商能欣 劉翠婷

作者單位：321017浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬金華中醫(yī)院

腸道微生物群是指由細(xì)菌、病毒、真菌和其他影響健康與疾病的微生物組成的復(fù)雜集合體，其中，細(xì)菌占主導(dǎo)地位，是腸道微生物群的主要研究對(duì)象。一百多年前，“乳酸菌之父”伊利亞·梅契尼科夫認(rèn)為：腸道菌群主宰著人類的健康與疾病。嬰兒腸道菌群的建立來(lái)源于母親，母親微生物組中的每一個(gè)細(xì)菌都可能在嬰兒生命早期，轉(zhuǎn)移入腸道內(nèi)成為腸道菌群形成的基礎(chǔ)。人類腸道內(nèi)會(huì)寄生10萬(wàn)億個(gè)細(xì)菌，參與影響機(jī)體大腦、消化和免疫系統(tǒng)等發(fā)育并介導(dǎo)疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，哮喘、代謝性和免疫性疾病等均可能存在一個(gè)胎兒起源并與腸道菌群的早期定植變化存在關(guān)聯(lián)［1-3］。因此，明確嬰兒腸道菌群的初始定植時(shí)間，將有助于我們解密某些成人疾病胎兒起源的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，并進(jìn)一步獲取疾病可能的潛在治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)階段，人類腸道菌群的定植始于產(chǎn)前還是產(chǎn)后仍存在廣泛爭(zhēng)議［4］，尚無(wú)研究進(jìn)行系統(tǒng)梳理與總結(jié)。基于此，本文綜述嬰兒腸道菌群定植時(shí)間的研究現(xiàn)狀，分析其初次定植的時(shí)間傾向，為基于腸道菌群而開(kāi)展的成人疾病胎兒起源研究提供思路與建議。

1 胎兒的物質(zhì)來(lái)源途徑

胎兒的誕生始于受精卵，其后受精卵反復(fù)分裂形成囊胚，囊胚植入子宮壁，并在此發(fā)育成胚胎。胚胎附著于胎盤上，被充滿羊水的羊膜囊包被，在受精8周后發(fā)育為胎兒。胎兒在密閉的羊水中漂浮，通過(guò)臍帶和胎盤與母體進(jìn)行物質(zhì)交換。因此，羊水、臍帶和胎盤作為胎兒的物質(zhì)來(lái)源途徑，與胎兒的聯(lián)系最為密切，此三者的生態(tài)變化可直接影響胎兒。

2 嬰兒早期腸菌定植理論

2.1 “宮內(nèi)菌群定植” 腸道菌群定植于產(chǎn)前 人們普遍認(rèn)為，胎盤具有免疫學(xué)特征，可以阻止菌群進(jìn)入，維持胎兒在宮內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定與安全，因此，“無(wú)菌子宮”理論深入人心。但隨著檢測(cè)技術(shù)的日益革新，部分學(xué)者提出“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)，逐漸打破人們的固有認(rèn)知。

1982年KOVALOVSZKI等［5］通過(guò)培養(yǎng)353個(gè)胎盤發(fā)現(xiàn)，16%的胎盤樣本細(xì)菌培養(yǎng)呈陽(yáng)性，且無(wú)任何絨毛膜羊膜炎的組織學(xué)證據(jù)。還有報(bào)道，屬于孕中期階段的人類胎盤在絨毛膜板內(nèi)可培養(yǎng)出需氧菌和厭氧菌［6］。第2年也有報(bào)道，在人類胎盤中發(fā)現(xiàn)了來(lái)自母親腸道的細(xì)菌DNA，提示生命早期的腸道菌群定植可能是由母體通過(guò)胎盤垂直傳遞給胎兒［7］。

2012年Isolauri團(tuán)隊(duì)利用qPCR技術(shù)在29個(gè)胎盤和羊水樣本中檢測(cè)出細(xì)菌DNA，還發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌DNA與胎兒腸道中先天免疫基因表達(dá)譜的變化相關(guān)［8］。2013年華盛頓大學(xué)微生物學(xué)家Mysorekar和其同事收集195個(gè)人類胎盤，對(duì)胎盤基板進(jìn)行石蠟切片與染色，觀察到近1/3的胎盤攜帶細(xì)菌，且無(wú)明顯的炎癥痕跡，通過(guò)此次觀察MYSOREKAR等［9］認(rèn)為，母親胎盤基板中的細(xì)菌可能是胎兒腸菌宮內(nèi)定植的來(lái)源。2014年Aagaard團(tuán)隊(duì)注意到，新生兒第1周腸道細(xì)菌與母體陰道細(xì)菌并不相似，懷疑腸道菌群的定植可能始于產(chǎn)前，其后他們借助320名產(chǎn)婦的胎盤，在執(zhí)行無(wú)菌和陰性對(duì)照的條件下，通過(guò)基因測(cè)序在部分胎盤中檢測(cè)出細(xì)菌DNA，并提出腸道菌群的初始定植可能始于產(chǎn)前［10］，這一發(fā)現(xiàn)引起人們對(duì)“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)的極大關(guān)注。

近幾年，“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)得到進(jìn)一步發(fā)展。2016年，芬蘭學(xué)者在健康產(chǎn)婦的胎盤、羊水和嬰兒胎糞中檢測(cè)出具有共同特征的微生物群，認(rèn)為細(xì)菌在母體與胎兒之間轉(zhuǎn)移，且腸道菌群的定植可能在產(chǎn)前經(jīng)由胎盤和羊水中不同的微生物群?jiǎn)?dòng)［11］。2018年有研究利用正常妊娠小鼠模型，發(fā)現(xiàn)孕期（E17）胎鼠腸道內(nèi)存在細(xì)菌DNA，且主要來(lái)源于母體胎盤［12］；還有研究招募36對(duì)陰道分娩母嬰和42對(duì)剖宮產(chǎn)母嬰，共收集包括但不限于胎盤、胎膜、羊水和新生兒胎糞在內(nèi)的550個(gè)樣本，通過(guò)陰性對(duì)照排除污染，發(fā)現(xiàn)胎糞、胎盤和胎膜中的細(xì)菌組成與分布高度相似，且大約一半的胎盤細(xì)菌序列與母體陰道、直腸和口腔樣本中的細(xì)菌序列相同［13］。2020年有研究分析了39對(duì)母嬰的羊水、母體糞便、陰道液、母體唾液和首次胎糞，發(fā)現(xiàn)胎糞菌群與羊水菌群表現(xiàn)出更多的共同特征，其結(jié)果認(rèn)為胎糞中菌群成分來(lái)自母體的多個(gè)部位，但羊水內(nèi)細(xì)菌群落貢獻(xiàn)最大［14］。

綜上所述，研究者們?cè)谔何镔|(zhì)來(lái)源途徑的羊水、臍帶和胎盤中均發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能存在的痕跡，也觀察到嬰兒糞便中微生物群與羊水和胎盤具有某些相似的聯(lián)系，以上發(fā)現(xiàn)在支持“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)的同時(shí)，給“無(wú)菌子宮”觀念帶來(lái)了沖擊。

2.2 “無(wú)菌子宮” 腸道菌群定植于產(chǎn)后 二十世紀(jì)初，法國(guó)兒科醫(yī)生Tissier斷言，人類嬰兒在無(wú)菌環(huán)境中發(fā)育，并在通過(guò)母體產(chǎn)道時(shí)獲得細(xì)菌，此后“無(wú)菌子宮”理論開(kāi)始盛行［15-16］。目前，雖然存在不少研究支持孕期“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)，但2016年有報(bào)道，使用兩種DNA純化方法，通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序和群落分析，卻無(wú)法將人類胎盤樣本與陰性污染對(duì)照的細(xì)菌群落進(jìn)行分離［17］。另有研究調(diào)查了20名足月分娩和20名自發(fā)早產(chǎn)的胎盤樣本，通過(guò)使用兩種測(cè)序方法，均未得出胎盤中存在微生物這一結(jié)論，研究支持健康胎兒的胚胎期發(fā)育是在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行［18］。

2019年劍橋大學(xué)Gordon團(tuán)隊(duì)分析了537名產(chǎn)婦胎盤，通過(guò)使用兩種DNA測(cè)序方法（鳥槍法宏基因組測(cè)序和16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序）及不同制造商的DNA提取試劑盒，發(fā)現(xiàn)健康的胎盤中并不能找到細(xì)菌物種，他們的結(jié)果表明，腸道菌群的最初定植應(yīng)始于產(chǎn)后［19］；同年有研究報(bào)道，對(duì)29個(gè)人類胎盤組織進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，除一個(gè)胎盤組織可能被污染外，其余28個(gè)胎盤組織培養(yǎng)物均未產(chǎn)生細(xì)菌［20］。又一項(xiàng)研究對(duì)胎膜、臍帶和絨毛膜絨毛進(jìn)行采樣，發(fā)現(xiàn)只有在胎盤外才有可能分離出有意義數(shù)量的活細(xì)菌或細(xì)菌DNA，宮內(nèi)細(xì)菌或細(xì)菌DNA的出現(xiàn)與分娩過(guò)程中樣品暴露于污染相關(guān)［21］；還有研究表明，如果去除DNA試劑盒和檢測(cè)試劑的污染，將無(wú)法識(shí)別出獨(dú)特的胎盤微生物群［22］；同年，動(dòng)物（小鼠和猴）實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)和基因測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)胎盤和胎兒組織樣本中存在細(xì)菌定植，研究認(rèn)為接受“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)尚為時(shí)過(guò)早［23-24］。

2021年有研究利用直腸拭子，于剖腹產(chǎn)期間和抗生素使用之前，收集胎兒出生前胎糞，通過(guò)比較陰性對(duì)照和嬰兒糞便發(fā)現(xiàn)，出生前胎糞中并未檢測(cè)到不同于陰性對(duì)照的微生物信號(hào)，該研究認(rèn)為健康足月嬰兒的腸道定植不會(huì)發(fā)生在產(chǎn)前，并且嬰兒胎糞的微生物特征主要反映的是產(chǎn)后獲得的細(xì)菌種群［25］；同年，有報(bào)道通過(guò)經(jīng)腹羊膜穿刺術(shù)，研究360名早產(chǎn)且胎膜完整的嬰兒羊膜腔微生物狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在無(wú)羊膜內(nèi)炎癥的情況下，從羊水樣本中分離出細(xì)菌可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣本受到了污染，而非早期定植或感染［26］；另有報(bào)道對(duì)44名嬰兒的羊水、胎盤和首次胎糞進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)論不支持胎盤或羊水中存在微生物群的觀點(diǎn)，首次胎糞中含有的細(xì)菌跡象似乎是圍產(chǎn)期定植的結(jié)果［27］；還有報(bào)道新生兒胎糞的細(xì)菌含量與未含有任何生物樣本的陰性對(duì)照無(wú)明顯差異，且其細(xì)菌培養(yǎng)也支持這一發(fā)現(xiàn)，該研究表明尚無(wú)法支持“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)［28］。

綜上表明，在嚴(yán)格的取樣和檢測(cè)過(guò)程控制下，“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)飽受爭(zhēng)議，“無(wú)菌子宮”理論仍被認(rèn)可。

3 “宮內(nèi)菌群定植”對(duì)比“無(wú)菌子宮”的研究爭(zhēng)議

“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)的興起，嚴(yán)重考驗(yàn)著“無(wú)菌子宮”理論。雖然研究者已在羊水、胎盤、臍帶血和胎糞中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA［6-8，10-11，13-14］，但仍存在方法學(xué)上的缺陷，削弱著“宮內(nèi)菌群定植”研究結(jié)論的可信度。

“宮內(nèi)菌群定植”研究的現(xiàn)有不足：（1）尚未在胎兒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)活菌：“宮內(nèi)菌群定植”研究中，研究者通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)、分子微生物學(xué)技術(shù)和基因測(cè)序等手段，僅檢測(cè)出細(xì)菌DNA而非活菌［6-8，10-11，13-14］，故缺少更直接且客觀的證據(jù)。有報(bào)道，通過(guò)培養(yǎng)孕期羊水、胎盤及胎糞中的活菌，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照并無(wú)明顯差異［29］。（2）污染：“無(wú)菌子宮”支持者認(rèn)為，羊水、胎盤、臍帶血及胎糞的樣本收集和相關(guān)檢測(cè)中，缺乏對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的污染控制，導(dǎo)致獲取的數(shù)據(jù)難以真正聚焦宮內(nèi)菌群。有報(bào)道，“宮內(nèi)菌群定植”研究中相關(guān)檢測(cè)試劑存在污染［17，22，29］；另有部分研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中缺乏充足的陰性對(duì)照設(shè)置，故其實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有待商榷［7-9］；還有研究檢測(cè)的羊水、胎盤或胎糞樣本是于出生后采集，無(wú)法排除生產(chǎn)過(guò)程及產(chǎn)后菌群定植的可能，故其研究結(jié)論需要謹(jǐn)慎認(rèn)可［6-11，13-14］。（3）方法學(xué)缺陷：“宮內(nèi)菌群定植”相關(guān)研究中，檢測(cè)方法、存儲(chǔ)條件等均存在差異，部分研究?jī)H使用一種方法檢測(cè)樣本中細(xì)菌存在的痕跡，未進(jìn)行二次驗(yàn)證［6-9，13］，這是否存在檢測(cè)偏移？且研究中樣本獲取時(shí)間、獲取方法和保存途徑等亦未統(tǒng)一，致使研究可重復(fù)性欠佳［30］。（4）“低微生物量”樣品挑戰(zhàn)：現(xiàn)有技術(shù)雖可以高度靈敏地?cái)U(kuò)增極微量的DNA，但任何污染都可能超過(guò)僅含有極低微生物量的樣品中的真實(shí)信號(hào)，而胎盤、羊水中細(xì)菌含量較低［10-11，21］，如何避免假陽(yáng)性結(jié)果和污染問(wèn)題，仍值得思考。（5）樣本數(shù)據(jù)：雖然“宮內(nèi)菌群定植”支持者收集了幾百個(gè)研究樣本，但僅有部分研究樣本支持了他們的觀點(diǎn)［6，9-10］，且是否存在批次效應(yīng)有待驗(yàn)證，故“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)還需要更多的多中心、大規(guī)模的相關(guān)研究支持。（6）臨床研究有限：近幾年臨床中，以“宮內(nèi)菌群定植”為結(jié)果的研究，其數(shù)量低于“無(wú)菌子宮”，且這些研究未提供直接的證據(jù)，證明腸道菌群的定植是由母親在孕期垂直傳遞給胎兒。（7）胎兒菌群定植來(lái)源矛盾：“宮內(nèi)菌群定植”研究顯示，胎兒菌群定植的微生物來(lái)源主要與羊水［14］、胎盤［9，12-13］或者羊水與胎盤［11］高度相關(guān)，并未產(chǎn)生統(tǒng)一而明確的結(jié)論，故其實(shí)驗(yàn)結(jié)果有待重復(fù)考證。

4 關(guān)于“宮內(nèi)菌群定植”和“無(wú)菌子宮”的相關(guān)思考

作者發(fā)現(xiàn)“宮內(nèi)菌群定植”面臨著眾多質(zhì)疑，因?yàn)殛P(guān)于細(xì)菌在孕期從母親轉(zhuǎn)移至胎兒腸道內(nèi)的證據(jù)的可靠度尚不清楚。近幾年，較多的臨床研究結(jié)果側(cè)重支持“無(wú)菌子宮”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為腸道菌群的定植應(yīng)該始于出生后［17-20，22，25-28］，但已發(fā)現(xiàn)無(wú)脊椎動(dòng)物中共生菌存在垂直傳播的現(xiàn)象［16，31］，表明母體共生菌傳遞可能是一種古老且具有進(jìn)化優(yōu)勢(shì)的機(jī)制，然而該現(xiàn)象在人類中獲得證實(shí)還存在諸多困難。

如果接受“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)，隨之而來(lái)的問(wèn)題很多：（1）若胎盤、羊水和臍帶血內(nèi)存在細(xì)菌，這些細(xì)菌是否能真正轉(zhuǎn)移至胎兒身上，并進(jìn)入胎兒腸道內(nèi)定植？（2）與健康相關(guān)的菌群組成和功能特征尚未明確［32］，故出生前胎兒接觸細(xì)菌是如何規(guī)避感染？因?yàn)榧韧芯空J(rèn)為，孕期宮內(nèi)細(xì)菌可能代表感染跡象，這些細(xì)菌可激活機(jī)體免疫應(yīng)答，而過(guò)度的免疫炎性反應(yīng)與流產(chǎn)、早產(chǎn)和產(chǎn)后并發(fā)癥等不良結(jié)局相關(guān)，甚至可能增加成年時(shí)慢性疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)［33］。（3）如果腸道菌群的初始定植時(shí)間發(fā)生于產(chǎn)前，那么母體是如何平衡腸道菌群與胎兒間的關(guān)系？Aagaard作為“宮內(nèi)菌群定植”堅(jiān)定的支持者，認(rèn)為胎盤中可能存在微生物，且這些微生物阻止了致病菌在胎兒體內(nèi)的定植，但這種觀點(diǎn)尚需要更多更充分的研究證明。（4）腸道菌群的定植會(huì)對(duì)人類胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生何種影響？其對(duì)健康的胎盤和胎兒是否是必要存在？如果是，腸道菌群又是通過(guò)何種機(jī)制影響胎兒？隨著腸-腦軸、腸-肝軸、腸-肺軸等理論的興起，微生物又是如何調(diào)節(jié)復(fù)雜的妊娠過(guò)程？

“宮內(nèi)菌群定植”假說(shuō)沖擊著生殖及生殖免疫等領(lǐng)域。目前，作者認(rèn)為尚無(wú)法直接肯定得出嬰兒腸道菌群的早期定植時(shí)間，但能明確嬰兒腸道菌群的廣泛定植發(fā)生于產(chǎn)后。近期研究多傾向支持“無(wú)菌子宮”學(xué)說(shuō)，但要證實(shí)孕期宮內(nèi)無(wú)菌也十分困難。明確“宮內(nèi)菌群定植”和“無(wú)菌子宮”正確與否，還需要更多高質(zhì)量和可重復(fù)的臨床研究觀察。

綜上所述，作者建議如需開(kāi)展母嬰腸道菌群與疾病間聯(lián)系的相關(guān)研究，可先立足于腸道菌群代謝產(chǎn)物（可穿過(guò)胎盤屏障），從而避免“宮內(nèi)菌群定植”和“無(wú)菌子宮”的爭(zhēng)議。