王雪竹，伍曄暉，陶喬孝慈，劉建華

（ 1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科技分院，新疆 昌吉 831199 ； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052 ）

禽副黏病毒（avian paramyxovirus，APMVs）是全球禽類感染率最高的重要病毒之一。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，APMVs可在遷移的水禽中呈流行性暴發(fā)，許多APMVs均是在流感病毒的監(jiān)測(cè)過程中被發(fā)現(xiàn)。鴿子、野鴨、雙冠鸕鶿是野生鳥類群體中APMVs的重要宿主之一[1-2]。APMVs發(fā)病率增加嚴(yán)重制約了家禽業(yè)的發(fā)展，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。禽副黏病毒1型（avian paramyxovirus type 1，APMV-1）是APMVs中最具特征的病毒，又稱新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），源自英格蘭的紐卡斯?fàn)柡I市。1926年，NDV首次從印度尼西亞被發(fā)現(xiàn)；1927年，英國(guó)新城堡報(bào)道了NDV[3]。NDV在全球范圍內(nèi)呈地方性暴發(fā)，其傳播速度快，宿主范圍廣，病死率高達(dá)90%[4]，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成一定威脅。禽副黏病毒4型（avian paramyxovirus type 4，APMV-4）1975年首次分離自宰鴨廠[5]。在美國(guó)，APMV-4主要分離自水禽，如野鴨、木鴨、赤膀鴨、環(huán)頸鴨等[6]，且大多是在禽流感的監(jiān)測(cè)過程中被發(fā)現(xiàn)?？蓮膶?shí)驗(yàn)室感染APMV-4 1 d后的SPF雛雞肺、氣管、胰腺及腸部檢測(cè)到該病毒[7]。目前除實(shí)驗(yàn)室感染雞可導(dǎo)致輕度間質(zhì)性肺炎和卡他性氣管炎外，APMV-4感染無明顯的臨床表征[8]。若不能及時(shí)控制APMV-1和APMV-4的流行趨勢(shì)，可能會(huì)造成更大的損失，因此，盡早分離和鑒定病原并進(jìn)行生物學(xué)特性研究迫在眉睫。針對(duì)上述問題，本研究擬對(duì)上述兩種病毒的流行現(xiàn)狀和特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)特性研究，以期為今后臨床預(yù)防APMV-1和APMV-4提供參考。

1 APMV-1/NDV

APMVs屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae family）、禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus genus），其基因組為不分節(jié)段的單股、負(fù)鏈RNA。目前，可通過紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（haemagglutination inhibition，HI）和神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（neuraminidase inhibition，NI）將APMV分為21個(gè)血清型（APMV-1～APMV-21）[9]，各血清型之間的致病潛力也存在很大差異。不同血清型的APMV與禽類物種不同程度的致病性相關(guān)，其中APMV-1是APMVs中最具特征的血清型，能夠在雞群中引起嚴(yán)重的疾病，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

1.1 病原學(xué)

APMV-1基因組結(jié)構(gòu)特征為3'-N-P-M-F-HN-L-5'，可依次編碼產(chǎn)生6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，包括融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）、大聚合酶蛋白（large polymerase protein，L）、基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）、磷蛋白（phosphoprotein，P）和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（hemagglutination-neuraminidase protein，HN）[10]。此外，NDV基因組在3'末端含有55個(gè)核苷酸（nt）前導(dǎo)序列，在5'末端含有114個(gè)nt尾序列。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，NDV的F蛋白是其致病性的重要決定因素之一，對(duì)宿主起到主要保護(hù)作用。流感病毒和NDV毒株在其F蛋白裂解位點(diǎn)含有共有序列R/KR-Q-R/K-R↓F，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)的共有序列是G/E-K/R-Q-G/E-R↓L，蛋白前體F0至F1-F2亞基是NDV感染性的決定因素。因此，F(xiàn)蛋白切割位點(diǎn)的氨基酸序列假定為NDV毒力的主要決定簇。F基因和HN基因在NDV毒力和致病性中起到主要作用。有研究表明，F(xiàn)基因的免疫原性比HN基因更好，并可誘導(dǎo)NDV的無菌免疫感染。F蛋白的切割位點(diǎn)存在谷氨酰胺殘基的保守位點(diǎn)，并且Q114R的突變可導(dǎo)致病毒毒力減弱。此外，病毒的毒力和致病性可通過改變F蛋白調(diào)制糖基化位點(diǎn)。由于NDV在野鴨中普遍呈隱性感染狀態(tài)[11]，且病毒顆粒在水中穩(wěn)定性更強(qiáng)，因此野鴨遷徙也是該病毒遠(yuǎn)距離傳播的途徑之一。

1.2 病毒復(fù)制

APMV進(jìn)入宿主細(xì)胞，通過糖蛋白（F、HN）在病毒表面上的相互作用及其與細(xì)胞表面唾液酸受體的介導(dǎo)結(jié)合，使病毒與宿主細(xì)胞融合。病毒核衣殼進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)，使負(fù)性病毒RNA被轉(zhuǎn)錄，通過病毒編碼的RNA以依賴性RNA聚合酶的梯度方式，使用宿主細(xì)胞機(jī)器翻譯和折疊病毒蛋白產(chǎn)生mRNA結(jié)構(gòu)。一旦達(dá)到N基因mRNA的最佳濃度，則將負(fù)向基因組RNA轉(zhuǎn)化為積極的反基因組模板，用于合成新的負(fù)性RNA基因組。

1.3 流行病學(xué)

雞非典型新城疫一年四季均可發(fā)病，夏季相對(duì)高發(fā)，病雞與帶毒雞均是該病的傳染源。據(jù)調(diào)研分析，多數(shù)發(fā)病雞為免疫雞，但病情較為溫和[12]，不同日齡的雞感染癥狀不同。其中，1～2月齡的雛雞發(fā)病率最高，接種免疫4～15 d后和抗體效價(jià)較低的成年雞群易感；產(chǎn)蛋雞多在產(chǎn)蛋高峰期之前易感[13]。NDV不僅能夠感染雞，也可感染其他禽類，其中火雞最易感，鴨、鵝均易感，但雞的病死率最高。

根據(jù)致病性可將NDV分為3類：輕毒（低毒力）、中毒性（中等毒力）和強(qiáng)毒性（高毒力）。通過氨基酸裂解位點(diǎn)預(yù)測(cè)，可根據(jù)NDV的毒力基因?qū)⑵浞譃槭葍?nèi)臟型和嗜神經(jīng)型等兩種。1996至2005年間，通過對(duì)美國(guó)、丹麥、芬蘭和瑞典陸續(xù)分離的NDV進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)這些毒株均來自同一池塘的野鳥[14]。鴿群也是該病毒傳播的主要媒介之一，帶毒體可通過排便及分泌物大范圍傳播病毒[15]。為更好地防控NDV，世界各地多個(gè)國(guó)家已制定相應(yīng)的免疫程序。

1.4 臨床癥狀

雞新城疫的臨床癥狀差異較大，其嚴(yán)重程度主要取決于感染毒株的毒力、免疫狀態(tài)、抗體效價(jià)、品種日齡、飼養(yǎng)管理水平等因素。感染NDV會(huì)損害雞的特異性免疫系統(tǒng)，雞血紅細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)血凝抑制現(xiàn)象，并抑制細(xì)胞表面產(chǎn)生抗體。雞新城疫可分為典型性和非典型性兩種，根據(jù)臨床癥狀和發(fā)病速度還分為最急性、急性和慢性等3種。一般情況下，自然感染NDV具有3～5 d的潛伏期[16]?；疾‰u常伴隨呼吸癥狀、神經(jīng)癥狀、急性敗血癥及黏膜出血等。發(fā)病初期，患病雞出現(xiàn)精神萎靡、羽毛雜亂、食欲廢絕、飲欲增加、排黃綠色水樣糞便，并伴隨輕微呼吸、神經(jīng)癥狀；后期癥狀加重，體溫升高至43 ℃，流涎、嗉囊積液，雞冠肉髯呈紫紅或紫黑色，產(chǎn)蛋量下降，癱瘓，重者死亡[17]。

1.5 診斷方法

容敏靖等[18]針對(duì)NDV建立結(jié)合TaqMan探針的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-TaqMan-LAMP）快速檢測(cè)方法，驗(yàn)證該方法的特異性、靈敏性和重復(fù)性，并與反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR（RT-dPCR）方法對(duì)比。結(jié)果顯示，研究建立的NDVRT-TaqMan-LAMP檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，能夠有效避免非特異性擴(kuò)增，可用于NDV的精準(zhǔn)檢測(cè)和流行病預(yù)防。王靜靜等[19]針對(duì)國(guó)內(nèi)流行的基因Ⅵ型NDV F基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了RT-dPCR方法，并考察了該方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性。結(jié)果顯示，建立的方法線性關(guān)系良好，靈敏度高，最低檢測(cè)限為1.97 copies/μL；特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。仇薪鑫等[20]建立了1種快速鑒別NDV強(qiáng)弱毒株的RT-PCR診斷方法，對(duì)傳染性法氏囊炎病毒（IBDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）和傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，對(duì)NDV強(qiáng)弱毒株最小RNA檢出量為0.01 mg/L。王通輝等[21]建立了NDV、IBDV和IBV三重RT-PCR檢測(cè)方法，該方法特異性、穩(wěn)定性良好。

ELISA試驗(yàn)分為直接法、間接法、雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法等，間接ELISA試驗(yàn)具有時(shí)效高、便捷等優(yōu)點(diǎn)，適用于大范圍的臨床檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于抗原、抗體的檢測(cè)[22-25]。索南元旦[26]建立了1種快速檢測(cè)NDV抗體的間接ELISA診斷方法,靈敏度為1∶12 800，與血凝抑制試驗(yàn)符合率為96.1%。孟凱等[27]采用商品化NDV ELISA檢測(cè)試劑盒和PCR法對(duì)50份臨床疑似新城疫病料進(jìn)行檢測(cè)，以此驗(yàn)證ELISA檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和優(yōu)缺點(diǎn)。有研究采用原核表達(dá)純化方法獲得建立NDV LaSota株的核衣殼蛋白（NP），將其作為包被抗原建立NDV間接ELISA抗體檢測(cè)方法，該方法的靈敏度是血凝抑制試驗(yàn)的50倍，組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于6%[28]。

1.6 防控

由于我國(guó)尚未研制出適用于本土禽類的APMV-1商品化特效藥，因此防控APMV-1最好的方法即加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，制定科學(xué)合理的免疫程序，定期監(jiān)測(cè)雞群免疫水平。

1.6.1 加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理

日常飼養(yǎng)管理中，保證各階段雞群的營(yíng)養(yǎng)需要，飲水清潔，適當(dāng)通風(fēng)，嚴(yán)格把控飼養(yǎng)密度，調(diào)節(jié)適宜溫度、濕度，建立良好的生物安全體系，定期消毒，避免長(zhǎng)途運(yùn)輸，減少應(yīng)激，對(duì)病死雞和淘汰雞做好分群管理和無害化處理。

1.6.2 制定科學(xué)合理的免疫程序

國(guó)內(nèi)新城疫常用疫苗主要有減毒毒活疫苗如VGGA、LaSota、clone30等基因Ⅱ型疫苗株，主要通過滴鼻、飲水及氣霧的形式進(jìn)行免疫。弱毒苗可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，產(chǎn)生抗體速度快，但抗體效價(jià)較低，而且免疫后易誘發(fā)呼吸道疾病。滅活苗主要是LaSota株和Ⅶd亞型A-Ⅶ株制備的兩種疫苗，雖然免疫抗體效價(jià)較高，但速度抗體生成速度較慢[28]。根據(jù)雞群的品種、年齡，養(yǎng)殖場(chǎng)的規(guī)模條件、飼養(yǎng)管理水平和該地區(qū)APMV-1的流行特點(diǎn)，制定相應(yīng)的免疫程序。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)雞群APMV-1的免疫狀態(tài)和抗體效價(jià)，提高信息化管理水平。首次免疫在孵化后的5～7 d內(nèi)進(jìn)行，采用疫苗滴鼻、點(diǎn)眼的形式；第一次接種15 d后接種第二針疫苗。除滴鼻、點(diǎn)眼外，還可通過飲水的形式給藥，注意疫苗量要增加0.5～1.0倍。第2次免疫接種后25 d內(nèi)進(jìn)行第3次免疫。嘔雞場(chǎng)規(guī)模較小、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件較差，可適時(shí)進(jìn)行第4次免疫。

1.6.3 排除其他疫病的影響

免疫接種能夠在一定程度上保護(hù)雞群，但要避免疫病傳播，就必須采取更嚴(yán)格的措施，如消毒、隔離、封閉等，從而消滅傳染源，切斷傳播途徑。養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)應(yīng)注意排除其他疫病的影響，防止雞群發(fā)生雞馬立克氏病、雞傳染性法氏囊病、雞白痢、雞慢性呼吸道病等。

2 APMV-4

2.1 病原學(xué)

APMV-4屬于副禽腮腺炎病毒屬，電鏡下可觀察到病毒顆粒呈圓形，表面有致密的纖突，內(nèi)部有被囊膜包裹的對(duì)稱螺旋核衣殼[29]。APMV-4基因組大小為15 054 nt，基因組順序?yàn)?'-N-P/V/W-M-F-HN-L-5'，含有6個(gè)非重疊基因，共編碼6種蛋白（F、L、M、N、P和HN）。其中HN蛋白和F蛋白是構(gòu)成病毒囊膜表面纖突的2種結(jié)構(gòu)蛋白，在APMV-4的發(fā)病過程中起到重要的作用。

2.2 流行病學(xué)

全球有8條候鳥遷徙路線，其中有3條途徑中國(guó)，中國(guó)作為候鳥的重要越冬地，有430多種遷徙的候鳥從中國(guó)過境種類，占世界的20%～25%[30]。野鳥遷徙生態(tài)系統(tǒng)被認(rèn)為是APMV-4的主要傳播途徑，野鳥遷徙途中的棲息地是監(jiān)測(cè)野鳥病毒的重要場(chǎng)所。鳥類遷移成為病原體傳播擴(kuò)散潛在威脅，可能影響疾病傳播的動(dòng)態(tài)[31]。為更好地進(jìn)行AMPV-4在全球范圍的傳播、進(jìn)化、分布、生態(tài)學(xué)及流行病學(xué)研究，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)家禽及野生禽類種群的監(jiān)測(cè)。

2.3 臨床癥狀

蛋雞自然感染APMV-4會(huì)出現(xiàn)白殼蛋產(chǎn)量增加的現(xiàn)象，無其他明顯臨床癥狀。實(shí)驗(yàn)室感染APMV-4可導(dǎo)致禽類出現(xiàn)輕度間質(zhì)性肺炎和卡他性氣管炎[7]，癥狀于感染后的5～9 d最明顯，之后逐漸恢復(fù)，且無其他明顯臨床表征。NDV與APMV-2是APMVs中導(dǎo)致禽類發(fā)病的主要血清型，由于APMV-4 F1亞基的N端與NDV強(qiáng)毒株、APMV-2相同，由此推測(cè)APMV-4也存在強(qiáng)致病性的可能[32]。

2.4 檢測(cè)方法

2.4.1 分子生物學(xué)檢測(cè)

APMV-4常用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法有普通PCR、q PCR、RT-PCR等。其中RT-PCR的操作相對(duì)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，在國(guó)內(nèi)外常用于病毒初期感染診斷和病毒的分離鑒定。2008年，Nayak等[33]對(duì)APMV-4鴨/香港/D3/75株的完整基因組進(jìn)行了測(cè)序，并對(duì)含胚雞蛋進(jìn)行檢測(cè)，分析其致病性。2014年，王靜靜等[34]建立了APMV-4熒光RT-PCR檢測(cè)方法。2017年，楊金興等[30]建立了特異性區(qū)分APMV-1和APMV-4的一步法RT-PCR檢測(cè)方法。張慧敏等[7]利用RT-PCR法對(duì)APMV-4新疆分離株的基因組進(jìn)行了擴(kuò)增，并對(duì)該毒株進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。

2.4.2 血清學(xué)檢測(cè)

常用的APMV-4血清學(xué)檢測(cè)方法有HA與HI試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)、間接免疫熒光、免疫組織化學(xué)等。實(shí)驗(yàn)室常用HA-HI試驗(yàn)進(jìn)行病毒的初步鑒定，該試驗(yàn)方法具有操作方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。由于APMV-4感染細(xì)胞不產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變（CPE），HA-HI試驗(yàn)對(duì)于APMV-4病毒滴度的測(cè)定具有重要意義。Alexander等[35]通過HAHI試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)APMV-4分離株與NDV毒株存在低水平的單向交叉反應(yīng)。張慧敏[7]利用HA-HI試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)APMV-1的陽性血清在一定程度上可抑制APMV-4出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，這一試驗(yàn)結(jié)果與Alexander等[35]研究一致。

2.5 防控

通過實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，感染APMV-4并沒有明顯的臨床表征，目前國(guó)內(nèi)用于APMV-4的鑒別診斷技術(shù)甚少，也沒有太深入的研究。我國(guó)尚未研制出適用于本土禽的APMV-4的商品化疫苗與特效藥。

3 禽副黏病毒的生物學(xué)進(jìn)展

反向遺傳學(xué)系統(tǒng)是一種強(qiáng)大的技術(shù)，通過該技術(shù)，感染性病毒可通過克隆DNA產(chǎn)生，并可提供預(yù)期修飾及將其引入病毒基因組。從cDNA克隆中回收重組APMVs，有助于了解更多APMV基因及其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。目前，APMV-1病毒載體已應(yīng)用于疫苗的開發(fā)和研制，APMV-2～APMV-4、APMV-7和APMV-9還可作為減毒病毒載體開發(fā)的候選物[36]。APMV-1和APMV-9對(duì)雞的致病性得以確定[37]，現(xiàn)已深入探討重組NDV的生物學(xué)功能，并單獨(dú)對(duì)其疫苗效價(jià)進(jìn)行審查。有研究顯示，APMV-4中F蛋白切割位點(diǎn)的突變率增加會(huì)促進(jìn)細(xì)胞感染、復(fù)制及形成合胞體。值得注意的是，APMV-7在細(xì)胞培養(yǎng)中不形成合胞體或噬斑，改變?nèi)诤锨懈钗稽c(diǎn)中的單個(gè)氨基酸可增加其細(xì)胞病變。

4 結(jié)論

APMVs是世界各地家禽業(yè)的主要威脅之一，在許多地區(qū)呈地方性感染。特別是APMV-1在鳥類物種間存在不同程度的感染，其毒力和致病性不斷循環(huán)。目前，APMV-1～APMV-4和APMV-7的反向遺傳學(xué)研究為更好的探索其生物學(xué)的意義奠定了研究基礎(chǔ)。但對(duì)于APMVs的生物學(xué)特性、流行率以及其對(duì)感染家禽的實(shí)際影響還有待進(jìn)一步探究。此外，了解不同APMVs的完整基因組序列并調(diào)查流行病學(xué)可為后期疫苗研發(fā)做準(zhǔn)備。