05或P<0.01)。詳見圖4、圖5。

圖4 各組心肌組織Na+-K+-ATP酶活性比較

圖5 各組心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較

2.4 GGD對心肌I/R損傷大鼠心肌組織作用的病理學(xué)改變

對照組心肌細胞結(jié)構(gòu)清楚,心肌纖維細胞整齊,未見明顯異常;I/R組心肌細胞排列紊亂,著色不均,心肌纖維腫脹、斷裂;與I/R組比較,GGD低劑量組、GGD高劑量組和美托洛爾組心肌形態(tài)相對整齊,且隨GGD劑量增加,心肌細胞內(nèi)水腫和炎性細胞浸潤明顯減輕。詳見圖6。

圖6 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化(HE染色,×200)

2.5 GGD對心肌I/R損傷大鼠Cx43、p-Cx43和Kir2.1蛋白表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示:對照組可見較多棕黃色Cx43蛋白表達,分布規(guī)律,呈條帶狀;I/R組Cx43表達明顯降低,呈點狀無規(guī)律分布;與I/R組相比,GGD低劑量組、GGD高劑量組和美托洛爾組Cx43表達明顯增多,分布較規(guī)律。詳見圖7。Western Blot結(jié)果顯示:與對照組比較,I/R組p-Cx43和Kir2.1蛋白表達下降(P<0.01);與I/R組比較,GGD高劑量組和美托洛爾組p-Cx43和Kir2.1蛋白表達升高(P<0.05或P<0.01)。詳見圖8。

圖7 免疫組化檢測各組Cx43蛋白表達(×400)

圖8 Western Blot檢測各組心肌組織中p-Cx43和Kir2.1蛋白水平

3 討 論

GGD是張仲景治療心悸的基礎(chǔ)方,臨床報道其具有很好的抗心律失常作用[11-12]。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),GGD不僅能改善多種實驗性心律失常[14,17],還可縮小心肌I/R大鼠心肌梗死面積從而發(fā)揮心肌保護作用,其機制涉及減輕鈣超載、抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡,調(diào)控TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多個方面[13,18]。李冀等[19]發(fā)現(xiàn)桂枝甘草湯提取物30醇組分、水組分能夠抗氯化鋇、烏頭堿及哇巴因等誘發(fā)的心律失常,機制可能與減少心肌細胞L型Ca2+、Na+通道電流及延長心肌細胞動作電位時程(APD)和抑制動作電位幅度(APA)有關(guān)。GGD乙酸乙酯部位的30%乙醇洗脫組分與肉桂酸協(xié)同對小鼠心律失常有一定的保護作用[20]。GGD及各組分含藥血清均有抑制鈣離子通道作用,該作用與鈣離子阻滯劑相同[18]。本研究通過建立大鼠心肌I/R模型,探討GGD對Cx43蛋白表達、Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、Kir2.1蛋白表達的影響。

心肌梗死病人發(fā)生心肌壞死、細胞膜通透性增加,使心肌細胞中CK-MB、cTnI等心肌損傷標志物大量釋放入血,其升高水平與心肌細胞損傷程度關(guān)系密切[21-22]。本研究結(jié)果顯示,I/R組大鼠血清CK-MB和cTnI水平較對照組明顯升高,GGD藥物組血清CK-MB和cTnI水平明顯降低,HE染色結(jié)果也進一步表明GGD藥物組較對照組可減輕心肌損傷程度,提示GGD藥物組可改善大鼠心肌I/R損傷。

心肌I/R致心律失常的發(fā)生機制主要包括氧自由基堆積、鈣超載、能量代謝障礙等幾個方面。Na+-K+-ATP酶又稱鈉泵,其功能為水解ATP酶產(chǎn)生能量逆電化學(xué)梯度跨膜轉(zhuǎn)運Na+和K+,維持細胞內(nèi)外Na+、K+離子濃度梯度,Ca2+-Mg2+-ATP酶即為鈣泵,可跨細胞膜主動將Ca2+轉(zhuǎn)運到細胞外并主動攝取Ca2+從胞質(zhì)中進入肌漿網(wǎng)。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶在維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。當心肌I/R損傷發(fā)生時,心肌細胞能量代謝障礙,ATP生產(chǎn)減少,Na+-K+-ATP酶活力下降,細胞內(nèi)Na+增多,K+減少,激活Na+/Ca2+交換使胞內(nèi)Ca2+濃度增高,同時,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性也下降,不能將胞內(nèi)過多的Ca2+排出或攝入肌漿網(wǎng),導(dǎo)致鈣超載,誘發(fā)心律失常[23-25]。本研究結(jié)果表明,GGD藥物組Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯升高,有利于維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),改善心肌細胞能量代謝,從而達到拮抗心肌缺血再灌注心律失常的作用。

縫隙連接通道分布于心肌細胞閏盤處,主要由3種連接蛋白構(gòu)成,包括Cx40、Cx43、Cx45,其中心室肌的連接蛋白以Cx43為主,其正常表達及分布是保證心肌細胞間電耦聯(lián)活動和協(xié)調(diào)心肌舒縮功能的關(guān)鍵因素[26]。生理狀態(tài)下,Cx43有磷酸化和去磷酸化(Np-Cx43),但僅p-Cx43構(gòu)成有功能的縫隙連接通道[27]。在心肌I/R損傷發(fā)生時,Cx43蛋白將表現(xiàn)脫磷酸化,間隙連接處的結(jié)構(gòu)和功能變化,導(dǎo)致心肌組織阻力增加,導(dǎo)電性降低;間隙連接處的電性斷開,導(dǎo)致電沖動的傳導(dǎo)變慢,電活動合并,最終導(dǎo)致嚴重的室性心律失常。縫隙連接處的結(jié)構(gòu)和功能變化,導(dǎo)致心肌組織阻力增加、電導(dǎo)性降低,出現(xiàn)縫隙連接的電脫耦連現(xiàn)象,導(dǎo)致電沖動傳導(dǎo)變慢和折返性電活動的發(fā)生,最終導(dǎo)致嚴重的室性心律失常[28-29]。IK1的主要組成為Kir2.1,由KCNJ2基因編碼,在維持細胞靜息電位及鉀離子電位平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,是構(gòu)成心肌細胞動作電位復(fù)極末期的主要電流通道之一[27,30]。在心肌缺血再灌注期間,心肌組織Kir2.1蛋白表達下調(diào)引起IK1下降,導(dǎo)致靜息膜電位去極化,延長了動作電位時程,增加了心律失常風(fēng)險[31-32]。本研究結(jié)果表明,I/R組Cx43蛋白的分布明顯降低,p-Cx43和Kir2.1蛋白表達水平下降,GGD高劑量組、低劑量組Cx43表達明顯增多,并在一定程度上逆轉(zhuǎn)了p-Cx43和Kir2.1蛋白表達的下調(diào),這可能是GGD改善心肌I/R心律失常的相關(guān)機制。

綜上所述,GGD可減少VPC的發(fā)生次數(shù),縮短VT及VF的持續(xù)時間,改善心律失常評分,其減輕心律失常的相關(guān)機制可能與改善Cx43的表達和磷酸化狀態(tài)、提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性及上調(diào)Kir2.1蛋白表達水平有關(guān)。通過提高ATP酶的活性,改善細胞能量代謝,維持心肌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),恢復(fù)細胞間縫隙連接蛋白功能與IK1電流,從而縮短動作電位時程與復(fù)極化進程,降低激動傳導(dǎo)速度不均一,消除或減少折返電活動的發(fā)生,達到抑制心律失常的作用。