郭娜娜，孫大永，馬明軒，張翔宇，左彥珍（.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；.承德市中心醫(yī)院放化療中心，河北 承德 067000）

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]，五年生存率不足21.0%[2]，其中非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者占85%[3]。近年來，由于吸煙、空氣污染等一系列因素的影響，肺癌的發(fā)病率還在不斷上升，每年肺癌新增病例占癌癥病例的18.74%[4]，其中首診晚期肺癌的為84%[5]，由于手術(shù)治療的效果欠理想，放化療成為中晚期NSCLC的首選治療手段，聯(lián)合化療是增強(qiáng)治療效果常用的治療方案，但存在毒副作用大、患者不耐受的缺陷，故制定減毒高效的聯(lián)合化療方案迫在眉睫。

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）又稱蛇葡萄素、白蘞素、福建茶素等，是一種二氫黃酮醇類化合物，大量存在于葡萄科蛇葡萄屬植物中，在藤茶中的量可以達(dá)到30%[6]，民間常將其用于治療感冒、咳嗽。既往研究[7-9]表明DMY具有抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)心血管、調(diào)節(jié)血糖、抗炎、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)肝臟等藥理作用?，F(xiàn)有研究[10-14]已證實(shí)：DMY 能夠通過改變細(xì)胞周期蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G2/M 期，抑制肝癌細(xì)胞增殖；通過SP-1 和NF-κB調(diào)節(jié)尿激酶纖溶酶原激活劑抑制人骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，從而降低化療毒副作用；DMY可下調(diào)survivin蛋白的表達(dá)，使已經(jīng)對紫杉醇和阿霉素產(chǎn)生耐藥的卵巢癌細(xì)胞增敏，使卵巢癌細(xì)胞凋亡增加；DMY能有效調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路、NF-κB、p53 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER應(yīng)激）驅(qū)動(dòng)的信號進(jìn)而用于肺癌等癌癥的治療。以上研究結(jié)論提示DMY有望成為低毒高效的化療增敏劑，為抗癌聯(lián)合治療提供新思路。

本研究采用小劑量DMY 和小劑量VP16，初步探究DMY能否作為一種化療增敏劑在體外發(fā)揮增敏VP16 抗肺癌的作用及其機(jī)制，尋找低毒高效的聯(lián)合化療方案，減少化療藥物用量的同時(shí)降低其毒副作用，提高治療效果進(jìn)而改善患者生存質(zhì)量。

1 儀器與試藥

人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞株（天津腫瘤醫(yī)院研究所）、RPMI1640 培養(yǎng)液（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、0.25%胰酶溶液（含EDTA）（Sigma）、PBS緩沖液（HyClone）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）、低速離心機(jī)（Thermo）、corning 培養(yǎng)皿（corning）、培養(yǎng)板（corning）、DMY（純度＞ 99%，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院）、VP16、Tunel凋亡試劑盒（Roche）、倒置熒光顯微鏡、β-actin鼠抗人單克隆抗體（1 : 1000稀釋；華安生物）、Parp 兔抗人多克隆抗體（1 : 1000 稀釋；CST）、Caspase-3 兔抗人多克隆抗體（1 : 1000 稀釋；CST）、Cleaved Caspase-3兔抗人多克隆抗體（1 : 1000稀釋；CST）、Bax 鼠抗人單克隆抗體（1 : 1000 稀釋；Abcam）、山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗（1 : 4000稀釋；Abcam）、RIPA裂解液（上海貝博）。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)取人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞加入含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，置于恒溫37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2天更換一次培養(yǎng)基，PBS清洗，使用0.25%胰酶（含EDTA）消化傳代，取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 檢測DMY對VP16治療A549細(xì)胞生長的影響作用MTT實(shí)驗(yàn)確定單藥給藥濃度及時(shí)間（選取IC20濃度作為增敏單藥濃度），取對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞用0.25%含EDTA胰酶消化制備細(xì)胞懸浮液，按照1×106·皿-1接種細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)35%左右時(shí)，更換為含不同處理因素的培養(yǎng)基：對照組（完全培養(yǎng)基）、DMY 組（含DMY 80 μg·mL-1完全培養(yǎng)基）、VP16組（含VP16 0.06 μg·mL-1完全培養(yǎng)基）、聯(lián)合組（含DMY 80 μg·mL-1+ VP16 0.06 μg·mL-1完全培養(yǎng)基），根據(jù)細(xì)胞生長曲線，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞生長情況。

2.1.3 Tunel實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞凋亡情況取對數(shù)生長期細(xì)胞同上法對細(xì)胞進(jìn)行分組干預(yù)，培養(yǎng)48 h后取出細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，PBS 清洗后加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞1 h（室溫15～25 ℃），PBS漂洗兩次；加入細(xì)胞通透液（0.1% Triton）于冰上反應(yīng)2 min，PBS漂洗2次；加入Tunel反應(yīng)液，37 ℃避光濕盒反應(yīng)1 h，PBS漂洗，DAPI染色處理，在熒光顯微鏡下觀察，封片拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用軟件Image J計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.1.4 Western blot檢測各組相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)采用上述方法對細(xì)胞進(jìn)行分組干預(yù)，培養(yǎng)48 h 后取出細(xì)胞。先用PBS 清洗兩次，加入RIPA 裂解液（上海貝博）置于冰上，待充分裂解后用刮子將細(xì)胞輕輕刮下（要確保每個(gè)位置都刮到），收取裂解液，低溫高速離心機(jī)12 000 r·min-14 ℃離心20 min，將離心后的上清液（注意不能取到細(xì)胞團(tuán)和絮狀物）分裝轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管（蛋白始終放置于冰上，防止降解）。按照BCA 蛋白定量試劑盒說明進(jìn)行定量，按比例加入Loding進(jìn)行蛋白變性。制備12%凝膠，按照30 μg 總蛋白量上樣電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，放入含5%奶粉的盒子里置于搖床上封閉2 h，然后倒掉奶粉，并分別加入稀釋好的一抗，4 ℃過夜孵育（期間確?？贵w充分接觸不能干膜），第2 天取出PVDF 膜，放入含TBST 液的盒子里，置于搖床上洗5 min，反復(fù)3 次，清洗完后按照一抗種屬分別加入二抗，常溫孵育1～2 h，然后取出PVDF 膜，TBST 清洗5 min，反復(fù)3 次，最后進(jìn)行ECL 成像，Quntity One 4.6.2 軟件定量分析條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)多次后統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

2.1.5 藥物協(xié)同作用評估及統(tǒng)計(jì)分析參照金氏公式：Q = Ea+b/（Ea+ Eb-Ea× Eb），評價(jià)分析藥物聯(lián)合作用是否為協(xié)同作用，Ea+b代表合并用藥抑制率，Ea代表單用A 藥的抑制率，Eb代表單用B 藥的抑制率。公式中分子代表實(shí)測合并效應(yīng)，分母代表期望合并效應(yīng)，Q 是實(shí)測效應(yīng)和期望效應(yīng)的比值。Q＜0.85為拮抗，0.85≤Q≤1.15為單純相加，Q ＞ 1.15為協(xié)同作用。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，單因素方差分析和t檢驗(yàn)評估統(tǒng)計(jì)意義，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 DMY增敏VP16對A549細(xì)胞的生長抑制作用各組細(xì)胞干擾作用48 h 后，倒置顯微鏡下觀察可見，對照組細(xì)胞貼壁緊實(shí)，細(xì)胞形態(tài)勻稱，呈長梭形，邊界清楚，表面光滑，折光性強(qiáng)，細(xì)胞融合密度約90%；VP16組細(xì)胞形態(tài)變大，融合密度約80%～90%；DMY組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，融合密度約70%～80%；聯(lián)合用藥組細(xì)胞形態(tài)固縮且不規(guī)則，折光性差，明顯可見大量死亡細(xì)胞及碎片，融合率不足30%。與對照組相比，聯(lián)合組細(xì)胞顯著減少，見圖1。

2.2.2 Tunel 實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示，對照組表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞約占（1.05±0.04）%，DMY 組表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞約占（7.15±0.31）%，VP16 組表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞約占（3.76±0.23）%，聯(lián)合組表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞約占（81.87±0.85）%。聯(lián)合組表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞百分比顯著高于對照組和單獨(dú)用藥組（P＜0.01），細(xì)胞凋亡情況見圖2。

圖2 Tunel實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞凋亡情況Fig 2 Apoptosis of each group by Tunel assay

2.2.3 Western Blot檢測各組細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)水平細(xì)胞培養(yǎng)48 h后Western blot結(jié)果顯示，對照組、DMY組、VP16組和聯(lián)合組β-actin條帶相對均一，證明總蛋白量一致。VP16 組、DMY 組、聯(lián)合組與對照組相比，PARP、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平均有所降低（P＜0.05）；Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)水平VP16組和聯(lián)合組升高（P＜0.05），DMY組無顯著差異。聯(lián)合組與VP16組、DMY組、對照組相比均可見顯著差異（P＜0.01）。Bax蛋白表達(dá)水平VP16組、DMY組與對照組相比變化不大，而聯(lián)合組蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組、VP16組和DMY組（P＜0.01），見圖3。

圖3 Western blot檢測各組PARP、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)Fig 3 Expression of PARP,Bcl-2 and Bax protein in each group by western blot assay

3 討論

3.1 肺癌細(xì)胞選擇依據(jù)

按照病理類型，肺癌分為小細(xì)胞肺癌和NSCLC，其中NSCLC占肺癌總數(shù)的85%左右[15]。由于早期臨床表現(xiàn)不明顯，大部分患者確診時(shí)已發(fā)展為局部晚期或晚期，化療是治療中晚期NSCLC 的主要治療手段[5]，數(shù)據(jù)顯示Ⅲ期肺癌化療愈后率不足30%。探索新的化療方案，為患者減輕毒副作用同時(shí)提高治愈率成為當(dāng)下急需解決的醫(yī)學(xué)問題。

3.2 藥物選擇依據(jù)

目前針對大多數(shù)晚期NSCLC患者的治療方案仍為鉑類化療[16]，VP16 是一種細(xì)胞周期特異性的抗腫瘤藥物，它使細(xì)胞停止于有絲分裂中期，在臨床化療中呈現(xiàn)較嚴(yán)重的骨髓抑制。DMY是一種二氫黃酮醇類化合物，研究顯示存在抗腫瘤作用，并且低毒高效的同時(shí)還有保護(hù)肝臟、降低血脂等作用[11,17-18]。本研究初步探究了DMY聯(lián)合小劑量VP16對A549細(xì)胞的作用及機(jī)制，以明確聯(lián)合DMY 治療方案是否可以通過減少化療藥物的用量達(dá)到減毒高效增敏的治療效果。文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示小劑量VP16毒性作用明顯降低但對腫瘤細(xì)胞的作用也明顯減弱，甚至喪失，因此實(shí)驗(yàn)選取單藥劑量時(shí)，采用了毒副作用低的小劑量藥物濃度（IC20），結(jié)果顯示小劑量DMY和小劑量VP16單藥對肺癌細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用均不顯著，但聯(lián)合用藥作用顯著，協(xié)同作用評估結(jié)果Q ＞1.15，提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用存在協(xié)同作用。

3.3 聯(lián)合作用機(jī)制

細(xì)胞凋亡是在特定時(shí)間中發(fā)生的由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡過程，任何細(xì)胞都可以發(fā)生凋亡，所以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的重要方法之一。本研究從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡角度探討了DMY 協(xié)同VP16抗腫瘤作用的機(jī)制。結(jié)果顯示聯(lián)合組細(xì)胞凋亡顯著，DMY 與VP16 聯(lián)合應(yīng)用存在協(xié)同誘導(dǎo)凋亡作用。線粒體凋亡是重要的凋亡途徑，是線粒體介導(dǎo)的內(nèi)部凋亡通路，內(nèi)外部刺激均可啟動(dòng)此通路，通路啟動(dòng)后，應(yīng)激和DNA 損傷等促進(jìn)Bax 等凋亡因子通過調(diào)控線粒體膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素C 釋放入胞液中，觸發(fā)一系列凋亡活動(dòng)，Caspase-3 位于細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游，是凋亡級聯(lián)反應(yīng)的執(zhí)行因子，細(xì)胞色素C 釋放后經(jīng)過一系列作用會(huì)將Caspase-3 激活成Cleaved Caspase-3，使細(xì)胞修復(fù)和細(xì)胞周期相關(guān)的酶失活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18-20]；PARP 是一類蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，以高濃度存在于真核細(xì)胞中，對于正?；駾NA 輕度受損的細(xì)胞，PARP 幫助修復(fù)DNA維持基因組穩(wěn)定，但這一過程是大量消耗ATP 的過程，當(dāng)DNA損傷過強(qiáng)時(shí)，PARP大量被激活成Cleaved PARP，ATP 耗竭，細(xì)胞最終死亡[21]，同時(shí)Cleaved Caspase-3 可使PARP 分裂而失去活性，從而抑制DNA修復(fù)，使細(xì)胞凋亡[22]。因此本研究選取Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、Bax、PARP、Caspase-3 作為檢測指標(biāo)，進(jìn)而檢測聯(lián)合用藥作用機(jī)制，Western blot 結(jié)果顯示聯(lián)合組與其他組相比，Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量顯著增加，PARP、Caspase-3 蛋白表達(dá)下降，提示DMY 增強(qiáng)VP16 抗肺癌A549細(xì)胞的作用與誘導(dǎo)線粒體途徑凋亡有關(guān)。

綜上，本研究顯示小劑量VP16 及DMY 對A549細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用均不顯著，但兩藥聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生協(xié)同作用，抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用顯著增加，進(jìn)一步的研究顯示其機(jī)制與上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，增強(qiáng)Caspase-3和PARP蛋白活化誘發(fā)的一系列線粒體凋亡密切相關(guān)。但是DMY 是否可與VP16 一起協(xié)同抑制A549 細(xì)胞的遷移侵襲及其在體內(nèi)的作用尚未探究，后續(xù)筆者將進(jìn)一步研究，為開發(fā)我國減毒增效抗癌植物新藥以及肺癌聯(lián)合化療新方案提供參考。