王鈺瑤，張 婧，易卓林，趙 海，馬 懿

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000；2.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都 610041；3.成都海關(guān)技術(shù)中心，四川成都 610041）

人類利用發(fā)酵技術(shù)對食品進(jìn)行保藏和加工的歷史記載數(shù)不勝數(shù)，發(fā)酵工藝和飲食文化也因?yàn)樽匀画h(huán)境、地理位置和風(fēng)俗文化而有所異同。傳統(tǒng)發(fā)酵食品如白酒、醬油、泡菜等深受大眾喜愛，在眾人的飲食習(xí)慣中占有重要地位[1-2]。這些傳統(tǒng)發(fā)酵食品的制作與微生物各種代謝途徑和復(fù)雜的酶催化有著密切的聯(lián)系，賦予了發(fā)酵食品各式各樣獨(dú)特的風(fēng)味特點(diǎn)。不同的發(fā)酵食品中的微生物群落組成不同，其產(chǎn)生的功能酶系也不同。早期，研究者一般通過分離粗酶的方式去研究傳統(tǒng)食品發(fā)酵過程中的功能酶系，確認(rèn)了它們的重要貢獻(xiàn)。如曲霉的蛋白酶和糖化酶在發(fā)酵過程中直接影響著醬油品質(zhì)[3-4]；酵母菌產(chǎn)生系列脂酶等酶系促進(jìn)白酒特殊風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[5]。然而這種方法研究能獲得的信息有限。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，人們獲得了更多關(guān)于發(fā)酵食品中的核心微生物菌落構(gòu)成，初步解析群體微生物在發(fā)酵過程中的關(guān)鍵的代謝通路和功能酶系，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品風(fēng)味物質(zhì)的合成和代謝提供理論依據(jù)。目前，常見功能酶系研究的高通量檢測手段包括16S rRNA 擴(kuò)增子分析、宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白質(zhì)組分析，為深入解析發(fā)酵食品的潛在分子機(jī)制提供重要技術(shù)支持[6]。本文總結(jié)回顧了近年來傳統(tǒng)研究方法和高通量測序技術(shù)對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中功能酶系的預(yù)測和分析應(yīng)用研究，為提升發(fā)酵食品工藝和產(chǎn)品品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 傳統(tǒng)研究方法

1.1 粗酶液分析法

在食品發(fā)酵過程中微生物通過產(chǎn)生大量功能酶，催化了一系列復(fù)雜風(fēng)味化合物的產(chǎn)生。早期，研究者直接通過生化方法分離獲得發(fā)酵過程中產(chǎn)生的粗酶液，并研究了其中一大類酶的酶學(xué)性質(zhì)。孫冰玉等[7]通過研究不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵腐乳的粗酶液的酶活，在發(fā)酵前期腐乳坯階段蛋白酶中的堿性蛋白酶活力高，在發(fā)酵后期成品階段中性蛋白酶酶活力更高，而谷氨酰胺酶在前期顯著上升而在后期保持恒定。Tian 等[8-9]用不同提取液獲取醬油豆曲中粗酶，研究了其中的蛋白酶、淀粉酶、氨基肽酶等關(guān)鍵酶系，結(jié)果表明用蒸餾水代替緩沖液提取粗酶的酶活更簡便，且酶活大部分無明顯差異，同時(shí)，也表明醬油的鮮味與米曲霉的碳水化合物降解酶的活性呈正相關(guān)。王奕博等[10]對淡豆豉前發(fā)酵過程進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶、纖維素酶活力總體呈上升趨勢，堿性蛋白酶、脂肪酶活力先上升后下降，因此可將蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶的活力變化作為淡豆豉發(fā)酵過程進(jìn)行控制的酶指標(biāo)。粗酶液分析能直接、簡便、真實(shí)反映發(fā)酵食品在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的功能酶，通過對其中各種酶類的分析初步評估發(fā)酵食品的品質(zhì)和風(fēng)味。但是該方法研究的酶系數(shù)量有限，只能分析如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等同種功能酶的綜合作用，具體酶功能及代謝參與研究不深入，獲取的信息相對較少。

1.2 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)

傳統(tǒng)分離培養(yǎng)是指先分離純化發(fā)酵食品中的產(chǎn)酶菌株，然后解析菌株產(chǎn)生的功能酶系。該方法通常利用選擇培養(yǎng)基篩選能產(chǎn)生功能酶分解特定底物的微生物，然后對該菌株產(chǎn)生的粗酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析。周婉婷等[11]從豆豉中篩選出高產(chǎn)蛋白酶活菌株B3，確定了B3 菌株中與豆豉發(fā)酵關(guān)鍵增鮮脫苦風(fēng)味酶相關(guān)的功能基因及其編碼的蛋白酶和肽酶。劉學(xué)等[12]從濃香大曲中篩選出1 株產(chǎn)甘露聚糖酶的嗜熱小孢根霉菌HBFH10，然后克隆這個(gè)新型甘露聚糖酶基因，并在畢赤酵母中異源表達(dá)后獲得重組酶RmMan134。隨后用重組酶液處理果漿，提高了多種果汁的澄清度，證實(shí)該甘露聚糖酶在果汁加工中具有較好的應(yīng)用前景。

此外，在蘋果醋[13]、四川豆瓣醬[14]、清香型大曲[15]等其他發(fā)酵食品的研究中，大量研究者通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法分離各種產(chǎn)酶微生物，確認(rèn)了乙醇脫氫酶、蛋白酶等功能酶系在食品發(fā)酵中的重要作用以及動(dòng)態(tài)變化（詳見表1）。該方法能夠從傳統(tǒng)的發(fā)酵食品中挖掘到特定的酶系，但對于不可培養(yǎng)的微生物而言，該方法存在缺陷導(dǎo)致無法獲得目的酶基因。因此，為了更精準(zhǔn)解析功能酶的具體作用，以及分析難以通過微生物純培養(yǎng)獲取的功能酶價(jià)值，在研究中，需要采用一些能直接獲得酶基因并進(jìn)一步進(jìn)行酶功能分析的方法。

表1 近年傳統(tǒng)發(fā)酵食品中功能酶的種類及作用研究概況Table 1 An overview of the types and functions of functional enzymes in traditional fermented foods in recent years

2 高通量測序技術(shù)

2.1 基于16S 和ITS 測序進(jìn)行微生物酶功能預(yù)測

PICRUSt 全稱為Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States，是最早被開發(fā)的基于16S rRNA 基因序列預(yù)測微生物群落和分析微生物功能酶系的方法[29]。該方法將測序獲得的微生物與已公布的物種序列比對，推斷微生物潛在的代謝功能和功能酶系。周亞澳等[30]基于16S 測序結(jié)果利用PICRUSt 軟件對宜昌臘腸中細(xì)菌的基因功能進(jìn)行預(yù)測，并進(jìn)行KEGG 功能注釋，預(yù)測結(jié)果表明細(xì)菌在碳水化合物代謝、多糖生物合成和代謝方面的酶系更為豐富，這些都與乳酸桿菌的相對豐度顯著相關(guān)。熊香元等[31]在米粉發(fā)酵過程中使用PICRUSt 進(jìn)行了酶基因功能預(yù)測，KEGG 分析預(yù)測到與糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等與食品風(fēng)味形成相關(guān)的代謝途徑豐度更高。且活躍酶更多，如異構(gòu)酶中的磷酸甘油酸變位酶、氧化還原酶類中的L-乳酸脫氫酶和水解酶類中的金屬肽酶等。

近期，停止更新的Greengene 數(shù)據(jù)庫限制了PICRUSt 的功能預(yù)測范圍，滿足不了當(dāng)前的研究需求，于是開發(fā)團(tuán)隊(duì)升級了軟件，正式公布了PICRUSt2[32]。升級后的PICRUSt2 將待預(yù)測的OTU 代表序列置于軟件已有的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行物種注釋，使得PICRUSt2 不但可以用于16S 細(xì)菌、古菌的功能預(yù)測，也可以用于18S、ITS 真菌、藻類的功能預(yù)測，這些物種的數(shù)據(jù)庫也在不斷更新。王阿利等[33]基于16S rRNA 測序和ITS1 測序技術(shù)進(jìn)行醬油發(fā)酵體系中的微生物多樣性、群落組成、預(yù)測功能的分析，結(jié)果表明醬油發(fā)酵體系中的細(xì)菌功能主要集中在氨基酸代謝途徑，真菌功能主要集中在由曲霉具有的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等多種復(fù)合酶系參與的脂肪和碳水化合物代謝。這一方法也使用在泡菜[22]、香腸[24]的酶功能預(yù)測中。

PICRUSt 是測序后利用物種注釋匹配至數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能基因預(yù)測，其準(zhǔn)確度一定程度上取決于物種注釋結(jié)果和數(shù)據(jù)庫的相似度。因此，PICRUSt 可以對菌群功能和酶功能進(jìn)行初步預(yù)測，為后續(xù)研究提供大致方向。但是該方法預(yù)測結(jié)果不能真實(shí)反應(yīng)發(fā)酵過程功能酶系的變化趨勢，預(yù)測結(jié)果與實(shí)際酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況存在較大差別。

2.2 宏基因組測序分析

宏基因組學(xué)是指特定環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，其中包括可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物[34]。該方法繞過菌種分離純培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)從DNA 水平直接地獲得元基因組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地分析發(fā)酵食品微生物的代謝、群落之間的相互作用及對環(huán)境的反應(yīng)機(jī)制。

在白酒釀造中，利用宏基因組學(xué)技術(shù)手段研究對發(fā)酵過程中的酶系進(jìn)行分析和預(yù)測。如Zhang等[35]對濃香型大曲發(fā)酵過程進(jìn)行宏基因組測序，并對其中40.66%的個(gè)體特征進(jìn)行了分類和注釋，KEGG注釋及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析，表明淀粉酶活性與許多碳代謝相關(guān)途徑呈正相關(guān)，其中α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶豐度最高，這些功能酶信息為提高和穩(wěn)定大曲質(zhì)量提供了理論依據(jù)。此外，Yang 等[36]將中溫大曲發(fā)酵過程的宏基因組測序結(jié)果也進(jìn)行KEGG 分析，獲得了注釋代謝途徑和酶的絕對標(biāo)準(zhǔn)化豐度列表，可視化了發(fā)酵過程中主要微生物分類群與特定功能酶之間的相互聯(lián)系，其中推測阿魏酸羧酸裂解酶有助于風(fēng)味物質(zhì)的形成與積累。

除此以外，在其他如羊肉香腸[23]、酸魚[25]、醋[21]、普洱茶[27-28]、其他發(fā)酵酒[19-20,37]等發(fā)酵食品的研究中也有研究者使用宏基因組學(xué)分析了發(fā)酵過程中功能酶系，基于功能酶的動(dòng)態(tài)變化或?qū)︼L(fēng)味物質(zhì)的影響來對這些發(fā)酵食品的發(fā)酵工藝進(jìn)行指導(dǎo)。基于功能酶基因注釋，宏基因組檢測也可以解析產(chǎn)品某些特性，如有助于風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的功能基因簇和途徑。此技術(shù)對認(rèn)識和利用95%以上的未培養(yǎng)微生物提供了一條有效的途徑。總體而言，宏基因組更偏向于定性分析，相較其它測序方法能獲取更廣的功能酶信息，但是無法真實(shí)反應(yīng)微生物的功能酶系的活躍狀態(tài)。

2.3 宏轉(zhuǎn)錄組測序分析

基于DNA 的分析方法不能區(qū)分微生物的生存狀態(tài)。存在于發(fā)酵原料中，不論死或者活微生物的DNA，在整個(gè)發(fā)酵過程中都長期穩(wěn)定存在（且可擴(kuò)增）。因此，需要利用另一種技術(shù)方法來確保檢測到的微生物是存活且具有代謝活性的。

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指特定時(shí)期的環(huán)境樣本或組織樣本中所有的微生物的RNA 的集合。以所得全部RNA為研究對象進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組測序。這種技術(shù)具有宏基因組技術(shù)的許多優(yōu)點(diǎn)，還能檢測環(huán)境中的活性微生物與轉(zhuǎn)錄本并對活性功能進(jìn)行分析，進(jìn)而比較不同環(huán)境下的差異表達(dá)基因和差異功能途徑，對研究發(fā)酵食品的微生物及其產(chǎn)酶特性具有更深的分析深度[38-39]。

如今宏轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)廣泛被應(yīng)用來檢測各種傳統(tǒng)食品（如泡菜[40-41]、鎮(zhèn)江香醋[21]、和各種香型白酒[42-43]等）發(fā)酵過程中微生物和酶系的多樣性，為功能菌株的篩選和分離、風(fēng)味酶的表達(dá)和表征提供了有價(jià)值的參考（見表1）。Zhao 等[44]采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)對四川工業(yè)蘿卜泡菜在發(fā)酵過程中的活躍功能酶基因進(jìn)行KEGG 注釋，隨發(fā)酵時(shí)間增加，代謝途徑相關(guān)基因豐度上升，其中的碳水化合物和氨基酸代謝活躍，這些代謝途徑的豐度增加可能與工業(yè)蘿卜泡菜風(fēng)味形成有關(guān)（糖基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖苷水解酶主導(dǎo)發(fā)酵過程且助于風(fēng)味形成）。Yi 等[45]基于宏轉(zhuǎn)錄組對濃香型白酒大曲宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，存在超過996 種碳水化合物活性酶系，其中表達(dá)最多的糖苷水解酶主要分為纖維素酶、細(xì)胞壁延伸酶、細(xì)胞壁脫支酶和寡糖降解酶，研究它們在降解白酒發(fā)酵中的協(xié)同作用，為優(yōu)化白酒生產(chǎn)和質(zhì)量提供方法。

利用宏轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對傳統(tǒng)食品發(fā)酵過程中的酶系進(jìn)行分析時(shí)，對測序樣品本身RNA 的質(zhì)量有一定的要求。實(shí)際環(huán)境中RNA 穩(wěn)定性不高，如提取的RNA 質(zhì)量相對較低，將對測序結(jié)果產(chǎn)生不利影響，而且這是一個(gè)瞬時(shí)狀態(tài)下生物信息的提取，這也是宏轉(zhuǎn)錄組測序所獲得信息相較宏基因組更少的一個(gè)原因。

2.4 宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析

宏蛋白質(zhì)組學(xué)是通過大規(guī)模地定性和定量分析蛋白質(zhì)，從而分析環(huán)境中的微生物群落的一門學(xué)科。但由于其蛋白提取的復(fù)雜性，目前還處于不斷完善階段。但蛋白水平的研究可用于探索特定時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵過程在蛋白質(zhì)水平上的關(guān)鍵微生物、關(guān)鍵酶、代謝途徑、功能蛋白標(biāo)志物和蛋白質(zhì)相互作用，并增強(qiáng)對生態(tài)系統(tǒng)的理解[46]。宏蛋白質(zhì)組學(xué)可以進(jìn)行微生物群落的一致性、活性和功能分析，能夠提供宏基因組無法獲取的信息。

為了研究多種糖化酶對中國白酒發(fā)酵的協(xié)同作用，Wang 等[47]通過宏蛋白組學(xué)分析鑒定了白酒發(fā)酵時(shí)酒醅中的51 種碳水化合物水解酶，且發(fā)現(xiàn)酒醅中80%的酶來自酒曲。酒曲中的曲霉、根霉和毛霉所產(chǎn)的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶與發(fā)酵過程中的淀粉水解和乙醇生產(chǎn)呈正相關(guān)，是白酒發(fā)酵中與酒精發(fā)酵相關(guān)的關(guān)鍵糖化酶。通過宏蛋白組確定多種糖化酶對白酒發(fā)酵中酒精產(chǎn)量的協(xié)同作用，為后續(xù)添加糖化酶的比例來提高糖化和酒精發(fā)酵的效率提供理論依據(jù)。范偉業(yè)[48]利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對濃香大曲中的功能酶蛋白進(jìn)行組成分析，揭示了濃香大曲中參與氧化還原過程這一生物途徑的酶的數(shù)量最多，與生產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)途徑的酶一樣，都與醬香型白酒的酶類相差甚遠(yuǎn)。此外，也有學(xué)者利用宏蛋白質(zhì)組對清香型白酒大曲[18,49]、醬香型白酒[50-51]及普洱茶[26]中的功能酶系及其作用進(jìn)行了研究分析，具體見表1。

然而宏蛋白質(zhì)組測序由于樣本需要提取后的蛋白達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后才能用于分析，又由于微生物群落的復(fù)雜性和異質(zhì)性，目前宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究構(gòu)建的序列數(shù)據(jù)庫數(shù)量不多。因此，將宏蛋白組用于發(fā)酵食品中酶的研究是一件相對不太成熟的研究方法。不過隨著蛋白質(zhì)組學(xué)被應(yīng)用得越來越多，相信未來蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)建立更多特異性的數(shù)據(jù)庫供給使用，越來越多地用于發(fā)酵食品的研究中。

2.5 多項(xiàng)技術(shù)交叉運(yùn)用

上述多種研究方法由于技術(shù)的差異獲取酶系信息有差異，從粗酶和純培養(yǎng)只能研究少數(shù)幾類酶的性質(zhì)，而后續(xù)發(fā)展的高通量測序技術(shù)能獲取到更龐大的酶基因功能信息，不同的技術(shù)所能獲得的酶信息數(shù)據(jù)數(shù)量差異顯著。如表2 所示，通過擴(kuò)增子測序技術(shù)和基于16S rRNA 數(shù)據(jù)庫的PICRUSt 預(yù)測，在發(fā)酵米粉的15 個(gè)樣中，可能存在1400 余種酶基因，但其預(yù)測結(jié)果與實(shí)際酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況存在較大差別。通過宏基因組，不僅能確認(rèn)功能酶基因的存在，而且發(fā)現(xiàn)數(shù)量還遠(yuǎn)大于基于擴(kuò)增子的預(yù)測分析，如在濃香白酒大曲中發(fā)現(xiàn)265147 個(gè)功能注釋的酶基因，但是該方法難以反應(yīng)微生物功能酶系的活躍狀態(tài)。而宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白組可有效解析發(fā)酵系統(tǒng)中存在的活躍功能酶系，但由于測序樣本提取難度大，測序獲取的數(shù)據(jù)量信息有限，因此相較于宏基因組，宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白組測序后獲取的功能酶量偏少；如通過宏轉(zhuǎn)錄組在醬香型大曲發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)38899 個(gè)基因，其中有230 種碳水化合物活性酶；通過宏蛋白組發(fā)現(xiàn)的數(shù)量更少，在汾酒大曲中僅鑒定成功了122 個(gè)酶蛋白。

表2 不同研究方法在發(fā)酵食品酶系數(shù)量差異對比Table 2 Comparison of the differences in the number of enzymes in fermented foods by different research methods

隨著科技的發(fā)展，如今不再是僅僅尋求單一的手段對傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵過程中微生物酶進(jìn)行研究分析，而是常常多種方法一起使用，從不同角度去獲取生物酶信息并解析其對發(fā)酵的影響。學(xué)者李昊穎[52]利用微生物組分析得到米酒發(fā)酵過程中微生物群落明顯的變化，一些種屬的豐度與發(fā)酵相關(guān)酶活性有較好的正相關(guān)性。宏蛋白組也分析得蛋白主要來源于原料和根霉屬微生物，其中來自根霉的葡萄糖淀粉酶-1 和蛋白酶-2 均在豐度與相關(guān)性上表現(xiàn)出與發(fā)酵過程高度相關(guān)性。后續(xù)在米酒發(fā)酵前添加蛋白酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酸性蛋白酶是米酒糖化酶系的重要組成之一，在米酒初始糖化過程中會(huì)影響其發(fā)酵表現(xiàn)。Chun 等[53]通過結(jié)合宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)對甘讓醬油的發(fā)酵進(jìn)行分析，揭示了蛋白酶、脂肪酶等酶參與發(fā)酵過程重要代謝途徑，如氨基酸代謝、TCA 循環(huán)代謝、脂質(zhì)代謝。當(dāng)多種研究方法共同使用時(shí)，可以得到多個(gè)方面驗(yàn)證后的結(jié)果，進(jìn)行更系統(tǒng)深入地解析發(fā)酵過程。

利用高通量測序技術(shù)對發(fā)酵食品進(jìn)行分析后將獲得大量的功能酶序列，如何將這些基因信息直觀地表達(dá)并進(jìn)行后續(xù)的研究以及應(yīng)用，則需要借助實(shí)驗(yàn)室分子克隆和蛋白質(zhì)工程等技術(shù)。針對生產(chǎn)高效功能酶的未知菌，為了獲取純酶以進(jìn)行后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)分析，利用合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源表達(dá)是一種操作簡單、培養(yǎng)周期短且生產(chǎn)成本較低的有效方法。

Ali、Yi[43]所在的團(tuán)隊(duì)基于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)直接獲取了濃香型大曲中的β-葡聚糖酶和高表達(dá)熱穩(wěn)定的α-淀粉酶基因（NFAmy13A和NFAmy13B），將基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行異源表達(dá)后獲取純酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析研究，證實(shí)了在大曲內(nèi)兩個(gè)淀粉酶基因之間的高效競爭協(xié)同作用。岳曉平等[54]通過對發(fā)酵豆制品樣品進(jìn)行宏基因組測序，從中獲得米曲霉酸性蛋白酶基因pepA，在畢赤酵母GS115 中進(jìn)行異源表達(dá)后，分析重組蛋白酶的酶學(xué)特性，為米曲霉來源的酸性蛋白酶規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

3 結(jié)論與展望

如今種類繁多的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，大多依然保持著傳統(tǒng)的生產(chǎn)技藝，因此保持傳統(tǒng)發(fā)酵食品的特色傳承以及進(jìn)一步優(yōu)化或自動(dòng)化的需求被研究者越發(fā)重視。這些特性的研究、傳承與進(jìn)一步更新都與其中的微生物所產(chǎn)生的酶在發(fā)酵時(shí)參與的各種代謝密切相關(guān)。通過多種技術(shù)手段研究分析，發(fā)現(xiàn)豆制品如醬油、腐乳的發(fā)酵中高酶活力的蛋白酶、谷氨酰胺酶等酶決定了最終發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量與風(fēng)味構(gòu)成。發(fā)酵酒中的碳水化合物代謝途徑中的糖苷水解酶、氨基酸代謝通路的轉(zhuǎn)氨酶和風(fēng)味形成相關(guān)的酯化酶對酒質(zhì)的影響極大。發(fā)酵醋的乙醛脫氫酶的表達(dá)量較高，參與氨基酸代謝的酶基因會(huì)更為活躍。發(fā)酵蔬菜中水解相關(guān)酶類也會(huì)隨著發(fā)酵的進(jìn)展而更加活躍。肉制品的發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生降解生物胺的酶與催化酯合成的酶類如羧基酯酶。普洱此類發(fā)酵茶會(huì)因?yàn)榛钴S的果膠酯酶和木聚糖酶等酶類參與多糖降解及果膠水解代謝而產(chǎn)生醇厚的香氣。然而這些研究所采用的技術(shù)還存在不同的局限性，包括以下幾點(diǎn)：

a.傳統(tǒng)分離培養(yǎng)僅能研究可培養(yǎng)微生物所產(chǎn)生的同種類酶；b.基于16S rRNA 和ITS 測序的PICRUSt 分析預(yù)測所得結(jié)果與實(shí)際酶基因表達(dá)存在差異；c.宏基因組無法區(qū)分微生物功能酶的活躍狀態(tài)；d.宏轉(zhuǎn)錄組的樣品收集難度大；e.宏蛋白組取樣困難且數(shù)據(jù)庫構(gòu)建不完全，在進(jìn)行比對預(yù)測時(shí)信息獲取度低。因此在實(shí)際應(yīng)用中，需要結(jié)合研究目的對使用的技術(shù)進(jìn)行選擇，盡可能采取更多的研究手段才能更準(zhǔn)確地對發(fā)酵食品的發(fā)酵機(jī)理和質(zhì)量控制進(jìn)行研究與探討。最后還可以在高通量技術(shù)分析基礎(chǔ)上，通過異源表達(dá)對傳統(tǒng)食品的具體功能酶進(jìn)行獲取與研究，為從發(fā)酵食品中獲取可工業(yè)化生產(chǎn)的酶制劑提供理論依據(jù)與實(shí)踐基礎(chǔ)。